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문제 정의
- 이에 피부 광노화에 대한 각질형성세포 손상을 억제하기 위하여 연잎, 연꽃, 연꽃 수술의 에탄올 추출물 및 물 추출물에 대한 효과를 비교 측정하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 그 후 cell을 원심분리 하여 상층액을 취하고 상층액 중의 1 ㎕를 취해 Bradford's method로 단백질을 정량하였다12). 15 ml cornical tube에 각 농도별 시료를 넣고 0.1 M PPB (pH 7.5), 8.1% SDS, 20% acetate buffer(pH 3.5), 0.8% TBA를 처리하였다. 95℃에서 1 시간 동안 incubation 시킨 후 running water에서 식혔다.
- . HaCaT cell을 1 X 104 cells/well의 밀도로 96 well에 100 ul의 배지와 함께 분주한 뒤 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 배양액을 모두 제거하고, PBS 100 ul를 넣어 UVB 10, 20, 30 mJ/cm2 조사한 후 PBS를 버리고 새로운 PBS로 2번 씻어 준 다음 배양액을 넣어 5시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나기 전에 PBS에 녹인 5 mg/ml MTT를 20 ul씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
- HaCaT 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 시료를 다양한 농도로 처리하고, 24시간 배양한 후에 MTT방법으로 세포의 생존율을 관찰하였다.
- 532 nm에서 상층액의 흡광도를 측정하였다. MDA 농도는 free MDA로 표준선을 구하여 계산하였다.
- UVB 자외선 20 mJ/cm2용량으로 광노화를 유도하고, HaCaT 세포의 생존율이 우수하게 나타난 연꽃 에탄올 추출물과 연꽃 수술 물 추출물에 대하여 LPO 생성에 미치는 영향을 측정하였다.
- 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5 mg/ml MTT를 20 ul씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200 ul를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.
- 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5 mg/ml MTT를 20 ul씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200 ul를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.
- 세포에 UVB 조사하여 세포 성장율을 알아보기 위하여 Mosmann (1983), Kotnik (1990) 등의 방법을 응용하여 MTT test로 실험하였다9,10). HaCaT cell을 1 X 104 cells/well의 밀도로 96 well에 100 ul의 배지와 함께 분주한 뒤 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 배양액을 모두 제거하고, PBS 100 ul를 넣어 UVB 10, 20, 30 mJ/cm2 조사한 후 PBS를 버리고 새로운 PBS로 2번 씻어 준 다음 배양액을 넣어 5시간 동안 배양하였다.
- 연꽃의 다양한 부위를 활용하여 피부 노화를 방지하는 소재를 개발하기 위하여 UVB 자외선 조사에 의한 각질형성세포의 보호효과를 비교하였다. 실험에 사용된 HaCaT 세포는 인간의 앞이마 피부로부터 keratinocyte를 배양한 것으로 피부의 각질형성세포에 해당한다.
대상 데이터
- HaCaT cell은 37℃, 5% CO2의 조건에서 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco Co), 100 ug/ml streptomycin, 100 U/ml penicillin 이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)이 사용되었다.
- 본 실험에 사용한 연잎, 연꽃, 연꽃 수술은 전라남도 무안군에서 채취하여 (주)다연에서 가공한 것을 사용하였다. 실험에 사용한 시약은 일급시약을 사용하였다.
- 연꽃의 다양한 부위를 활용하여 피부 노화를 방지하는 소재를 개발하기 위하여 UVB 자외선 조사에 의한 각질형성세포의 보호효과를 비교하였다. 실험에 사용된 HaCaT 세포는 인간의 앞이마 피부로부터 keratinocyte를 배양한 것으로 피부의 각질형성세포에 해당한다.
- 실험에 사용된 세포주는 HaCaT cell (humankeratinocyte line)로서 (주) 아모레퍼시픽 기술연구원으로부터 분양 받아서 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 연잎, 연꽃, 연꽃 수술은 전라남도 무안군에서 채취하여 (주)다연에서 가공한 것을 사용하였다. 실험에 사용한 시약은 일급시약을 사용하였다.
- MDA의 생성은 지질과산화에 의한 세포 membrane 손상의 지표로 사용된다. 지질과산화 억제 활성을 측정하기 위하여 UVB 조사에 의하여 산화가 용이하게 일어나는 HaCaT 세포의 protein을 분리하여 사용하였다. HaCaT 세포는 UVB 조사에 의한 과산화 지질 생성에 대하여 연꽃 에탄올 추출물 10 μg/ml의 농도에서 MDA가 0.
데이터처리
- 실험성적은 평균치±표준편차 (Mean ± SEM)로 나타내었으며, 대조군과 실험군과의 평균의 차이를 검정할 때에는 one-way ANOVA로 검정하여 P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 그 후 cell을 원심분리 하여 상층액을 취하고 상층액 중의 1 ㎕를 취해 Bradford's method로 단백질을 정량하였다12).
- 시료의 세포 독성 정도를 알아보기 위하여 Mosmann(1983), Kotnik (1990) 등의 방법을 응용하여 MTT test로 실험하였다9,10). HaCaT cell을 1 X 104 cells/well의 밀도로 96 well에 100 ul의 배지와 함께 분주한 뒤, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.
성능/효과
- HaCaT 세포는 UVB 조사에 의한 과산화 지질 생성에 대하여 연꽃 에탄올 추출물 10 μg/ml의 농도에서 MDA가 0.927 nmol/mg protein, 연꽃 수술 물 추출물은 0.962 nmol/mg protein의 순서로 LPO 생성이 감소하여, 연꽃 에탄올 추출물이 가장 우수한 지질과산화 억제 활성이 있음을 확인하였다.
- HaCaT 세포에 UVB 자외선을 각각 10, 20, 30 mJ/cm2 용량별로 조사하여 세포생존율을 측정한 결과 각각 72.79%, 63.06%, 51.69%의 세포 생존율을 보였다. 따라서 UVB 자외선의 용량에 비례하여 HaCaT 세포의 생존율이 감소함을 확인하였으며, HaCaT 세포에 대하여 63.
- HaCaT 세포에 대하여 정상군의 MDA 함량은 0.486 nmol/mg protein인데 비하여, UVB 20 mJ/cm2 조사에 의해 산화가 유도된 대조군은 1.382 nmol/mg protein으로 유의성 있게 과산화지질이 증가하였음을 확인하였다. UVB 20 mJ/cm2 조사와 연꽃 에탄올 추출물의 동시처리군은 10μg/ml의 농도에서 MDA가 0.
- HaCaT 세포에 대한 광노화를 유도하기 위하여 60% 정도의 세포 생존율을 유지할 수 있는 UVB 자외선 조사량을 비교한 결과 UVB 20 mJ/cm2 용량이 적정한 것으로 나타났다.
- 69%의 세포 생존율을 보였다. 따라서 UVB 자외선의 용량에 비례하여 HaCaT 세포의 생존율이 감소함을 확인하였으며, HaCaT 세포에 대하여 63.06%의 세포 생존율이 나타난 UVB 자외선 20 mJ/cm2용량으로 광노화를 유도하기로 결정하였다.
- 연꽃 물 추출물에 의한 생존율은 0.1 ug/ml부터 30 ug/ml 까지 77% 이상의 HaCaT 세포의 생존율을 유지하였으며, 1 ug/ml의 농도에서 최대 101.65%의 생존율을 나타내었다.
- 연꽃 수술 물 추출물에 의한 생존율은 0.1 ug/ml부터 30 ug/ml 까지 90% 이상의 HaCaT 세포의 생존율을 유지하였으며, 30 ug/ml의 농도에서 최대 107.12%의 생존율을 나타내었다.
- 연꽃 에탄올 추출물은 0.1 ug/ml부터 30 ug/ml 까지 100% 이상의 HaCaT 세포의 생존율을 유지하였으며, 30 ug/ml의 농도에서 최대 111.39%의 생존율을 나타내었다.
- 연꽃, 연꽃 수술 및 연잎 부위를 에탄올과 물을 이용하여 각각의 추출물을 얻은 후 각 추출물이 각질형성세포인 HaCaT 세포에 미치는 생존율을 비교한 결과 연꽃 에탄올 추출물이 가장 우수한 효과를 나타내었으며, 연꽃 수술 물 추출물, 연꽃 물 추출물, 연잎 물 추출물, 연잎 에탄올 추출물의 순서로 우수한 생존율을 나타내었다.
- 연잎 물 추출물에 의한 생존율은 0.1 ug/ml부터 30 ug/ml 까지 90% 이상의 HaCaT 세포의 생존율을 유지하였으며, 0.1 ug/ml의 농도에서 최대 101.46%의 생존율을 나타내었다.
- 연잎 에탄올 추출물은 0.1 ug/ml부터 30 ug/ml 까지 90% 이상의 HaCaT 세포의 생존율을 유지하였으며, 10 ug/ml의 농도에서 최대 99.01%의 생존율을 나타내었다.
- 이상의 결과, HaCaT 세포의 생존율은 연꽃 에탄올 추출물 111.39%, 연꽃 수술 물 추출물 107.12%, 연꽃 물 추출물 101.65%, 연잎 물 추출물 101.46%, 연잎 에탄올 추출물 99.01%의 순서로 우수한 생존율을 나타내었으며, 다음에 진행될 실험에서는 연꽃 에탄올 추출물과 연꽃 수술 물 추출물을 대상으로 실험을 진행하였다.
- 이상의 결과, UVB에 의한 과산화 지질 생성에 대하여 연꽃 에탄올 추출물, 연꽃 수술 물 추출물의 순서로 LPO 생성이 감소하였다.
- 이상의 결과, 연꽃 에탄올 추출물의 경우 각질형성세포의 생존율을 증가시키며, UVB 자외선을 조사한 후 생성되는 지질과산화의 생성을 효과적으로 억제함으로써, 피부 각질형성 세포에 대하여 광노화 스트레스로부터 피부 노화를 보호하는 효과가 있는 것으로 나타났다.
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