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문제 정의
- , 2006). 실험에 사용된 비단벌레추출물 중에 문헌에 발표된 기존 딱정벌레목의 항암성분의 하나인 칸다리딘 성분 및 유도체가 존재하는지 여부도 확인하게 되었다. 또한, 혈관내피세포의 성장의 저해와 더불어 혈관내피세포의 면역글로블린, 림파구 부착을 매개하는 단백인자인 ICAM-1(Intercellular adhesion molecule, Rothelin et al.
- , 1991)을 동시에 저해하여 염증을 완화하고 염증매개인자인 프로스타글란딘 E2를 억제하여 암의 초기화를 예방하는 지 조사하였다. 즉, 비단벌레의 신규소재개발의 기초자료 축적을 위하여 본 연구자들은 일본에서 복원에 성공한 비단벌레 알콜추출물이 혈관 내피세포수준에서 산화질소를 산생시키고 세포저해를 유발하여 염증매개인자(PGE2)를 감소시키고 항염증작용을 촉진하고 cytokine 중의 하나인 VEGF 활성을 억제하여 항암효과를 가진다는 가설을 확인하고자 본 연구에 착수하였다.
제안 방법
- 2㎕ 시료를 주입하고 split ratio은 10 : 1으로 하였고, mass spectrometry (Nikbakhtzadeh et al., 2007)는 ion source 온도는 230 ºC, quadrupole 온도는 150 ºC, filament 방출전류(emission current) 34.6 µA, 이온화 볼트(ionization volt) 70eV로, 캐리어 가스로 수소흐름은 1.0 ㎖/min로 하여 가스-질량분석을 실시하였다.
- GC-MS 분석은 Agilent 5973N mass selective detector를 가진 Agilent 6890 GC에 HP 5 MS capillary column (5% PH ME siloxane, 30m X 0.25 mm, 0.25 µm, USA )으로 수행하였으며 분석정성정량과정은 HP 3365 Chem Station software (HP, Palo Alto, CA, USA)로 행하였다.
- Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI-TOF) 질량분석기로는 Voyager-DE STR (Applied Biosystems, Germany)를 사용하였으며 여기에 고자장 Tandem Mass spectrometer(Micromass Autospec OA-TOF, Manchester, UK) electron 70eV DIP (Direct Inlet Probe) mode를 부착한 기기로 분자량을 측정하였다. 모든 질량분석 자료는 webbook program (NIST, Gaithersburg, MD) mass database (version 98)로 통하여 비교하였다(Ahn et al.
- NO 산생은 Griess 시약(Cayman, MI, USA)을 사용하여 세포 배지내로 아질산이온의 축적양을 측정하였다. 즉, 비단벌레 에탄올추출물을 소의 폐혈관내피세포(CPAE)에 0.
- 5 mg 에탄올추출물을 A용매에 녹여 1 ml를 HPLC에 주입하고, 분획I, II, III 얻었다. 각 분획층을 농축건조하고 MALDI-TOF(Voyager-DE STR, Applied Biosystems, Germany)를 활용하여 분자량을 측정하였다.
- 내피성 산화질소합성효소의 활성조사는 비단벌레 에탄올 추출물을 1 mg/ml, 100 µg/ml, 10 µg/ml, 1 µg/ml을 처리하여 24시간 배양한 내피세포인 HUVEC (ATCC CCL-2519, Manassas, VA, USA)를 R&D systems (Minneapolis, USA)의 매뉴얼에 따라 lysis buffer로 세포막을 터트려 나오는 세포액 중의 내피성 산화질소 합성효소를 항원항체반응인 enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) kit로 결정하였다.
- 또한 혈관내피성장인자로서 암 전이인자의 하나인 VEGF를 ELISA assay kit (R&D systems, Minneapolis, USA)으로 측정하였다(Ahn et al., 2006).
- 실험에 사용된 비단벌레추출물 중에 문헌에 발표된 기존 딱정벌레목의 항암성분의 하나인 칸다리딘 성분 및 유도체가 존재하는지 여부도 확인하게 되었다. 또한, 혈관내피세포의 성장의 저해와 더불어 혈관내피세포의 면역글로블린, 림파구 부착을 매개하는 단백인자인 ICAM-1(Intercellular adhesion molecule, Rothelin et al., 1988)의 침착과 각종혈액세포의 내피성 침윤부착인자인 VCAM-1(Vasculalr cell adhesion moecule-1, Cybulsky et al., 1991)을 동시에 저해하여 염증을 완화하고 염증매개인자인 프로스타글란딘 E2를 억제하여 암의 초기화를 예방하는 지 조사하였다. 즉, 비단벌레의 신규소재개발의 기초자료 축적을 위하여 본 연구자들은 일본에서 복원에 성공한 비단벌레 알콜추출물이 혈관 내피세포수준에서 산화질소를 산생시키고 세포저해를 유발하여 염증매개인자(PGE2)를 감소시키고 항염증작용을 촉진하고 cytokine 중의 하나인 VEGF 활성을 억제하여 항암효과를 가진다는 가설을 확인하고자 본 연구에 착수하였다.
- 비단벌레 에탄올 추출물의 세포독성은 소의 폐혈관내피세포주, CPAE (ATCC CCL-209, Manassas, VA, USA)에 대해 XTT {sodium 3'-[1-(phenylamino-carbonyl)-3,4,-tetrazolium]-bis(4- methoxy-6-～nitro) benzene sulfonic acid hydrate} kit solution (Boehringer Mannheim)을 사용하여 3회 반복 처리하여 측정하였다(Geldof et al., 1999).
- 에탄올 추출물을 HPLC (Spectra system UV3000, Thermo Spectra Products)을 이용하여 분석하였으며, 사용한 컬럼은 Luna C18 column (5 µm, 250 × 4.6 mm, Phenomex, USA)이었고 30% methanol을 A용매로 70% methanol을 용매 B로 30분간 A에서 B로 gradient를 주었다.
- 이들 상등액 중에서 분비된 cytokine류 중 염증 부착인자억제능을 측정하기 위해 TNF-α를 30 ng/ml씩 96 well에 가해 미리 분주해 놓았던 혈관내피세포(HUVEC)에 손상을 준 후, 준비된 각 well에 비단벌레 에탄올 추출물 각 1, 10, 100, 1000 ug/ml씩첨가하여 48시간 배양 후 염증매개인자인 Prostaglandin E2는 프로스타글란딘 측정 키트(Cayman, MI, USA) 매뉴얼에 따라 실험하였고 혈관내피염증 억제능에 관계하는 내피부착단백인자인 ICAM-1과 혈관세포 부착인자 VCAM-1 (ICAM-1, VCAM-1. Millipore, USA)도 같은 세포처치 방법으로 조사하였다.
- NO 산생은 Griess 시약(Cayman, MI, USA)을 사용하여 세포 배지내로 아질산이온의 축적양을 측정하였다. 즉, 비단벌레 에탄올추출물을 소의 폐혈관내피세포(CPAE)에 0.2 mg을 기준으로 10배씩 희석해가면서 CPAE 세포에 처치하여 24시간 배양하고 VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 아질산나트륨량을 흡광도를 측정하여 계산하였다(Nims et al., 1995). 대조약물로는 생체 내에서 NO를 산생하여 혈관이완에 관여하는 sodium nitroprusside dihydrate (SNP)를 사용하였다.
대상 데이터
- 2005년 일본에서 인공사육 후 죽은 비단벌레(Chrysochroa fulgidissima) 건조전체 1.28 g을 울산 MBC PD로부터 활성 확인 시험용으로 제공받아, -70ºC에서 동결 건조한 후 미세하게 시료를 마쇄하였다.
- , 1995). 대조약물로는 생체 내에서 NO를 산생하여 혈관이완에 관여하는 sodium nitroprusside dihydrate (SNP)를 사용하였다.
- 즉, 70% 에탄올로 60±5ºC에서 5시간 동안 환류냉각 추출하여 여과시킨 추출물을 진공 농축한 다음 동결 건조한 것을 냉장 보관하면서 시료(수율21.9%)로 사용하였다.
데이터처리
- Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI-TOF) 질량분석기로는 Voyager-DE STR (Applied Biosystems, Germany)를 사용하였으며 여기에 고자장 Tandem Mass spectrometer(Micromass Autospec OA-TOF, Manchester, UK) electron 70eV DIP (Direct Inlet Probe) mode를 부착한 기기로 분자량을 측정하였다. 모든 질량분석 자료는 webbook program (NIST, Gaithersburg, MD) mass database (version 98)로 통하여 비교하였다(Ahn et al., 2008).
성능/효과
- HUVEC 및 CPAE 세포에 비단벌레 에탄올 추출물 첨가하여 혈관내피염증억제능(ICAM-1, VCAM-1. Millipore, USA)을 확인한 결과, 농도 의존적으로 유의성 있는 염증부착인자인 ICAM-1의 양을 농도의존적으로 감소시켰다. 즉, TNF-알파 30 ng/ml처리로 혈관내피세포에 염증이 유발된 ICAM-1이 76.
- , 2007). 그림 9의 비단벌레 에탄올 추출물의 GC-MS fragment는 MALDI-TOF와 달리 전체 분자량을 나타내기 보다는 분해된 fragment를 나타내는 경향이 있어 본 실험에서는 비단벌레의 산화질소증강 분획에서 cantharidindn의 특징적 fragment로 m/z 96과 m/z 128를, 그 cantharidinimide의 특징적인 fragment로 m/z 70, 96과 128을 확인하였다(Fig. 9).
- 9)에서 칸다리딘의 존재를 확인하였다. 또한 MALDI-TOF 분석 그림에서 질량 194에서 수소이온 1이 더한 실제 분자량 195가 물질의 질량으로서 cantharidin imide 형태로 존재함을 추정하였으며 철을 가지는 광택성의 cantharidin 분자량 342에 peak가 존재함을 추정이 가능할 수 있었다(Fig. 8).
- 4). 또한 암 전이인자의 하나인 VEGF에 대해서도 용량의존적 조절이 가능한 것을 CPAE 세포에서 확인할 수 있었으며, HUVEC 세포에서는 낮은 VEGF 양을 보여주었다(Fig. 5). 염증매개인자인 프로스타글란딘을 HUVEC 세포에 비단벌레 에탄올 추출물 1 mg/ml 100 µg/ml, 10 µg/ml로 처리하면 123.
- 또한, VCAM-1도 동량의 TNF-알파 처리 시 72.25 ng/ml을 나타내고, 비단벌레 에탄올 추출물을 1 mg/ml 100 µg/ml, 10 µg/ml 처리시 VCAM-1은 36.76 ng/ml , 38.73 ng/ml, 39.55 ng/ml 나타내어 마찬가지로 염증부착인자 억제효과를 나타내었다(Fig. 4).
- 비단벌레 에탄올 추출물을 감량처리하면 eNOS 효소량이 농도 의존적으로 줄어들어 비단벌레 에탄올추출물이 내피성 산화질소 합성효소 조절제어에 관여함을 유추할 수 있었다. 또한, 내피성 염증부착인자인 ICAM-1과 VCAM-1에 대한 용량 의존적 저해성을 나타내었다. 이 현상들은 혈관내피세포확장에 의한 비아그라와 같은 혈관이완작용에 관여 할 수 있음을 시사하였다.
- 비단벌레 에탄올 추출물을 HUVEC 세포에 처리하여 24시간 배양한 결과 내피성 산화질소합성효소가 농도의존적으로 증가됨을 알 수 있었다. eNOS 효소량을 살펴보면 비단벌레 에탄올 추출물 1,000 µg/ml에서 796.
- 9% 수치를 나타내어 내피세포 NO 산생증가효과를 보여주었다. 비단벌레 에탄올 추출물을 감량처리하면 eNOS 효소량이 농도 의존적으로 줄어들어 비단벌레 에탄올추출물이 내피성 산화질소 합성효소 조절제어에 관여함을 유추할 수 있었다. 또한, 내피성 염증부착인자인 ICAM-1과 VCAM-1에 대한 용량 의존적 저해성을 나타내었다.
- 즉, 민간에서 최음제로 비단벌레를 사용했던 과거 기록의 과학적 근거의 일부가 될 가능성을 시사한다. 비단벌레 에탄올 추출물의 HPLC 성의 분획성분을 GC-MS와 MALI-TOF로 분석결과 칸다리딘 표준품을 가지고 GC-MS 측정시 이전 보고된 Nikbakhtzadeh(2007) 논문과 같이 m/z 96, 128로 확인하여 칸다리딘을 모핵으로 하는 구조를 포함하는 것으로 유추할 수 있었다. 이전의 발표논문과 같이 칸다리딘 골격의 분자구조, C10H12NO3, FAB-MS (m/z 194.
- 실험의 결과로부터 냉동 비단벌레(Crysochroa fulgidissim)의 에탄올 추출물에서 내피세포에서 산화질소의 산생을 촉진시키며 내피성 산화질소 합성효소량도 증가시키는 것을 확인하였다. 산화질소를 산생시켜 혈관 확장시키는 SNP 양성대조약물(단일성분 정제물)의 NO 산생을 100%로 보면 비단벌레 에탄올 추출물은 정제물이 아니지만 정제물에 대한 비교 백분율65.9% 수치를 나타내어 내피세포 NO 산생증가효과를 보여주었다. 비단벌레 에탄올 추출물을 감량처리하면 eNOS 효소량이 농도 의존적으로 줄어들어 비단벌레 에탄올추출물이 내피성 산화질소 합성효소 조절제어에 관여함을 유추할 수 있었다.
- 소의 폐혈관내피세포(CPAE)에 비단벌레에탄올 추출물을 처리하고 24시간 배양하여 NO 산생을 조사한 결과, 혈관내피세포(CPAE)에 대한 산화질소(NO)의 산생은 비단벌레에탄올 추출물 1 mg/ml 투여시 현저한 증가를 보였다(Fig. 2B). 비단벌레 에탄올추출물은 1 mg당8.
- 실험의 결과로부터 냉동 비단벌레(Crysochroa fulgidissim)의 에탄올 추출물에서 내피세포에서 산화질소의 산생을 촉진시키며 내피성 산화질소 합성효소량도 증가시키는 것을 확인하였다. 산화질소를 산생시켜 혈관 확장시키는 SNP 양성대조약물(단일성분 정제물)의 NO 산생을 100%로 보면 비단벌레 에탄올 추출물은 정제물이 아니지만 정제물에 대한 비교 백분율65.
- 이 비단벌레 추출물을 HPLC로 부분정제(Fig. 7)하여 그 피크별 분자량 fragmentation 등을 조사한 결과 MALDI-TOF (Fig. 8), GC-MS (Fig. 9)에서 칸다리딘의 존재를 확인하였다. 또한 MALDI-TOF 분석 그림에서 질량 194에서 수소이온 1이 더한 실제 분자량 195가 물질의 질량으로서 cantharidin imide 형태로 존재함을 추정하였으며 철을 가지는 광택성의 cantharidin 분자량 342에 peak가 존재함을 추정이 가능할 수 있었다(Fig.
- 즉, TNF-알파 30 ng/ml처리로 혈관내피세포에 염증이 유발된 ICAM-1이 76.74 ng/ml인데 반해, 비단벌레 에탄올 추출물 1 mg/ml 100 µg/ml, 10 µg/ml로 처리하면 28.00 ng/ml, 52.68 ng/ml, 65.42 ng/ml로 나타나 염증부착인자 억제효과를 나타내었다(Fig. 4).
후속연구
- , 1997). 이러한 세포저해 작용이 반묘에서는 항암제로서의 개발되었기에비단벌레의 알콜 추출물의 세포수준에서 활성을 조사한 결과, 혈관내피세포에서 산화질소합성효소(eNOS)를 증가시켜 NO 생성을 하고 이 산화질소가 세포저해를 일으켜 염증매개인자(PGE2)를 감소시킴으로써 항염증작용을 촉진하고 cytokine 중의 하나인 VEGF 활성을 억제하며 혈관내피세포에 임파구 및 혈액세포덩어리들의 부착(ICAM, VCAM)을 차단함으로써 차후 항암제나 항염증제 개발가능성의 소인을 가졌다고 사려 되어진다. 아쉽게도 비단벌레가 아직 국내에서는 복원에 성공하지 못한 관계로 시료가 귀해 소량추출 및 정제로 NMR동정 대신 database를 이용하여 GC-MS와 MALDI-TOF MS로 칸다리딘 함유를 확인 동정하여 비단벌레추출물의 칸다리딘의 작용을 유추할 수 있었다.
- 아쉽게도 비단벌레가 아직 국내에서는 복원에 성공하지 못한 관계로 시료가 귀해 소량추출 및 정제로 NMR동정 대신 database를 이용하여 GC-MS와 MALDI-TOF MS로 칸다리딘 함유를 확인 동정하여 비단벌레추출물의 칸다리딘의 작용을 유추할 수 있었다. 차후 비단벌레 국내 복원(인공사육)후 시료대량추출 분리정제에 의한 칸다리딘 유도체를 포함한 여러 활성분획의 구조 동정과 생리활성이 기대되어진다.
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