[논문]녹색반응을 이용한 클로로겐산의 함량측정을 위한 흡광도 분석법과 블루베리 잎에 함유된 클로로 겐산의 함량분석

정동민; 정영철; 전효곤

doi:10.5352/jls.2011.21.4.610

[국내논문] 녹색반응을 이용한 클로로겐산의 함량측정을 위한 흡광도 분석법과 블루베리 잎에 함유된 클로로 겐산의 함량분석
Spectrophotometric Assay for Determination of Chlorogenic Acid Using Green Pigment Formation and Quantitative Analysis of Chlorogenic Acid in Blueberry Leaf 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.21 no.4 = no.132, 2011년, pp.610 - 612

정동민 (한국생명공학연구원 전북분원 생물산업공정센터) , 정영철 (한국국제대학교 식품영양학과) , 전효곤 (한국생명공학연구원 전북분원 생물산업공정센터)

초록
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본 연구는 클로로겐산의 함량을 측정하기 위한 흡광도 방법을 구축하였으며, 구체적으로는 클로로겐산이 $50^{\circ}C$와 글라이신 및 알칼리 조건하에서 녹색반응이 일어난다는 현상을 이용했다. 녹색형성은 일련의 클로로겐산 농도에 의존성을 가졌다. 본 연구에 따른 클로로겐산의 측정방법을 이용하여 블루베리에 함유된 클로로겐산의 함량을 분석하였다(12.42 mg/g d.w). 이러한 방법은 저가의 비용과 빠른 시간으로 많은 시료를 대량으로 쉽게 클로로겐산의 함량은 측정할 수 있는 효과를 가진다.

Abstract ▼ AI-Helper

We developed a spectrophotometric assay for the quantitative determination of chlorogenic acid based on the formation of green pigment at $50^{\circ}C$ under glycine and alkaline conditions in 96-well plates. The formation of green pigment was linear with a series of chlorogenic acid concentration (0-$300\;{\mu}M$). Using this method, the content of chlorogenic acid (12.42 mg/g dry weight) in the leaves of blueberry was quantified. This method is high-throughput, cost-effective, rapid, and easy to perform.

Keyword

AI 본문요약
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제안 방법

이에, 본 연구는 HPLC 기법과는 달리 저렴성, 단시간의 측정 및 대량 시료의 빠른 분석 등의 차별성을 고려한 클로로겐산의 함량을 측정하는 방법을 구축하기 위해 연구한 결과, 클로로겐산이 알칼리성 조건 및 글라이신이 있는 조건에서 녹색 색깔을 형성하는 것을 이용하여 클로로겐산에 알칼리성 완충용액과 글라이신 용액을 첨가하여 반응시킨 후 96 웰 플레이트(well plate)에서 655 nm 파장으로 흡광도를 측정함으로써 클로로겐산의 함량을 측정할 수 있는 방법을 구축하였다. 그리고, 본 연구에서 개발된 흡광도 방법과 HPLC 방법을 이용하여 블루베리 잎에 함유된 클로로겐산의 함량을 비교 분석하였다.
이에, 본 연구는 HPLC 기법과는 달리 저렴성, 단시간의 측정 및 대량 시료의 빠른 분석 등의 차별성을 고려한 클로로겐산의 함량을 측정하는 방법을 구축하기 위해 연구한 결과, 클로로겐산이 알칼리성 조건 및 글라이신이 있는 조건에서 녹색 색깔을 형성하는 것을 이용하여 클로로겐산에 알칼리성 완충용액과 글라이신 용액을 첨가하여 반응시킨 후 96 웰 플레이트(well plate)에서 655 nm 파장으로 흡광도를 측정함으로써 클로로겐산의 함량을 측정할 수 있는 방법을 구축하였다. 그리고, 본 연구에서 개발된 흡광도 방법과 HPLC 방법을 이용하여 블루베리 잎에 함유된 클로로겐산의 함량을 비교 분석하였다.
클로로로겐산 20 μl를 농도별(10, 30, 100 및 300 μM, 및 1, 3 및 10 mM)로 10 mM NaHCO3/Na2CO3 완충용액(pH9.5) 및 10 mM 글라이신 용액 180 μl를 혼합하여 96 웰 플레이트(well plate)에서 총량이 200 μl이 되도록 혼합하였다.
HPLC는 Agilent사의 1200 series로서, 분석조건 중 칼럼은 YMC ODS-AM 칼럼(5 um, 4.6 mm × 250 mm), 유속은 1.0ml/min, 검출기는 DAD를 이용하여 280, 290, 323, 515 nm 파장에서 측정하였다.
상기 메탄올로 녹인 용액을 클로로겐산의 함량을 측정하는 시료로 사용하였다. 블루베리 잎의 건조 무게량을 측정하기 위해서 블루베리 잎을 동결건조한 다음 무게를 측정하였다. 상기 건조 무게량은 블루베리 잎 1 g 당 건조 무게량 0.
0ml/min, 검출기는 DAD를 이용하여 280, 290, 323, 515 nm 파장에서 측정하였다. A 이동상 용매는 증류수(0.05% 트리 플로로 아세트산)와 B 이동상 용매는 메탄올을 사용하고, 용매 기울기는 일정한 혼합비율(A:B=92:8, 70:30, 및 30:50)로 용출시켰다. 시료 주입량은 10 μl로 하였다.
클로로겐산의 함량을 측정하기 위해 클로로겐산의 녹색 현상을 이용했다. Fig.
기존에 사용되고 있는 클로로겐산의 함량을 측정하는 방법인 HPLC 기법과 본 연구의 흡광도 방법을 비교하기 위해서, 블루베리 잎에 함유하고 있는 클로로겐산의 함량을 두 가지 방법으로 각각 측정하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 블루베리 잎은 정읍시 소재의 블루베리 농원에서 구입하여 사용하였다. 표준폼으로 사용된 클로로겐산(Chlrogenic acid)는 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 물과 메탄올은 Burdick and Jackson(SK Chemicals, Ulsan, ROK)사의 HPLC용 용매를 사용하였고, 트리 플로로 아세트산은 Sigma Co.
Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 물과 메탄올은 Burdick and Jackson(SK Chemicals, Ulsan, ROK)사의 HPLC용 용매를 사용하였고, 트리 플로로 아세트산은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
추출 과정을 3번 반복한 후, 상등액만을 여과한 다음, 회수하여 원심진공농축기에 넣고 메탄올을 제거한 다음, 메탄올 5 ml에 녹였다. 상기 메탄올로 녹인 용액을 클로로겐산의 함량을 측정하는 시료로 사용하였다. 블루베리 잎의 건조 무게량을 측정하기 위해서 블루베리 잎을 동결건조한 다음 무게를 측정하였다.
본 실험에 사용된 블루베리 잎은 정읍시 소재의 블루베리 농원에서 구입하여 사용하였다. 표준폼으로 사용된 클로로겐산(Chlrogenic acid)는 Sigma Co.

성능/효과

그 결과, Fig. 1 및 Fig. 2에서 보는 바와 같이 클로로겐산의 농도 및 반응시간에 따라 흡광도 수치가 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 클로로겐산의 녹색 현상을 이용하여 클로로겐산의 함량을 측정할 수 있고, 최소 30 uM의 클로로겐산 농도까지 측정할 수 있음을 알 수 있었다.
2에서 보는 바와 같이 클로로겐산의 농도 및 반응시간에 따라 흡광도 수치가 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 클로로겐산의 녹색 현상을 이용하여 클로로겐산의 함량을 측정할 수 있고, 최소 30 uM의 클로로겐산 농도까지 측정할 수 있음을 알 수 있었다.
즉, 상기 두 가지 방법으로 측정한 클로로겐산의 함량은 유사한 값으로 측정된 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 연구에 따른 클로로겐산의 함량 측정방법은 기존에 사용되는 HPLC 방법을 대체할 수 있는 방법으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.
그 결과, Table 1에서 보는 바와 같이 두 가지 방법으로 측정한 클로로겐산의 함량은 각각 HPLC 방법으로 측정한 경우에는 건조 무게당 12.42 mg으로 나타났고, 본 연구의 흡광도 방법으로 측정한 경우에는 12.48 mg으로 나타났다. 즉, 상기 두 가지 방법으로 측정한 클로로겐산의 함량은 유사한 값으로 측정된 것을 알 수 있었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	클로로겐산의 함량 분석 방법으로 어떤 방법을 주로 이용해왔는가?	지금까지 알려진 클로로겐산의 함량 분석 방법은 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography System, HPLC) 기법을 주로 이용하고 있다. 이러한 HPLC 방법은 고가의 장비와 장시간의 측정시간이 필요로 하며, 대량의 시료를 빠르게 분석하기에는 어렵다.
	클로로겐산이란 무엇인가?	클로로겐산(Chlorogenic acid)은 커피산과 퀴닉산의 에스테르 결합으로 형성된 폴리페놀 화합물의 일종이다. 그것은 주로 커피, 사과, 배, 감자, 고구마, 블루베리, 우엉 및 해바라기 등에 과량으로 함유되어 있다[2].
	클로로겐산은 주로 어디에 함유되어 있는가?	클로로겐산(Chlorogenic acid)은 커피산과 퀴닉산의 에스테르 결합으로 형성된 폴리페놀 화합물의 일종이다. 그것은 주로 커피, 사과, 배, 감자, 고구마, 블루베리, 우엉 및 해바라기 등에 과량으로 함유되어 있다[2]. 클로로겐산은 시험관 내(Invitro) 상에서 항산화제 속성을 가지고 있으며, 프리 라디칼 제거, 메탈 이온의 착화합화, 라디칼 및 과산화물 형성을 관여하는 효소를 억제한다고 알려져 있다[1].

참고문헌 (7)

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Clifford, M. N. 2000. Chlorogenic acid and other cinnamates-nature, occurrence, dietary burden, absorption and metabolism. J. Sci. Food Agric. 80, 1033-1043.

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Mateos, R., L. Goya, and L. Bravo. 2006. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the Human Liver. J. Agric. Food Chem. 54, 8724-8732.

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Politir, J. 1947. Sur une nouvelle methode concernant la localization dans les plantes. Compt. Rend. 225, 954-956.
Rice-Evans, C. A., N. J. Miller, and G. Paganga. 1996. Structure antioxidant activity relationship of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biol. Med. 20, 933-956.

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Uritani, I. and K. Muramatsu. Studies on the phytopathological chemistry of black-rottin potato. Part 2. Some factors concerning the color changes of the injured part. Nippon Nogei Kagaku Kaish 27, 781-789, 1953.

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Yabut, G., Y. Koizumi, K. Namiki, M. Hida, and M. Mamiki. 2001. Structure of green pigment formed by the reaction of caffeic acid esters (or chlorogenic acid) with a primary amino compound. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 2121-2130.

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