선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- [5, 15], 따라서 KI형 IB를 예방하기 위한 효과적인 새로운 IB 생독백신주의 개발이 필요한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 한국 호흡기형 IBV야외분리주를 종란 계대 배양을 통하여 약독화시켜 KI형 IB 생독 백신주를 개발하여, 국내에서 최근 유행하고 있는 IB에 대하여 생독 백신으로서의 방어효능을 평가하였다.
- 접종법을 사용하였다. 이러한 종란 계대 배양법은 IBV독력 순화과정에 잘 알려져 있는 고전적인 방법이다 [11-13, 18, 21, 22], 일부 백신 주의 경우 종란에 70 대 이하 계대 때까지는 여전히 IBV독력이 남아있고 [11, 21], 반면 일부 백신 주에서 보고된 바와 같이 종란에서 100대 이상 계대할 경우 오히려 방어효능이 저하되는 위험이 있기 때문에 [8, 21], IB 생독백신의 안전성과 방어효능을 충분히 확보하기 위하여 본 연구에서는 D85/ 06주를 89대까지 종란에 연속 계대하였다. 작성한 IBV 생독 백신주의 유전적 변이 여부를 조사한 결과에 의하면, 이러한 계대 배양과정에서 IBV S1 유전자의 56번째 아미노산이 치환(S—V되었음을 확인하였다.
제안 방법
- 실험에 사용된 모든 닭에 대하여 접종 후 5일째 인후두 도말을, 접종 14일째 실험종료 후 기관(trachea)과 신장(kidney)을 채취하여 바이러스 분리검사를 실시하였다. AVR1/08주의 면역원성 조사를 위하여 각 그룹별로 접종 전과 접종 14일 후에 각각 채혈하였다. 혈청 시료는 항체검사를 실시하기 전에 56℃ 30분 동안 비동화처리하였다.
- 이러한 결과로 볼 때, AVR1/08주 접종그룹의 경우 D85/0%주 접종그룹에 비해 보다 빨리 바이 러스가 감염 닭에서 제거됨을 알 수 있었다. IBV AVR1/06주 접종그룹의 경우 접종 전 및 접종 14일 후 각각 채혈한 혈청 시료를 대상으로indirect ELISA로 IBV 항체 형성 여부를 측정하였다. 그 결과 접종 닭 모두에서 ELISA 항체가 검춘되었다(Fig.
- IBV AVR1/08 주로 면역시킨 닭을 대상으로 최근 국내 유행하는 IBV에 대한 방어 효능을 측정하였다. 바이러스 병원성 측정은 AWR1/08주 접종그룹, H120주 접종그룹 그리고 대조군 등 네 그룹으로 나누었으며 그룹당 27수의 3주령 SPF닭이 사용되었다.
- IBV AVR1/08주의 병원성 회복 여부를 SPF닭 접종시험을 통하여 조사하였다. 이를 위하여 3~5일령 SPF 닭 최소 3수에 IBV AWR1/08주를 수당 0.
- IBV D85/06주를 종란에서 89대 연속 계대하여 AVRV 08 주를 작성하였다. 바이러스 계대수가 증가할수록 종란 치사시간이 점차적으로 단축되는 경향을 보였으며, 종란의 계태아 병변은 보다 명확하게 나타났다.
- KI형 IB생독 백신주를 개발하기 위하여 KI형 IBV D85/06 주를 종란접종법으로 9~11일령의 SPF 종란에 연속으로 계대하여 바이러스 독력을 순화시켰다. 즉 IBV D85/06 주를 9~11일령의 SPF 종란에 접종하고, 48~72 시간 배양 후에 종란의 allantoic fluid를 채독하여 0.
- IBV SI 와 IBV NP 유전자를 증폭하기 위한 PCRe Mase 등 [23]이 제시한 반응조건에 따라 실시하였다. RT-PCR 증폭 산물은 l%(w/v) 아가로스 겔에서 전기영동을 실시한 다음, Gel extraction kit(Qiagen)를 이용하여 RT-PCR 증폭 산물을 추출하여 마크로젠사(Macrogen, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 핵산 염기서열 교정(editing), 아미노산 서열예측 및 alignments는 MEGA version 4.
- 면역 후 3주가 경과한 시점에서 각 그룹은 다시 8수씩 세부 그룹을 나누었다. 각 그룹의 세부그룹별로 IBV Q43/06 주, KM91 주, D85/06주를 수당 104.5 EID50씩 점안으로 공격 접종을 실시하였다. 각 그룹별 남아있는 3 수의 닭은 백신대조 세부그룹으로 두었다.
- 이러한 결과는 AVR1/08 주는 종란 계대 과정에서 D85/06주의 병원성이 약 녹화되었으며, 닭에서 역계대 후에도 병원성이 회복되지 않았음을 보여준다. 각 접종그룹별 접종 닭으로부터 바이러스 감염 지속성 여부를 분석하기 위하여 접종 후 5일과 접종 후 14일 두 번에 걸쳐 바이러스 분리 실험을 실시하였다. 실험에 사용된 모든 닭에 대해 접종 5일째의 경우 인후두 노말(oropharyngeal swab)을, 실험종료 시 점인 접종 14일째 기관(trachea)와 신장(kidney)를 채취하여 바이러스 분리를 시도하였다.
- 4로 1 :100배 희석하여 동일한 방법으로 다시 새로운 SPF 종란에 접종하는 방법으로 IBV를 반복 계대하였다. 계대 배양한 IBV 는 매 10대 계대할 때마다 접종 종란의 allantoic fluid를 RT-PCR법으로 검사하여 IBV의 존재 여부를 조사하였다. IBV D85/06주를 SPF 종란에서 89대 연속 계대한다음 채독한 IBV를 AVR1/08 주로 명명하였다.
- 그 다음 본 연구에서 작성한 IBV AVR1/08주가 실제로 attenuation 되 었는 지 를 조사하기 위하여 SPF닭에 접종하여 병원성을 조사하였다. 비교분석을 위하여 AVRU 08주 접종그룹(n = 10), D85/06주 접종그룹(n = 10), 역계대 AVR1/08주 접종그룹(n= 10), 그리고 대조군 그룹(n = 10)을 두어 임상증상, 바이러스 재분리 등을 비교 조사하였다(Table 1).
- 각 그룹별 남아있는 3 수의 닭은 백신대조 세부그룹으로 두었다. 그 후 5일간 임상 증상 및 폐사여부를 관찰하고, 접종 5일째에 닭을 모두 안락사시킨 후 부검하여 병변을 관찰하였고, 바이러스 분리를 위하여 기관 및 신장 조직시료를 무균적으로 채취하였다. 장기로부터의 바이러스 분리 검사는 종란 내 접종법으로 실시하였다.
- 이들 조직 시료는 RT-PCR 방법으로 바이러스 존재 여부를 확인하였다. 그 후 기관을 무균적으로 유제한 다음 수당 0.1 mL씩 최소 3수씩 점안 접종하였다. 이러한 방법으로 닭에서 5회 반복 계대한 후, SPF 닭에서의 병원성을 조사하였다.
- IBV SI HVR증폭을 위한 primer set는 Mase 등 [23]이 사용한 forward primer IBV-S 1(5'AGGAATGGTAAGTTRCTR GTWAGAG-39 및 reverse primer IBV-S2(5, -GCCCAGT ACCRTTRAYAAAATAAGC-3')를 사용하였다. 그 다음, RT-PCRe 상기의 추출 유전자와 primer set를 사용하여 AccuPower RT/PCR premix kit로 실시하였다. IBV SI 와 IBV NP 유전자를 증폭하기 위한 PCRe Mase 등 [23]이 제시한 반응조건에 따라 실시하였다.
- 접종하여 방어 효능을 측정하였다. 닭에서의 방어효능은 Lee 등 [19]이 평가한 방범대로 공격 접종 5일 후기 관과 신장조직으로부터 바이러스 재분리 여부를 통하여 평가하였다(Table 2). IBV AVR1/08 주로 백신 접종한 닭에서는 IBV Q43/05주와 IBV KM91 주에 대하여 87.
- 배양 후 각 접종 종란의 allantoic fluid를 채취 하고 계태 아를 작출하였다. 바이 러스 증식 여부는 작출한 종란 계태아의 특징 적 인 소견(stunting, curling, dwarfing) 존재여부를 관찰하고, 동일 종란에서 채취한 allantoic fluid로부터 RT-PCR법으로 IBV특이 유전자 검출여부로 최종 확인하였다. 바이러스의 증식 역가는 종란의 50%를 감염시키는 바이러스액 희석 배수의 역수를 Reed 와 Muench [28]의 방법에 따라 계산하여 EID*나타내었다.
- 바이러스 병원성 측정은 D85/06주 접종그룹(n= 10), AWR1/08주 접종그룹(n= 14), 역계대 AVR1/0주 접종그룹(n = 10) 그리고 대조군(n = 10) 등 네 그룹으로 나누었으며 그룹당 10수의 SPF닭이 사용되었다. 바이러스 접종 그룹의 경우 IBV를 병아리 1수당 104.5EID*씩 바이러스를 점안 경로(eye drop)로 접종하였으며, 대조군의 경우 PBS 완충용액을 동일한 방법으로 접종하였다. 인공 감염 후 14일 동안 침울, 호흡기 증상 등 임상증상과 폐사 여부를 관찰하였다.
- 즉 10진 단계 희석한 바이러스액을 희석당 5개의 종란에 접종하여 상기와 같은 방법으로 37℃ 부란기에 넣고 5일간 배양하였다. 배양 후 각 접종 종란의 allantoic fluid를 채취 하고 계태 아를 작출하였다. 바이 러스 증식 여부는 작출한 종란 계태아의 특징 적 인 소견(stunting, curling, dwarfing) 존재여부를 관찰하고, 동일 종란에서 채취한 allantoic fluid로부터 RT-PCR법으로 IBV특이 유전자 검출여부로 최종 확인하였다.
- 본 연구에서 우리는 국내에서 주로 유행하는 KI형 IBV 국내 분리주인D85/06주를 선발하여 종란 계대 과정을 거쳐 IB 생독 백신주를 작성하였다. 본 연구에서 작성한 KI형 IB 생독 백신주는 다음과 같은 장점을 가질 수 있다.
- 본 연구에서 우리는 국내에서 주로 유행하는 한국 호흡 기형 (K-Ib) IBV D85/06주를 SPF 종란에서 89대 계대하여 IBV AVR1/08 생독 백신 주를 작성하였다. IBV AVR1/08 주는 D85/06주보다 약 20«1](1013) 높은 바이러스 증식 역가를 나타내었다.
- 본 연구에서 작성한 AVR1/08 주가 국내유행 IBV강독주에 대한 방어 효능이 있는 지를 조사하기 위하여, SPF 닭을AVR1/08 주로 면역 시킨 다음 3주 후 IBV로 공격 접종하여 방어 효능을 측정하였다. 닭에서의 방어효능은 Lee 등 [19]이 평가한 방범대로 공격 접종 5일 후기 관과 신장조직으로부터 바이러스 재분리 여부를 통하여 평가하였다(Table 2).
- 병원성을 조사하였다. 비교분석을 위하여 AVRU 08주 접종그룹(n = 10), D85/06주 접종그룹(n = 10), 역계대 AVR1/08주 접종그룹(n= 10), 그리고 대조군 그룹(n = 10)을 두어 임상증상, 바이러스 재분리 등을 비교 조사하였다(Table 1). D85/06 주 접종그룹의 경우 접종 3 일째부터 임상증상이 관찰되기 시작하였으며, 접종 5~6 일째 호흡기 증상이 가장 심하게 나타났다.
- 모든 실험은 음압이 유지되는 무균사육시설에서 실시하였다. 실험에 사용된 모든 닭에 대하여 접종 후 5일째 인후두 도말을, 접종 14일째 실험종료 후 기관(trachea)과 신장(kidney)을 채취하여 바이러스 분리검사를 실시하였다. AVR1/08주의 면역원성 조사를 위하여 각 그룹별로 접종 전과 접종 14일 후에 각각 채혈하였다.
- 각 접종그룹별 접종 닭으로부터 바이러스 감염 지속성 여부를 분석하기 위하여 접종 후 5일과 접종 후 14일 두 번에 걸쳐 바이러스 분리 실험을 실시하였다. 실험에 사용된 모든 닭에 대해 접종 5일째의 경우 인후두 노말(oropharyngeal swab)을, 실험종료 시 점인 접종 14일째 기관(trachea)와 신장(kidney)를 채취하여 바이러스 분리를 시도하였다. 그 결과, 접종 5일 후조사 결과, AVR1/08주 접종그룹, 역계대 AVR1/08주 접종그룹, D85/06주 접종그룹 모두 인후두 도말시료로부터 바이러스가 재분리되었다.
- 바이러스 RNA 추출은 Viral Gene-spin Viral DNA/RNA Extraction Kit(iNtRON Biotech, Korea)을 사용하여 제조사에서 권장하는 방법에 의거하여 실시하였다. 유전자 염기서열 분석을 위하여 IBV SI hyper-variable region(HVR) 과 NP 유전자를 증폭부위로 삼았다. IBV SI HVR증폭을 위한 primer set는 Mase 등 [23]이 사용한 forward primer IBV-S 1(5'AGGAATGGTAAGTTRCTR GTWAGAG-39 및 reverse primer IBV-S2(5, -GCCCAGT ACCRTTRAYAAAATAAGC-3')를 사용하였다.
- 접종 5일째 닭을 안락사시킨 후 기관을 채취하였다. 이들 조직 시료는 RT-PCR 방법으로 바이러스 존재 여부를 확인하였다. 그 후 기관을 무균적으로 유제한 다음 수당 0.
- 1 mL씩 최소 3수씩 점안 접종하였다. 이러한 방법으로 닭에서 5회 반복 계대한 후, SPF 닭에서의 병원성을 조사하였다.
- 통하여 조사하였다. 이를 위하여 3~5일령 SPF 닭 최소 3수에 IBV AWR1/08주를 수당 0.1 mL(1045 EID50) 씩 점안 접종하였다. 접종 5일째 닭을 안락사시킨 후 기관을 채취하였다.
- 5EID*씩 바이러스를 점안 경로(eye drop)로 접종하였으며, 대조군의 경우 PBS 완충용액을 동일한 방법으로 접종하였다. 인공 감염 후 14일 동안 침울, 호흡기 증상 등 임상증상과 폐사 여부를 관찰하였다. 모든 실험은 음압이 유지되는 무균사육시설에서 실시하였다.
- 3) 향상되었음을 나타낸다. 작성된 IB 생녹백신주AVR1/08주의 유전적 돌연변이 발생 여부를 조사하기 위하여, IBV SI HVR유전자 부위(약 640 bp)를 RT-PCR로 증폭하여 IBV D85/06주의 아미노산 염기서열과 비교 분석하였다. 그 결과 IBV AVR1/08 주의 S1 단백질의 56번째 아미노산이 serine(S)에서 tyrosine(Y)으로 대체되어 있었다.
- 그 후 5일간 임상 증상 및 폐사여부를 관찰하고, 접종 5일째에 닭을 모두 안락사시킨 후 부검하여 병변을 관찰하였고, 바이러스 분리를 위하여 기관 및 신장 조직시료를 무균적으로 채취하였다. 장기로부터의 바이러스 분리 검사는 종란 내 접종법으로 실시하였다.
- 계대하여 바이러스 독력을 순화시켰다. 즉 IBV D85/06 주를 9~11일령의 SPF 종란에 접종하고, 48~72 시간 배양 후에 종란의 allantoic fluid를 채독하여 0.01 M phosphate buffered saline(PBS), pH 7.4로 1 :100배 희석하여 동일한 방법으로 다시 새로운 SPF 종란에 접종하는 방법으로 IBV를 반복 계대하였다. 계대 배양한 IBV 는 매 10대 계대할 때마다 접종 종란의 allantoic fluid를 RT-PCR법으로 검사하여 IBV의 존재 여부를 조사하였다.
대상 데이터
- 농림 수산검 역 검 사본부 동식 물위 생 연구부 조류질병 과에서 보유중인 Kr/D85/06주, Kr/Q43/06주, H120주, KM91 주 등 4주의 IBV가 본 실험에서 사용되었다. Kr/ D85/06주는 심한 호흡기 증상을 나타내는 80일령 산란계에서 분리된 KI형 IBV이며, IBV Kr-Q43/06는 35일령 육계에서 분리된 QX타입 KII형 IBV이다 [17], 이 중 IBV Kr-D85/06주는 본 연구에서 KI형 IB생독백신주 개발을 위한 야외분리주로 선정 하여 사용되었다.
- 인공 감염 후 14일 동안 침울, 호흡기 증상 등 임상증상과 폐사 여부를 관찰하였다. 모든 실험은 음압이 유지되는 무균사육시설에서 실시하였다. 실험에 사용된 모든 닭에 대하여 접종 후 5일째 인후두 도말을, 접종 14일째 실험종료 후 기관(trachea)과 신장(kidney)을 채취하여 바이러스 분리검사를 실시하였다.
- 바이러스 병원성 측정은 AWR1/08주 접종그룹, H120주 접종그룹 그리고 대조군 등 네 그룹으로 나누었으며 그룹당 27수의 3주령 SPF닭이 사용되었다. 백신 접종군의 경우 AVR1/08 주와 H120주는 각각 수당 lOeEIDs。씩 점안으로 접종하였다.
- 조사하였다. 바이러스 병원성 측정은 D85/06주 접종그룹(n= 10), AWR1/08주 접종그룹(n= 14), 역계대 AVR1/0주 접종그룹(n = 10) 그리고 대조군(n = 10) 등 네 그룹으로 나누었으며 그룹당 10수의 SPF닭이 사용되었다. 바이러스 접종 그룹의 경우 IBV를 병아리 1수당 104.
- 바이러스 유전자의 추출을 위하여 증식 바이러스가 함유된 요막강액(allantoic fluid)를 사용하였다. 바이러스 RNA 추출은 Viral Gene-spin Viral DNA/RNA Extraction Kit(iNtRON Biotech, Korea)을 사용하여 제조사에서 권장하는 방법에 의거하여 실시하였다.
- 본 실험의 IBV에 대한 병원성은 5일령 SPF 닭에 접종하여 조사하였다. 바이러스 병원성 측정은 D85/06주 접종그룹(n= 10), AWR1/08주 접종그룹(n= 14), 역계대 AVR1/0주 접종그룹(n = 10) 그리고 대조군(n = 10) 등 네 그룹으로 나누었으며 그룹당 10수의 SPF닭이 사용되었다.
- 백신 접종군의 경우 AVR1/08 주와 H120주는 각각 수당 lOeEIDs。씩 점안으로 접종하였다. 음성 대조군은 3주령 SPF 닭 24수에 PBS 용액을 동일한 방법으로 접종한 것을 사용하였다. 면역 후 3주가 경과한 시점에서 각 그룹은 다시 8수씩 세부 그룹을 나누었다.
- 1 mL(1045 EID50) 씩 점안 접종하였다. 접종 5일째 닭을 안락사시킨 후 기관을 채취하였다. 이들 조직 시료는 RT-PCR 방법으로 바이러스 존재 여부를 확인하였다.
데이터처리
- RT-PCR 증폭 산물은 l%(w/v) 아가로스 겔에서 전기영동을 실시한 다음, Gel extraction kit(Qiagen)를 이용하여 RT-PCR 증폭 산물을 추출하여 마크로젠사(Macrogen, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 핵산 염기서열 교정(editing), 아미노산 서열예측 및 alignments는 MEGA version 4.0 을 이용한 Clustal W MehtodS- 분석하였다.
이론/모형
- 유전자 염기서열 분석을 위하여 IBV SI hyper-variable region(HVR) 과 NP 유전자를 증폭부위로 삼았다. IBV SI HVR증폭을 위한 primer set는 Mase 등 [23]이 사용한 forward primer IBV-S 1(5'AGGAATGGTAAGTTRCTR GTWAGAG-39 및 reverse primer IBV-S2(5, -GCCCAGT ACCRTTRAYAAAATAAGC-3')를 사용하였다. 그 다음, RT-PCRe 상기의 추출 유전자와 primer set를 사용하여 AccuPower RT/PCR premix kit로 실시하였다.
- 그 다음, RT-PCRe 상기의 추출 유전자와 primer set를 사용하여 AccuPower RT/PCR premix kit로 실시하였다. IBV SI 와 IBV NP 유전자를 증폭하기 위한 PCRe Mase 등 [23]이 제시한 반응조건에 따라 실시하였다. RT-PCR 증폭 산물은 l%(w/v) 아가로스 겔에서 전기영동을 실시한 다음, Gel extraction kit(Qiagen)를 이용하여 RT-PCR 증폭 산물을 추출하여 마크로젠사(Macrogen, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다.
- IBV 항체 역 가 측정은 indirect ELISA를 사용하여 측정하였다. 즉 PBS buffer로 1 μg/mL되게 희석한 IBV특이 단클론항체 3F5 [31]를 Maxisorp ELISA(Nunc, Roskilde, Denmark) plate의 각 well에 50 μL씩 첨 가하여 37℃에서 1시간 반응시켜 coating하였다.
- IBV의 증식성은 SPF 종란 접종법을 사용하여 측정하였다. 즉 10진 단계 희석한 바이러스액을 희석당 5개의 종란에 접종하여 상기와 같은 방법으로 37℃ 부란기에 넣고 5일간 배양하였다.
- IBV존재 여부는 역전사효소중합연쇄반응법(reverse transcriptase polymerase chain reaction: RT-PCR)로 확인하였다. 바이러스 유전자의 추출을 위하여 증식 바이러스가 함유된 요막강액(allantoic fluid)를 사용하였다.
- 바이러스 유전자의 추출을 위하여 증식 바이러스가 함유된 요막강액(allantoic fluid)를 사용하였다. 바이러스 RNA 추출은 Viral Gene-spin Viral DNA/RNA Extraction Kit(iNtRON Biotech, Korea)을 사용하여 제조사에서 권장하는 방법에 의거하여 실시하였다. 유전자 염기서열 분석을 위하여 IBV SI hyper-variable region(HVR) 과 NP 유전자를 증폭부위로 삼았다.
- 바이 러스 증식 여부는 작출한 종란 계태아의 특징 적 인 소견(stunting, curling, dwarfing) 존재여부를 관찰하고, 동일 종란에서 채취한 allantoic fluid로부터 RT-PCR법으로 IBV특이 유전자 검출여부로 최종 확인하였다. 바이러스의 증식 역가는 종란의 50%를 감염시키는 바이러스액 희석 배수의 역수를 Reed 와 Muench [28]의 방법에 따라 계산하여 EID*나타내었다.
- 본 연구에서 우리는 생독 백신주를 작성하기 위하여 종란 접종법을 사용하였다. 이러한 종란 계대 배양법은 IBV독력 순화과정에 잘 알려져 있는 고전적인 방법이다 [11-13, 18, 21, 22], 일부 백신 주의 경우 종란에 70 대 이하 계대 때까지는 여전히 IBV독력이 남아있고 [11, 21], 반면 일부 백신 주에서 보고된 바와 같이 종란에서 100대 이상 계대할 경우 오히려 방어효능이 저하되는 위험이 있기 때문에 [8, 21], IB 생독백신의 안전성과 방어효능을 충분히 확보하기 위하여 본 연구에서는 D85/ 06주를 89대까지 종란에 연속 계대하였다.
성능/효과
- 또한 IBV AWR1/06주를 접종한 SPF 닭에서 모두 IBV항체가 형성되었다. IBV AVRV 08 주의 SPF 닭에서의 방어효능을 조사한 결과, OX 타입 KII형(IBV AVR1/08 주)과 KM91 타입 KII형(IBV KM91 주)에 대하여 87.5%, KI형 (IBV D85/06주)에 대하여 100% 방어율을 나타내었다. 결론적으로 본 연구에서 작성 한 IBV AVR1/08주는 현재 국내에서 유행하고 있는 KI형 IB뿐만 아니라 QX타입 KII형 IB에 대하여 방어효능을 발휘하였다.
- 5%, KI형 (IBV D85/06주)에 대하여 100% 방어율을 나타내었다. 결론적으로 본 연구에서 작성 한 IBV AVR1/08주는 현재 국내에서 유행하고 있는 KI형 IB뿐만 아니라 QX타입 KII형 IB에 대하여 방어효능을 발휘하였다.
- 작성된 IB 생녹백신주AVR1/08주의 유전적 돌연변이 발생 여부를 조사하기 위하여, IBV SI HVR유전자 부위(약 640 bp)를 RT-PCR로 증폭하여 IBV D85/06주의 아미노산 염기서열과 비교 분석하였다. 그 결과 IBV AVR1/08 주의 S1 단백질의 56번째 아미노산이 serine(S)에서 tyrosine(Y)으로 대체되어 있었다. 이 부위에서의 아미노산 돌연변이는 47대 계대 이후 일관성 있게 나타났다<Fig.
- IBV AVR1/06주 접종그룹의 경우 접종 전 및 접종 14일 후 각각 채혈한 혈청 시료를 대상으로indirect ELISA로 IBV 항체 형성 여부를 측정하였다. 그 결과 접종 닭 모두에서 ELISA 항체가 검춘되었다(Fig. 2). 이러한 결과는 AVR1/08주를 접종 후 접종 닭 모두에서 IBV에 대한 면역반응이 유도되었음을 말해 준다.
- 실험에 사용된 모든 닭에 대해 접종 5일째의 경우 인후두 노말(oropharyngeal swab)을, 실험종료 시 점인 접종 14일째 기관(trachea)와 신장(kidney)를 채취하여 바이러스 분리를 시도하였다. 그 결과, 접종 5일 후조사 결과, AVR1/08주 접종그룹, 역계대 AVR1/08주 접종그룹, D85/06주 접종그룹 모두 인후두 도말시료로부터 바이러스가 재분리되었다. 그러나, 접종14일 후 조사 결과, D85/06주 접종그룹의 경우 바이러스 재분리율이 80%(8/10)인데 반하여 AVR1/08주 접종그룹의 경우 바이러스 재분리율은 40%(4/10)이었다.
- 그 결과, 접종 5일 후조사 결과, AVR1/08주 접종그룹, 역계대 AVR1/08주 접종그룹, D85/06주 접종그룹 모두 인후두 도말시료로부터 바이러스가 재분리되었다. 그러나, 접종14일 후 조사 결과, D85/06주 접종그룹의 경우 바이러스 재분리율이 80%(8/10)인데 반하여 AVR1/08주 접종그룹의 경우 바이러스 재분리율은 40%(4/10)이었다. 대조군 그룹의 경우 접종 5일째와 14일째 어떠한 바이러스도 분리되지 않았다.
- 둘째, 국내에서 유행하는 IBV유래 백신주는 모두 KII형백신주이며 현재까지 KI형 백신주는 개발되어 있지 않은 실정이다. 그러므로 본 연구의 KI형 생독 백신 주를 백신 기초면역하고 KII형 백신주로 보강접종을 실시할 경우 국내에서 유행하는 KI형 IB 및 KII형 IB에 대하여 광범위 방어면역 (broad protection) 효과를 유발할 수 있다 [2], 셋째, 본 연구에서 작성한 AVR1/08주는 호흡기 친화성 바이러스이기 때문에 [17], AWR1/08주를 생독 백신으로 사용할 경우 호흡기 점막에 강한 국소 점막 면역을 유발할 수 있다. 넷째, KI형 IBV는 KII형 IBV에 비해 닭에서의 병원성이 상대적으로 약한 IBV이기 때문에 약독화 과정 후에 병원성 복귀로 인한 피해 위험이 매우 낮다.
- 그러므로 본 연구의 KI형 생독 백신 주를 백신 기초면역하고 KII형 백신주로 보강접종을 실시할 경우 국내에서 유행하는 KI형 IB 및 KII형 IB에 대하여 광범위 방어면역 (broad protection) 효과를 유발할 수 있다 [2], 셋째, 본 연구에서 작성한 AVR1/08주는 호흡기 친화성 바이러스이기 때문에 [17], AWR1/08주를 생독 백신으로 사용할 경우 호흡기 점막에 강한 국소 점막 면역을 유발할 수 있다. 넷째, KI형 IBV는 KII형 IBV에 비해 닭에서의 병원성이 상대적으로 약한 IBV이기 때문에 약독화 과정 후에 병원성 복귀로 인한 피해 위험이 매우 낮다.
- 흡광도는 ELISA reader(Tecan, Austria)를 이용하여 A450nm에서 측정하였다. 동일 희석배수에서의 음성혈청의 평균 흡광도에 표준편차 3배를 더한 값(mean OD + 3SD)보다 클 경우 ELISA 반응이 유의한 것 (항체 양성반응)으로 판단하였다.
- [2]. 둘째, 국내에서 유행하는 IBV유래 백신주는 모두 KII형백신주이며 현재까지 KI형 백신주는 개발되어 있지 않은 실정이다. 그러므로 본 연구의 KI형 생독 백신 주를 백신 기초면역하고 KII형 백신주로 보강접종을 실시할 경우 국내에서 유행하는 KI형 IB 및 KII형 IB에 대하여 광범위 방어면역 (broad protection) 효과를 유발할 수 있다 [2], 셋째, 본 연구에서 작성한 AVR1/08주는 호흡기 친화성 바이러스이기 때문에 [17], AWR1/08주를 생독 백신으로 사용할 경우 호흡기 점막에 강한 국소 점막 면역을 유발할 수 있다.
- 주를 작성하였다. 바이러스 계대수가 증가할수록 종란 치사시간이 점차적으로 단축되는 경향을 보였으며, 종란의 계태아 병변은 보다 명확하게 나타났다. 또한 바이러스의 증식성은 계대수가 40대 이하에서는 바이러스 증식성의 차이는 없었으나 47대 이후부터는 바이러스 증식성이 증가하기 시작하였다.
- 5%(3/8)을 나타내었다. 백신접종을 실시하지 않는 닭에 IBV Q43/06주, IBV KM91 주 및 IBV D85/06주를 공격 접종한 닭의 경우 모두 IBV가 검출되었다. 공격 접종을 하지 않은 대조군 그룹의 경우 어떤 닭에서도 IBV 가 검출되지 않았다.
- IBv AVR1/08주의 S1 단백질 염기서열을 분석한 결과 D85/06주의 56번째 아미노산이 serine(S)에서 tyrosine(Y)으로 치환되어 있었다. 본연구에서 작성된 IBV AWR1/06주는 SPF 닭에 인공감염시켰을 때 어떠한 호흡기 증상도 나타내지 않았으며, SPF 닭에서 6대 역계대를 실시한 후에도 바이러스의 병원성은 회복되지 않았다. 또한 IBV AWR1/06주를 접종한 SPF 닭에서 모두 IBV항체가 형성되었다.
- 또한 역계대 AVR1/08주 접종그룹의 경우에도 실험기간 동안 어떠한 임상 증상 노 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 AVR1/08 주는 종란 계대 과정에서 D85/06주의 병원성이 약 녹화되었으며, 닭에서 역계대 후에도 병원성이 회복되지 않았음을 보여준다. 각 접종그룹별 접종 닭으로부터 바이러스 감염 지속성 여부를 분석하기 위하여 접종 후 5일과 접종 후 14일 두 번에 걸쳐 바이러스 분리 실험을 실시하였다.
- 대조군 그룹의 경우 접종 5일째와 14일째 어떠한 바이러스도 분리되지 않았다. 이러한 결과로 볼 때, AVR1/08주 접종그룹의 경우 D85/0%주 접종그룹에 비해 보다 빨리 바이 러스가 감염 닭에서 제거됨을 알 수 있었다. IBV AVR1/06주 접종그룹의 경우 접종 전 및 접종 14일 후 각각 채혈한 혈청 시료를 대상으로indirect ELISA로 IBV 항체 형성 여부를 측정하였다.
- 이러한 종란 계대 배양법은 IBV독력 순화과정에 잘 알려져 있는 고전적인 방법이다 [11-13, 18, 21, 22], 일부 백신 주의 경우 종란에 70 대 이하 계대 때까지는 여전히 IBV독력이 남아있고 [11, 21], 반면 일부 백신 주에서 보고된 바와 같이 종란에서 100대 이상 계대할 경우 오히려 방어효능이 저하되는 위험이 있기 때문에 [8, 21], IB 생독백신의 안전성과 방어효능을 충분히 확보하기 위하여 본 연구에서는 D85/ 06주를 89대까지 종란에 연속 계대하였다. 작성한 IBV 생독 백신주의 유전적 변이 여부를 조사한 결과에 의하면, 이러한 계대 배양과정에서 IBV S1 유전자의 56번째 아미노산이 치환(S—V되었음을 확인하였다. 향후 IBV S1 유전자의 56번째 아미노산의 치환이 약독화나 바이러스 증식성에 어떠한 영향을 미치는 지에 대한 추가 연구가 필요하다.
- 본 연구에서 작성한 KI형 IB 생독 백신주는 다음과 같은 장점을 가질 수 있다. 첫째, 국내에서 유행하는 바이러스로 만든 백신 주이기 때문에 혈청형이 다른 생독 백신주를 사용하였을 때 나타날 수 있는 불완전한 교차면역으로 인한 야외바이러스의 변이 위험성을 최소화할 수 있다. [2].
- 최근 최 등의 연구결과에 의하면 QX타입 KII형 IBV는 KM91 타입 KII형 IBV와 유의성이 있는 항원적 차이가 존재하고 있는 것으로 보고되었다 [5], 신장형 IB의 경우 90년대부터 2000년대 중반까지 주로 KM91 타입 KII 형 IB가 유행하였으며, 2000년 중반 이후에는 QX타입 KII형 IB의 유행이 두드러지고 있는 상황이다 [17, 18, 20], 이러한 국내 IB 유행양상의 변화는 90년대 말 이후 국내에서 KM91 타입 KII백신의 광범위한 사용과도 어느 정도 관련성이 있어 보인다. 흥미롭게도 본 연구에서 작성한 IBV AVR1/08주는 현재 국내에서 유행하고 있는 KI형 IB뿐만 아니라 QX타입 KII형 IB에 대해서도 87.5%의 방어효과를 나타내었다. IBV의 경우 심지어, 간혹 실험적 조건하에서 homologous strain으로 생독 백신을 접종한 경우에서도 10% 의 닭에서는 방어면역을 형성되지 않는다는 연구결과들이 여러 연구자들에 의해 보고되고 있는 점을 감안한다면 [2, 3, 7, 10, 25, 27], 본연구에서의 QX타입 KII형 IB에 대한 방어 효과가 인정된다고 판단할 수 있다.
후속연구
- [4], IBV는 현재 전 세계적으로 수 백개 이상의 다양한 혈청형이 존재하고 있는 것으로 추정되고 있다. [2], IBV 혈청형은 지역별로 다양하게 나타나고 있기 때문에 그 지역에서 유행하는 바이러스와 동일한 바이러스 혈청형으로 제조한 백신을 사용하여야 가장 이상적인 예방 효과를 기대할 수 있다. [2],
- 다만 IB방어면역에서 체액성 면역(humoral immunity)뿐만 아니라 세포매개성 면역 (cellular mediated immunity)도 IB 방어에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에 [6, 30], cytotoxic T cell에 의한 세포매개성 면역 (cellular immunity)을 유도하는 IBV NP단백질이 관련되어 있을 가능성이 있다. 또한 IB 국내분리주중 호흡기형 IBV의경우 신장형 IB까지 교차방어 효능을 보이는 예가 현재까지 보고가 본 연구에서는 처음으로 국내 호흡기 형 IBV 분리주를 이용한 백신 후보주가 국내 신장형 IBV감염을 거의 완벽히 방어하는 효능을 보이는 결과가 나와 KM91 형과QX형 재조합 IBV 등 다양한 유전적 유형의 IBV가 국내에 존재하므로 [15, 16, 20, 26], 개발 백신 주가 이들 바이러스에 대한 광범위한 방어효능을 가지고 있을 지는 추가적으로 확인해 볼 필요가 있다. 또한 본연구에서는 점안접종법을 이용하여 개발백신주의 면역원성과 안전성 시험을 평가하였기 때문에 현재 야외농장에서 IB피해 예방을 위한 백신으로 상용화되기 위해서는 1일령 병아리에서의 분무 접종이나 농장에서의 음수 접종 등 다른 접종경로로 접종하여 안전성과 면역원성을 확인할 필요가 있다.
- 또한 IB 국내분리주중 호흡기형 IBV의경우 신장형 IB까지 교차방어 효능을 보이는 예가 현재까지 보고가 본 연구에서는 처음으로 국내 호흡기 형 IBV 분리주를 이용한 백신 후보주가 국내 신장형 IBV감염을 거의 완벽히 방어하는 효능을 보이는 결과가 나와 KM91 형과QX형 재조합 IBV 등 다양한 유전적 유형의 IBV가 국내에 존재하므로 [15, 16, 20, 26], 개발 백신 주가 이들 바이러스에 대한 광범위한 방어효능을 가지고 있을 지는 추가적으로 확인해 볼 필요가 있다. 또한 본연구에서는 점안접종법을 이용하여 개발백신주의 면역원성과 안전성 시험을 평가하였기 때문에 현재 야외농장에서 IB피해 예방을 위한 백신으로 상용화되기 위해서는 1일령 병아리에서의 분무 접종이나 농장에서의 음수 접종 등 다른 접종경로로 접종하여 안전성과 면역원성을 확인할 필요가 있다.
- 작성한 IBV 생독 백신주의 유전적 변이 여부를 조사한 결과에 의하면, 이러한 계대 배양과정에서 IBV S1 유전자의 56번째 아미노산이 치환(S—V되었음을 확인하였다. 향후 IBV S1 유전자의 56번째 아미노산의 치환이 약독화나 바이러스 증식성에 어떠한 영향을 미치는 지에 대한 추가 연구가 필요하다. 그러나 SI HVR 부위에서의 다른 변이부위는 관찰되지 않아 다른 IBV 생독 백신 주의 작성과정에 나타난 돌연변이 빈도에 비해 상대적으로 적게 나타났다 [1, 11, 12, 18], 바이러스 돌연변이 빈도수의 차이에 대한 원인은 본 연구에서 구명할 수 없었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.