Autophagy는 항상성 유지와 스트레스반응을 효율적으로 조정하기 위해 필수적인 세포 내 질적 조절작용이다. 노화가 진행되는 동안 autopahgy에 의한 degradation 효율성 저하와 그로 인한 세포 내 부산물의 축적이 증가하여 결국, 근육의 약화를 초래한다. 그러므로 본 연구의 목적은 골격근에서 운동에 의한 autopahgy 관련 단백질의 변화를 규명하는데 있다. 이를 위해 24마리의 Young 그룹과 Old 그룹을 나누어 각각 대조군(n=6)과 운동군(n=6)으로 배정하였다. 운동은 8주간 주 5회 실시하였고, 트레드밀 속도 16.4 m/min와 경사도 4%로 설정하여 40분간 지속적인 운동을 실시하였다. autopahgy 관련 단백질에 대한 검증 결과 Young 그룹과 비교하여 Old 그룹에서 LC3-1, Beclin-1, Atg7은 모두 유의하게 감소하였다. 그러나 8주간의 규칙적인 운동에 의하여 autophagy 관련 단백질은 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 노화에 의해 약화된 autopahgy 기능은 규칙적인 운동에 의해 개선될 수 있을 것으로 사료된다.
Autophagy는 항상성 유지와 스트레스반응을 효율적으로 조정하기 위해 필수적인 세포 내 질적 조절작용이다. 노화가 진행되는 동안 autopahgy에 의한 degradation 효율성 저하와 그로 인한 세포 내 부산물의 축적이 증가하여 결국, 근육의 약화를 초래한다. 그러므로 본 연구의 목적은 골격근에서 운동에 의한 autopahgy 관련 단백질의 변화를 규명하는데 있다. 이를 위해 24마리의 Young 그룹과 Old 그룹을 나누어 각각 대조군(n=6)과 운동군(n=6)으로 배정하였다. 운동은 8주간 주 5회 실시하였고, 트레드밀 속도 16.4 m/min와 경사도 4%로 설정하여 40분간 지속적인 운동을 실시하였다. autopahgy 관련 단백질에 대한 검증 결과 Young 그룹과 비교하여 Old 그룹에서 LC3-1, Beclin-1, Atg7은 모두 유의하게 감소하였다. 그러나 8주간의 규칙적인 운동에 의하여 autophagy 관련 단백질은 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 노화에 의해 약화된 autopahgy 기능은 규칙적인 운동에 의해 개선될 수 있을 것으로 사료된다.
Autophagy, a highly conserved mechanism of internal quality control, is essential for the maintenance of cellular homeostasis and for the orchestration of an efficient cellular response to stress. During aging, the efficiency of autophagic degradation declines and intracellular waste products accumu...
Autophagy, a highly conserved mechanism of internal quality control, is essential for the maintenance of cellular homeostasis and for the orchestration of an efficient cellular response to stress. During aging, the efficiency of autophagic degradation declines and intracellular waste products accumulate. Therefore, the aim of this study is to investigate the effects of exercise on autophagic response in skeletal muscle. Twenty-four Young (4 month) and Old (12 month) ICR-type white male mice were divided into a control group (CON: n=6) and exercise training group (Tr: n=6) after an adaptation period of 1 week. Exercise consisted of treadmill running at 16.4 m/min with a 4% incline, 40 min/day and 5 days/week for 8 weeks. Cervical dislocation was performed at 48 hours after the last round of exercise, after which the gastrocnemius skeletal muscle were immediately collected. The results of verifying autophagy formation showed that the Sarcopenia index was decreased in the Old mice compared to the Young. However, it increased with exercise training in the Old. Lipidation LC3-II, Becline-1, and Atg7 were decreased in the Old mice compared to the Young. However, Lipidation LC3-II was significantly increased in the trained Old mice (Young:1 Vs Old:$1.32{\pm}0.042$, p<0.05). Based on these data, we suggest that autophagy regulatory events are the attenuated in Old mice, but that they are enhanced with exercise training.
Autophagy, a highly conserved mechanism of internal quality control, is essential for the maintenance of cellular homeostasis and for the orchestration of an efficient cellular response to stress. During aging, the efficiency of autophagic degradation declines and intracellular waste products accumulate. Therefore, the aim of this study is to investigate the effects of exercise on autophagic response in skeletal muscle. Twenty-four Young (4 month) and Old (12 month) ICR-type white male mice were divided into a control group (CON: n=6) and exercise training group (Tr: n=6) after an adaptation period of 1 week. Exercise consisted of treadmill running at 16.4 m/min with a 4% incline, 40 min/day and 5 days/week for 8 weeks. Cervical dislocation was performed at 48 hours after the last round of exercise, after which the gastrocnemius skeletal muscle were immediately collected. The results of verifying autophagy formation showed that the Sarcopenia index was decreased in the Old mice compared to the Young. However, it increased with exercise training in the Old. Lipidation LC3-II, Becline-1, and Atg7 were decreased in the Old mice compared to the Young. However, Lipidation LC3-II was significantly increased in the trained Old mice (Young:1 Vs Old:$1.32{\pm}0.042$, p<0.05). Based on these data, we suggest that autophagy regulatory events are the attenuated in Old mice, but that they are enhanced with exercise training.
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문제 정의
elegans), 초파리(drosophila) 등의 대상에 국한되어있고 척추동물에서의 연구는 부족한 실정이다. 그러므로, 본 연구의 목적은 골격근에서 연령과 운동훈련에 따른 autophagy 관련 단백질 변화를 규명하는데 있다.
이 연구는 연령에 따른 8주간의 트레드밀 운동 효과를 알아보기 위하여 비복근내에서 autopahgy 관련 단백질의 변화를 검사한 후, 다음과 같은 결과를 얻었다.
가설 설정
macroautophagy, 2) microautophagy, 3) chaperone-mediated autophagy로 나뉘어진다. 일반적으로 autopahgy는 macroautophagy를 일컫는데, 분해된 cytoplasm 일부분을 autophagosome으로 포장한 후, 감성을 위해lysosomal vesicles과 융합을 이룬다.
제안 방법
운동그룹은 트레드밀 속도 10 m/min, 경사도 0%, 10분 2일 간의 적응기를 실시하였으며 8주간 주당 5회 운동을 실시하였다. 8주간의 본 운동을 위한 트레드밀 프로토콜은 트레드밀 경사도 4%, 속도 16.4 m/min로 40분간 지속하였고[5], 운동기간 동안 동일한 시간대에 운동을 수행하였다.
Mcmullen 등[9]은 6-, 18-, 그리고 30-개월 된 344-Brown Norway F1 hybrid rats의 안외근(extraocular muscle, EOM)을 대상으로 실험한 결과, 6개월 된 개체와 비교하여 30개월된 개체에서 Atg5, Atg7, LC3 가 모두 유의하게 감소하였다. 그러므로, autopahgy 관련 단백질의 감소는 비정상적이고 손상된 단백질의 축적을 유도하여 protein turnover의 효율성을 감소시켜 세포의 기능에 영향을 미칠 것으로 제안하였다. 또한, 30개월과 비교하여 오히려 18개월에서 Atg7이 약2배 감소하였음에도 불구하고, LC3-Ⅱ는 약 1.
각 조직에서 cell lysis buffer를 이용하여 2 ug/1ul 단백질을 얻었다. 단백질 분리하기 위해 10% polyacrylamide one-Gel (Elpis Biotech, Korea)을 사용하여 SDS-PAGE를 시행한 후 PVDF membrane (polyvinylidine difluoride)로 gel transfer 하였다. Membrane을 TBS-T로 1회 세척한 후 3% bovine serum albumin/TBS-T로 2시간 이상 blocking한 후, TBS-T로 1회 세척하였다.
그러므로, autopahgy 관련 단백질의 감소는 비정상적이고 손상된 단백질의 축적을 유도하여 protein turnover의 효율성을 감소시켜 세포의 기능에 영향을 미칠 것으로 제안하였다. 또한, 30개월과 비교하여 오히려 18개월에서 Atg7이 약2배 감소하였음에도 불구하고, LC3-Ⅱ는 약 1.7배 증가하여 autopahgy 관련 단백질 간에 변화 비율에 차이를 보고하였고, 그 이유는 18개월 된 개체의 안외근에서는 노화가 빠르게 이행되는 연령(transitional age) 상태로서 LC3 감소를 위한 보상작용이 시도된 것으로 해석하였다.
이차 항체로는 horseradish peroxidase (HRP) 결합된 anti-mouse IgG antibody (1:15,000 dilution) 또는 anti-rabbit IgG antibody(1:20,000 dilution)를 membrane과 4℃에서 1시간 반응시킨 후 TBS-T 용액으로 5분씩 6회 세척하였다. 반응 후, HRP의 기질인 ECL용액으로 발색반응을 일으켜 X-ray film에 감광하여 분석하였다.
온도(22±1℃), 습도(55±3%), 밤낮은 자연주기 조건에서 사육하였다.
운동그룹은 트레드밀 속도 10 m/min, 경사도 0%, 10분 2일 간의 적응기를 실시하였으며 8주간 주당 5회 운동을 실시하였다. 8주간의 본 운동을 위한 트레드밀 프로토콜은 트레드밀 경사도 4%, 속도 16.
대상 데이터
실험동물은 생후 Young (4개월)과 Old (12개월) 된 ICR계 수컷을 이용하여, 일주일의 적응기간을 거친 후 무작위로 각각 운동집단(Tr; n=6), 통제집단(Con; n=6)로 설정하였다. 사료와 물은 자유스럽게 섭취하도록 하였다.
데이터처리
본 실험의 자료는 SPSS 13.0 통계프로그램을 이용하여, T-test를 실시하였다. 유의수준은 p<0.
성능/효과
그러나, 골격근에 특이적으로 작용하는 skeletal muscle specific autophagy knockout mice에서 muscle dysfunction과 myopathy의 특징이 나타나는 것으로 밝혀졌다. Atg7-/- mice는 출생 후 약 40일 후에 야생형(Wild Type)과 비교하여 체중, 근량/체중, 힘의 생성 그리고 근섬유의 횡단면이 감소하는 것으로 나타났다. 또 다른 변화는 z-line의 정렬불량, 팽창된 미토콘드리아와 근형질세망 그리고 비정상적인 수축막 구조는 Atg7-deficient livers와 Atg5-deficient heart에서 모두 유사하게 관찰되어, autophagy의 억제/변화는 근섬유 변성과 약화에 원인이 되고 근량 유지를 저해하는 주요기작이 될 수 있다고 제안하였다[8,18].
약화된 autophagy 기능의 개선을 위해 24개월 된 344 fischer rats을 대상으로 8% 식이제한 그룹 그리고 자발적인 휠 운동과 식이제한을 동시에 적용한 그룹으로 나누어 실험한 결과[19] plantaris에서 LC3Ⅱ와 beclin-1단백질 변화는 6개월 된 그룹과 비교하여 24개월 된 그룹이 유의하게 높게 나타났다. 그러나 식이제한그룹과 복합처치그룹에서 유의한 변화는 나타나지 않았고 오히려 감소하는 경향이 나타났다. 또한 atg7 단백질은 6개월 된 그룹과 24개월 된 그룹간 차이가 나타나지 않았으나 식이제한그룹과 복합처치그룹에서 24개월 된 그룹과 비교하여 유의하게 증가하는 것을 보고하여 autopahgy 관련 단백질이 일관된 경향이 나타나지 않았다.
그러므로 규칙적인 운동에 의한 autophagy 관련 단백질의 변화는 연령에 따라 다르게 변화하는 것을 알 수 있었고 노후된 개체에서 근량의 증가와 더불어 약화된 autophagy 관련 단백질이 증가하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 손상된 세포소기관 및 변형된 단백질의 제거 기능이 개선 되었을 것으로 사료된다.
즉, 정상적인 영양조건에서 운동 효과의 결과가 autophagy 관련 단백질의 변화를 정확하게 해석할 수 있는 실험조건이 된다. 그러므로 본 실험의 결과는 노후된 개체에서 autophagy 관련 단백질 변화가 증가한 것은 순수한 운동효과라고 할 수 있다.
반면 Old (Con; 0.367±0.02 Vs Tr; 0.502±0.06) 그룹에서는 유의하게 증가하였고(Fig. 1B), 근육량 또한 Old (Con; 0.194±0.013 Vs Tr; 0.238±0.017 g) 그룹에서 유의하게 증가하는 것으로 나타났다(p<0.05) (Fig. 1C).
본 실험에서도 Young 그룹과 비교하여 Old 그룹의 비복근에서 LC3-Ⅱ의 감소와 autophagosome 형성 초기에 관여하는 beclin-1과 LC3-Ⅱ의 lipidation에 관여하는 Atg7이 낮게 나타났다. 따라서, 노화로 인해 잠재적으로 degradation과 protein turnover 기능의 약화로 인한 근세포기능 저하를 초래할 수 있을 것이다.
이러한 세포 내 질적조절과 항상성 유지에 주요한 역할을 담당하는 autopahgy는 노후된 개체에서 그 기능이 약해진다[3,9,14-16,18-20]. 약화된 autophagy 기능의 개선을 위해 24개월 된 344 fischer rats을 대상으로 8% 식이제한 그룹 그리고 자발적인 휠 운동과 식이제한을 동시에 적용한 그룹으로 나누어 실험한 결과[19] plantaris에서 LC3Ⅱ와 beclin-1단백질 변화는 6개월 된 그룹과 비교하여 24개월 된 그룹이 유의하게 높게 나타났다. 그러나 식이제한그룹과 복합처치그룹에서 유의한 변화는 나타나지 않았고 오히려 감소하는 경향이 나타났다.
후속연구
이러한 결과는 손상된 세포소기관 및 변형된 단백질의 제거 기능이 개선 되었을 것으로 사료된다. 그러나 autophagy 증가로 인한 degradation과 protein turnover 기능 개선에 직접적인 영향을 규명하지 못한 한계점이 있기에 degradation의 대상이 되는 dysfunctional mitochondria 등의 변화에 관한 추가적인 연구가 이루어져야 한다.
이를 위해 노후된 개체에게 8% 식이제한과 자율적인 휠운동과 식이제한을 동시에 적용한 후 autophagy의 변화를 보고하였다[19]. 그러나 이러한 결과는 에너지부족 및 결핍에 노출된 조건이며 순수한 운동 중재효과는 아니므로 정상적인 조건에서 정확한 운동 중재효과의 연구가 필요하다. 또한, 노화에 의한 autophagy 관련연구는 균(yeast), 꼬마선충(c.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Autophagy란 무엇인가?
Autophagy는 항상성 유지와 스트레스반응을 효율적으로 조정하기 위해 필수적인 세포 내 질적 조절작용이다. 노화가 진행되는 동안 autopahgy에 의한 degradation 효율성 저하와 그로 인한 세포 내 부산물의 축적이 증가하여 결국, 근육의 약화를 초래한다.
노화와 autophagy의 관계는 어떻게 되는가?
Autophagy는 항상성 유지와 스트레스반응을 효율적으로 조정하기 위해 필수적인 세포 내 질적 조절작용이다. 노화가 진행되는 동안 autopahgy에 의한 degradation 효율성 저하와 그로 인한 세포 내 부산물의 축적이 증가하여 결국, 근육의 약화를 초래한다. 그러므로 본 연구의 목적은 골격근에서 운동에 의한 autopahgy 관련 단백질의 변화를 규명하는데 있다.
autophagy 유지가 골격근의 항상성을 위해 중요한 이유는 무엇인가?
또한, autophagy 유지는 골격근의 항상성을 위해 중요하다. 골격근에서는 간, 췌장과 같은 다른 주요 대사조직과 비교하여 특이적이다. 금식 동안 대부분 조직의 autophagy 활성은 마지막 몇 시간에서 일시적으로 나타나지만 골격근은 매일 지속적으로 autophagosome의 발생이 끊임없이 나타난다[12,17]. 그러나, 골격근에 특이적으로 작용하는 skeletal muscle specific autophagy knockout mice에서 muscle dysfunction과 myopathy의 특징이 나타나는 것으로 밝혀졌다.
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