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문제 정의
- 이번 연구에서는 인천 관내 양돈장의 설사 발생돈과 정상돼지의 분변에서 돼지 장염을 유발하는 바이러스중 혈청형 A 로타바이러스 혈청형 C 로타바이러스 및 칼리 시바이러스의 분포도를 조사하였다.
- 이번 연구를 통하여 돼지에서 혈청형 C 로타바이러스도 바이러스성 설사에 많은 부분을 차지하는 것을 확인할 수 있었다. 혈청형 A 로타바이러스와 비슷한 검출률을 나타낸 혈청형 C 로타바이러스의 결과를 토대로 혈청형 C 로타바이러스에 대한 백신개발 및 돼지에서 발병하는 다른 혈청형 B, E의 감염률에 대한 연구 필요성에 대해 말해주고 있다. 또한, 최근 아일랜드에서 연구한 결과 설사증상을 전혀 보이지 않는 분변에서 혈청형 C 로타바이러스가 발견되었는데(Collins 등, 2008) 본 연구에서도 임상증상이 없는 분변에서 혈청형 C 로타바이러스가 확인됨에 따라 임상증상과 관계없이 혈청형 C 로타바이러스는 상재해있는 것으로 생각한다.
제안 방법
- PCR 증폭산물을 확인하기 위하여 100 ml당 5 ㎕의RedSafe Nucleic Acid Stain Solution (iNtRON, Korea)을함유한 1% agarose gel을 준비하였다. Gel의 각 well에 PCR 산물 5 ㎕와 gel 6X Loading Buffer (Takara, Ja pan)1 ㎕를 혼합하여 전개한 후 전기영동이 끝난 gel을 UV illuminator에서 관찰하여 PCR 증폭산물을 확인하였다
- 역전사 및 증폭을 위해 Bioneer AccuPower RT/ PCR Premix kit 를사용하였으며 RNase free water 14 ㎕, Primer (F) 1 ㎕, Primer (R) 1 ㎕, RNA 추출물 4 ㎕를 순서대로 가하여 최종 반응액이 20 ㎕로 되게 하였다. Nested PCR은 Bioneer AccuPower HotStart PCR Premix kit 를 사용하였고 RT-PCR 산물 4 ㎕를 RT-PCR과 같은 조건으로 실시하였다. 각각의 primer pairs 가 들어 있는 혼합액은 Thermocycler (Bio-metra, USA) 에서 42℃에서 60분간 역전사를 한 후, 94℃ 에서 5분간 예열을 하였다.
- RNA를 추출에 사용하였다. RNA 추출은 RNasy Minikit (Qiagen, USA)를 이용하여 실험을 수행하였다.
- 시료로부터 RNA를 추출하기 위해 분변을 PBS로 5% (w/v) 농도로 희석하여 3회 동결과 융해를 반복한 후 3, 000 rpm에서 10분간 원심분리 한 다음 상층액 200 ㎕를취하여 RNA를 추출에 사용하였다. RNA 추출은 RNasy Minikit (Qiagen, USA)를 이용하여 실험을 수행하였다.
- assay 를 사용하였다 (Cho 등, 2001). 역전사 및 증폭을 위해 Bioneer AccuPower RT/ PCR Premix kit 를사용하였으며 RNase free water 14 ㎕, Primer (F) 1 ㎕, Primer (R) 1 ㎕, RNA 추출물 4 ㎕를 순서대로 가하여 최종 반응액이 20 ㎕로 되게 하였다. Nested PCR은 Bioneer AccuPower HotStart PCR Premix kit 를 사용하였고 RT-PCR 산물 4 ㎕를 RT-PCR과 같은 조건으로 실시하였다.
- 각각의 primer pairs 가 들어 있는 혼합액은 Thermocycler (Bio-metra, USA) 에서 42℃에서 60분간 역전사를 한 후, 94℃ 에서 5분간 예열을 하였다. 이후 denaturation 1분, annealing 1분, extension 1분의 고]정을 총 30회 반복하는 PCR을 수행하였다(장, 2006).
- 인천 관내 총 46개 농가에서 채취한 분변 300점을 대상으로 혈청형 A, C 로타바이러스 및 칼리시바이러스 각각의 특이적 primer들을 이용하여 RT-PCR 및 nested PCR을 수행한 결과 Fig. 1과 같은 증폭 산물을 확인하였다.
- 채취한 시료는 100두 미만 사육농가 5 농가 60건, 100두 이상 500두 미만 사육농가 6 농가 26건, 500두 이상 1, 000두 미만 사육농가 25농가 158건 그리고 1, 000두 이상 사육농가 10 농가 56건을 채취하여 농장규모별로 구분하여 실험하였다. 임상증상별로는 설사증상을 전혀 보이지 않고 정상적인분변은 무증상(Subclinical diarrhea)으로 표기하고 11 농가 59건, 분변이 약간 무르거나 삼출성 물질이 분변에같이 묻어나오는 경우 미약한 설사(mild~moderate diarrhea) 로 32 농가 228건 그리고 분변 전체적으로 액상인 경우는 심한 설사(Severe diarrhea)로 간주하고 3 농가 13건을 채취하였다. 계절별로는 봄에 8 농가 24건, 여름은 17 농가 78건, 가을은 10 농가 72건 그리고 겨울은 11 농가 126건을 실시하였다.
- 채취하여 공시하였다. 채취한 시료는 100두 미만 사육농가 5 농가 60건, 100두 이상 500두 미만 사육농가 6 농가 26건, 500두 이상 1, 000두 미만 사육농가 25농가 158건 그리고 1, 000두 이상 사육농가 10 농가 56건을 채취하여 농장규모별로 구분하여 실험하였다. 임상증상별로는 설사증상을 전혀 보이지 않고 정상적인분변은 무증상(Subclinical diarrhea)으로 표기하고 11 농가 59건, 분변이 약간 무르거나 삼출성 물질이 분변에같이 묻어나오는 경우 미약한 설사(mild~moderate diarrhea) 로 32 농가 228건 그리고 분변 전체적으로 액상인 경우는 심한 설사(Severe diarrhea)로 간주하고 3 농가 13건을 채취하였다.
대상 데이터
- 2010년 1월에서 11월까지 11개월 동안 인천광역시 관내 총 46개 양돈농가에서 설사증세를 보이는 돼지와 임상증상을 전혀 보이지 않는 돼지에서 총 300점의 분변을 채취하여 공시하였다. 채취한 시료는 100두 미만 사육농가 5 농가 60건, 100두 이상 500두 미만 사육농가 6 농가 26건, 500두 이상 1, 000두 미만 사육농가 25농가 158건 그리고 1, 000두 이상 사육농가 10 농가 56건을 채취하여 농장규모별로 구분하여 실험하였다.
- PCR 증폭산물을 확인하기 위하여 100 ml당 5 ㎕의RedSafe Nucleic Acid Stain Solution (iNtRON, Korea)을함유한 1% agarose gel을 준비하였다. Gel의 각 well에 PCR 산물 5 ㎕와 gel 6X Loading Buffer (Takara, Ja pan)1 ㎕를 혼합하여 전개한 후 전기영동이 끝난 gel을 UV illuminator에서 관찰하여 PCR 증폭산물을 확인하였다
이론/모형
- 설사분변에서 바이러스의 검출을 위하여 one-step RT-PCR assay 를 사용하였다 (Cho 등, 2001). 역전사 및 증폭을 위해 Bioneer AccuPower RT/ PCR Premix kit 를사용하였으며 RNase free water 14 ㎕, Primer (F) 1 ㎕, Primer (R) 1 ㎕, RNA 추출물 4 ㎕를 순서대로 가하여 최종 반응액이 20 ㎕로 되게 하였다.
성능/효과
- 9%)에서 관찰되었다. 1, 000두 이상의 대규모 농장에서는 혈청형 A, C 로타바이러스와 칼리시바이러스를 5 농가(50.0%) 19두(33.9%)에서 확인할 수 있었다.
- 2010년 인천 관내 46개 양돈장의 분변 300점을 분석한 결과, 혈청형 A 로타바이러스는 8개 농가(17.4%)의 16두 분변(5.3%)에서 검출되었고 혈청형 C 로타바이러스는 6개 농가(13.0%) 17두 분변(5.7%)에서 검출되었다 또한, 2개 농가(4.3%) 11두(3.7%)에서 칼리시바이러스가 확인되었다 돼지 혈청형 A, C 로타바이러스 및 칼리시바이러스는 미약한 설사를 나타내는 개체에서 더 높은 검출률을 나타내었으며 농장규모와 발생률은 높은 연관성을 보이지 않았다. 또한, 인천지역의 감염 양상은 계절과 온도에 크게 영향을 받지 않고 발생하는 경향을 보였다 특별히 임상증상이 전혀 보이지 않는 분변에서 혈청형 C 로타바이러스가 확인되었다.
- 계절에 따른 검출률을 확인한 결과 여름(6~8월)에 혈청형 A 로타바이러스가 5 농가 9건으로 가장 높게 발생하였으며 이와 함께 혈청형 C 로타바이러스는 3 농가 7건에서 양성이 확인되었다. 다음으로는 혈청형 C 로타바이러스가 1 농가 8건, 칼리시바이러스가 1 농가 8건으로 겨울에 발생하였으며 가을에는 혈청형 A 로타바이러스가 3 농가 7건, 혈청형 C 로타바이러스가 3 농가 7건 관찰되었다.
- 7%)에서 칼리시바이러스가 확인되었다 돼지 혈청형 A, C 로타바이러스 및 칼리시바이러스는 미약한 설사를 나타내는 개체에서 더 높은 검출률을 나타내었으며 농장규모와 발생률은 높은 연관성을 보이지 않았다. 또한, 인천지역의 감염 양상은 계절과 온도에 크게 영향을 받지 않고 발생하는 경향을 보였다 특별히 임상증상이 전혀 보이지 않는 분변에서 혈청형 C 로타바이러스가 확인되었다.
- 확인하였다(김 등, 2008). 사육규모가 큰 농장일수록 사양관리와 질병관리가 더 나을 것으로 생각하여지나 오히려 높은 바이러스 검출률을 나타냈다. 1, 000두 이상 사육하는 농가가 오히려 높은 양성률을 나타내었는데, 이는 관내 양돈장에 바이러스들이 사양관리 실태와는 무관하게 이미 상재해 있으며 사육두수가 많을수록 개체 간의 접촉의 기회가 많아서 나타난 결과로 생각된다.
- 사육규모에 따른 해당 바이러스들의 검출분포를확인한 결과(Table 3), 100두 미만의 사육 농가에서는 총 1 농가(20.0%) 8두(13.3%)에서 혈청형 C 로타바이러스가 검출되었다. 100 두 이상 500두 미만의 농가에서는 1 농가(16.
- 설사증상을 전혀 보이지 않는 분변 중 혈청형 C로타바이러스가 2 농가(18.2%) 3두(5.1%)에서 확인되었다. 심각한 설사 증상을 보이는 분변보다 미약한 설사를 나타내는 분변에서 높은 검출률을 나타내었는데 13 농가(40.
- 1%)에서 확인되었다. 심각한 설사 증상을 보이는 분변보다 미약한 설사를 나타내는 분변에서 높은 검출률을 나타내었는데 13 농가(40.6%) 39두(17.1%)에서 그룹 A, C 로타바이러스와 칼리시바이러스가 발생하였다. 이에 반해 중증도의 설사를 보이는 분변에서는 1 농가(33.
- 확인은 됐으나 발생이 매우 드문 바이러스로 인식되어 왔다 (Gouvea 등 1991; Alfieri 등 1999).이번 연구를 통하여 돼지에서 혈청형 C 로타바이러스도 바이러스성 설사에 많은 부분을 차지하는 것을 확인할 수 있었다. 혈청형 A 로타바이러스와 비슷한 검출률을 나타낸 혈청형 C 로타바이러스의 결과를 토대로 혈청형 C 로타바이러스에 대한 백신개발 및 돼지에서 발병하는 다른 혈청형 B, E의 감염률에 대한 연구 필요성에 대해 말해주고 있다.
- 2003년에서 2005년 사이 전국 211개의 설사분변을 채취하여 바이러스 원인체를 검사한 결과 혈청형 A 로타바이러스는 약 50% 혈청형 C 로타바이러스는 20% 칼리시바이러스는 20%의 분변에서 양성분포를 나타내었다(장, 2006). 이번 연구에서 인천 관내 46 농가 300두의 돼지 분변을 검사한 결과, 혈청형 A 로타바이 러스가 8 (17.4%) 농가 16 (5.3%)두, 혈청형 C 로타바이 러스는 6 (13.0%) 농가 17(5.7%)두, 칼리시바이러스는 2(4.3%) 농가 11 (3.7%)두 양성으로 검출되었다 인천지역의 분포가 2006년 장의 연구 결과보다 전체적으로 낮은 양상을 나타내었는데 이는 장의연구재료들은 전국 양돈장에서 심한 설사를 증상을 나타내는 분변을 사용하였으며 이번 실험은 임상증상이 전혀 없는 분변에서도 실험을 하였기 때문이다. 인천지역의 임상증상이 있는 시료에서는 혈청형 A 로타바이러스, 혈청형 C 로타바이러스와 칼리시바이러스가 15.
- 7%)에서 칼리시바이러스가 확인되었다. 전체적으로 46개 농가 중 16개(34.8%) 농가, 총 300개 분변중 44개(14.7%) 분변에서 장염 유발형 바이러스들이검출되었다(Table 2).
후속연구
- 돼지에서는 칼리시바이러스 중 사포 바이러스가 중요한 원인체이고 소에서는 노로바이러스가 장염을 일으키는 원인체로 알려졌으나 최근 연구에 따르면 돼지에서도 노로바이러스가 자주 검출되고있다(Keum 등, 2009). 돼지 칼리시바이러스 분리배양및 백신연구를 폭넓게 하고 이 결과를 활용한다면 백신 개발이 어려운 사람의 칼리시바이러스(노로바이러스) 연구에 토대를 제공할 수 있을 것으로 생각한다.
- 이번 연구를 통하여 돼지 장염 유발형 바이러스 중 혈청형 A 로타바이러스, 혈청형 C 로타바이러스 및 칼리시바이러스는 전국에 상재해 있는 양상과 비슷하게 인천 관내에서도 상재해 있으며 돼지 소모성 설사의 중요한 원인이 되고 있는 것을 확인할 수 있었다 전국 양돈장에 상재하여 설사의 원인으로 작용하는 장염 유발형 바이러스에 대한 더욱 정밀한 연구와 함께 새로운 백신 개발이 필요할 것으로 생각한다.
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