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문제 정의
- 이 연구는 국내 한우 및 젖소 농장에서 분리된 브루셀라 균의 병원성을 분석하기 위하여 탐식세포 및 실험동물 감염을 수행하여 비교 분석 하였으며, 각 분리 주에 대하여 세균학적 및 분자생물학적 방법을 이용 특성을 규명하였다. 본 연구결과는 국내 한우 및 유우 농장에서 브루셀라 감염증을 유발하는 원인체에 대한 특징을 규명함은 물론, 브루셀라 감염증 연구를 위한 역학적 기초자료로 활용 될 수 있을 것이다.
제안 방법
- [9, 10]. 12 well plate에 멸균된 cover glass 를 넣은 후 RAW 264.7 세포에 MO1 10의 농도로 브루셀라 균을 감염시킨 후 16% parafixmaldehyde와 stock A solution(0.2M lysine 0.9 g+ 8% sucrose 2 g + 25 mL PBS)N로 고정 하고, anti-LAMP-1 rat monoclonal antibody 1D4B로 염색한 후 Texas red-goat anti-rat immunog lobulin G(Santa Cruz Biotechnology, USA)로 염색하였다. 세균을 동정하기 위하여 anti-B.
- 탐식세포 내 침입과 증식 능력 실험은 Kim 등 [9]의 방법에 준하여 수행하였다. B. abortus 544 표준주와 야외주는 10% FBS가 함유된 RPM1 1640에서배양된 RAW 264.7 세포에 감염시켰으며, 0, 15, 30분경과 후 각 균주 별 세포 내 세균 침입능력을 확인하였다. 세포 내 증식능력을 측정하기 위해서 감염된 세포를 37。。에서 30분간 배양한 후 gentamicin을 30 jig/mL 농도로 첨가하고 2, 24 및 48시간 경과 후 세포 내 증식능력을 확인하였고, 각 실험은 세포를 lysis시킨 후 세균이 포함된 상층액을 Brucella agar게서 48시간 배양하여 CFU(colony forming unit)를 측정하였다.
- abortus polyclonal rabbit serum과 FITC-conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G(Santa Cruz Biotechnology, USA)로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다. LAMP-1 과의 융합 정도는 3회에 걸쳐 RAW 264.7 세포 100개를 무작위로 선발하고 브루셀라 균을 포함한 phagosome과 LAMP-1 단백과의 colo- calization을 확인하였다.
- 7 세포에 부착된 균은 anti-B. abortus polyclonal rabbit serum과 37℃ 에서 30분간 반응을 한 후, phosphate buffered saline(PBS) 로 3회 의 세 척 과정 을 거쳐 fluorescein isothiocyanate (FlTC)-conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G (Santa Cruz Biotechnology, USA)로 1시간 염색한 후 3 회의 세척과정을 거쳐 형광현미경을 통해 관찰하였다.
- 세균을 동정하기 위하여 anti-B. abortus polyclonal rabbit serum과 FITC-conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G(Santa Cruz Biotechnology, USA)로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다. LAMP-1 과의 융합 정도는 3회에 걸쳐 RAW 264.
- 7 세포에 감염시켰으며, 0, 15, 30분경과 후 각 균주 별 세포 내 세균 침입능력을 확인하였다. 세포 내 증식능력을 측정하기 위해서 감염된 세포를 37。。에서 30분간 배양한 후 gentamicin을 30 jig/mL 농도로 첨가하고 2, 24 및 48시간 경과 후 세포 내 증식능력을 확인하였고, 각 실험은 세포를 lysis시킨 후 세균이 포함된 상층액을 Brucella agar게서 48시간 배양하여 CFU(colony forming unit)를 측정하였다.
- ICR mice 복강 내로 감염시켰다. 감염 후 14일 경과 후 감염마우스의 비장을 제거한 후 비장무게와 비장 내 존재하는 브루셀라 균을 측정하였다.
- 하였다. 단백질은 nitrocellulose membranes (Millipore, USA)로 옮긴 후, horseradish peroxidase- conjugated streptavidin(Santa Cruz Biotechnology, US A)으로 반응하고 ECL(Intron, Korea)반응하여 관찰하였다.
- 본 실험에서 2009년도 국내 경북지역 한우 및 유우 농가에서 발생한 브루셀라 감염우를 통해 브루셀라 균을 분리하였으며, AMOS PCR을 통해 분리된 균 12주 모누 B. abortus임을 확인 하였고, 이들 분리주의 병원성 및 특성을 분석하였다. 브루셀라균은 대표적인 탐식세포 내 기생세균의 하나로서, 숙주의 탐식세포 내 증식하며 질병을 유발하는 특징을 보인다 [1].
- 브루셀라균은 대표적인 탐식세포 내 기생세균의 하나로서, 숙주의 탐식세포 내 증식하며 질병을 유발하는 특징을 보인다 [1]. 본 실험에서는 생쥐 유래 대식 세포의 하나인 RAW 264.7 세포를 이용하여 대식세포 내 침입능력을 토대로 세 개의 그룹으로 나뉘었으며, 각 그룹은 class I: 표준주에 비해 낮은 세포 내 침입능, class 11: 표준주에 비해 유사한 침입능, class 111: 표준주에 비해 높은 침입능을 보이는 그룹으로 명명하였다. 농장 별 분리주에 대한 세포내 침입능력은대체적으로 유사한 패턴을 보였으나, 한우 2농가에서 분리된 5균주는 같은 농가에서 분리된 균주 임에도 불구하고 상이한 세포 내 침입능력을 보여 한 농장 내에서 다양한 침입양상을 보이는 균주가 복합적으로 감염되어있는 것으로 나타났다.
- 본 연구에서는 브루셀라병 양^으로 판정되어 살처분된 소의 유방상림프절에서 12종의 브루셀라 균을 분리하고, AMOS PCR로 B. abmhis임을 확인한 후 야외 주와 표준주의 병원성에 대한 특성을 규명하였다. 브루셀라 야외주 12주와 표준주를 대상으로 생쥐 유래 대식세포인 RAW 264.
- abortus^- 판명하였 triable 1). 분리된 12주와 표준주 B. abortus 544를 RAW 264.7 세포에 감염을 하여 bacterial inlemalization능력에따라 3개의 class로 나누었다. Class I은 표준주에 비해낮은 침입능력을 가지는 그룹, class 11는 표준주와 비슷한 능력을 가지는 그룹, class III는 표준주보다 높은 bacterial intemalization 능력을 가지는 그룹으로 분리 하였고, class I에 속하는 야외주는 KI K2 K3 K4 K7 K8 Hl H2, class I] 에 속하는 야외주는 K6과 K9, 그리고 class II]에 속하는 K5, H3분리주로 나뉘었다(Thble 1).
- 브루셀라 균 표면 단백질의 특성을 조사하기 위하여 1% Sulfo-NHS-Biotin(Pierce, USA)에 감작시킨 브루셀 eRj을 10%의 sodium dodecyl sulfate-polyactylamide gel electrophoresis를 하였다. 단백질은 nitrocellulose membranes (Millipore, USA)로 옮긴 후, horseradish peroxidase- conjugated streptavidin(Santa Cruz Biotechnology, US A)으로 반응하고 ECL(Intron, Korea)반응하여 관찰하였다.
- 브루셀라 균의 병원성을 확인하기 위하여, 각 균주를 1O4CFU^| 농도로 희석시킨 후 다섯 마리의 8주 령 암컷 ICR mice 복강 내로 감염시켰다. 감염 후 14일 경과 후 감염마우스의 비장을 제거한 후 비장무게와 비장 내 존재하는 브루셀라 균을 측정하였다.
대상 데이터
- 2009년 1월부터 2009년 10월까지 국내 경북 지역 한우농가 4곳과 유우농가 3곳으로부터 김 등 [2]의 방법에 따라 브루셀라 균을 분리하였다. 표준주 B.
- RAW 264.7 세포는 5% CO2, 37℃ 환경에서 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 RPM1 1640배지를 이용하여 배양하였다. 탐식세포 내 침입과 증식 능력 실험은 Kim 등 [9]의 방법에 준하여 수행하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였으며, 실험결과는 Student's f-test를 이용하여 통계처리를 수행하였다. p< 0.
이론/모형
- LAMP-1 staining은 이전에 기술된 방법을 사용하여수행하였다 [9, 10]. 12 well plate에 멸균된 cover glass 를 넣은 후 RAW 264.
- 7 세포는 5% CO2, 37℃ 환경에서 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 RPM1 1640배지를 이용하여 배양하였다. 탐식세포 내 침입과 증식 능력 실험은 Kim 등 [9]의 방법에 준하여 수행하였다. B.
- 탐식세포와 브루셀라 균의 부착 정도를 확인하기 위하여 이전에 기술된 방법을 사용하여 수행하였다 [9, 10]. 멸균된 유리 disk가 있는 12 well plate에 배양된 RAW 264.
- 브루셀라 균을 분리하였다. 표준주 B. abortus 544 와 분리한 야외주 12주를 DNA kit(Qiagen, Germany)를이용하여 DNA를 추출 하였고, 브루셀라 균의 subtype 규명을 위해 1S711 element(AMOS)에 기초하여 primer 를 설계한 후 전문제조회사(Bioneer, Korea)에 의뢰하여 제조하였으며, 반응조건 및 증폭산물의 확인은 김 등 [2] 의 방법에 준하여 수행하였다.
성능/효과
- 이들 야외주 중 각 class 대표 균주인 K3. K9및 K5를 선발하였으며, 선발된 균주의 RAW 264.7 세포 내 침입능력을 비교해 본 결과 K3 균주는 표준주에 비해 낮은침입능력을 보였고, K9균주는 유사한 침입능력을 보였으며(Fig. 1A), K5균주는 현저히 높은 RAW 264.7 세포내 침입능력을 보였고, 세포 내 증식능력 실험에서 K3, K9 및 K5균주 모두 감염 후 48시간 동안 표준주와 비슷한 증식능력이 인정 되었다(Fig. IB).
- RAW 264.7 세포와 각 균주 간 adherence asset를 수행해본 결과 K9 및 K5 균주는 표준주와 유사한 부착 능을 보였으나, K3균주는 표준주에 비해 낮은 부착능력을 보였다(Fig. 2). 탐식세포 내 탐식 경로를 확인하기 위하여 lysosome associated membrane protein-1 (LAMP-1) proteir과 brucella conlairing phagosome과의 colocalization 정도를 확인해본 결과, K3 균주는 표준주에 비해 높은 colocalization을 보였고, K9 균주는 유사하였으며, K5 균주는 낮은 colocalization을 보였다(Fig.
- Rose Bangal test와 tube agglutination test에서 브루셀라 양으로 확인된 경북 지역의 한우 농장 4곳 또는 젖소 농장 3곳의 유방상림프절로부터 12종의 야외주를 분리하였고, AMOS PCR 결과 498 bp에서 B. abortus^ 특이적인 band가 증폭되어 모두 B. abortus^- 판명하였 triable 1). 분리된 12주와 표준주 B.
- 이러한 이유는 본 연구에서 정확하게 규명 할 수 없었으나, 외부에서 소를 구입하였거나, 외부 출입 차량 및 야생동물에 의하여 외부에서 유입된 균주가 혼합 감염되어 있을 가능성이 있는 것으로 판단된다. 각 class의 대표적 균주를 선발하여 세포 내 증식능력을 비교해 본 결과 class 1, 11 및 III의 대표 균주 모두 표준주와 비교하여 유사한 세포 내 증식 능력을 보였다.
- 각 균주의 실험동물 내 병원성을 확인하기 위하여 mouse 접종시험을 수행해본 결과 K3 및 K5번 균주는표준주에 비하여 비교적 접종 마우스의 비장내 균수가증가된 양상을 보였고, 유사한 비장 종대가 인정되었으나, K9 균주는 표준주에 비해 현저히 낮은 비장 내 균증식과 비장 종대가 인정되었다(Fig. 5).
- 7 세포 내 침입능력을 확인 해 본 바, 각 야외 주들은 표준주에 비해 다양한 양상을 보였으며, 이들 토대로 야외주를 세 개의 그룹으로 나눌 수 있었다. 각 그룹의 대표 균주를 선발하여, RAW 264.7 세포 내 증식능력, 세포 부착능력, 표면단백 형태, 탐식세포 내 탐식 경로 및 마우스 병원성 실험을 수행해 본 결과 탐식세포 내 침입능력이 높을수록 병원성이 높게 나타나는 것으로 나타났다. 본 결과를 통하여 국내 한우 및 젖소 농가에서 발생 된 브루셀라 감염증은 다양한 병원성을 보이는 B.
- 7 세포를 이용하여 대식세포 내 침입능력을 토대로 세 개의 그룹으로 나뉘었으며, 각 그룹은 class I: 표준주에 비해 낮은 세포 내 침입능, class 11: 표준주에 비해 유사한 침입능, class 111: 표준주에 비해 높은 침입능을 보이는 그룹으로 명명하였다. 농장 별 분리주에 대한 세포내 침입능력은대체적으로 유사한 패턴을 보였으나, 한우 2농가에서 분리된 5균주는 같은 농가에서 분리된 균주 임에도 불구하고 상이한 세포 내 침입능력을 보여 한 농장 내에서 다양한 침입양상을 보이는 균주가 복합적으로 감염되어있는 것으로 나타났다. 이러한 이유는 본 연구에서 정확하게 규명 할 수 없었으나, 외부에서 소를 구입하였거나, 외부 출입 차량 및 야생동물에 의하여 외부에서 유입된 균주가 혼합 감염되어 있을 가능성이 있는 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 class 1 균주는 표준주에 비해 다소 높은 lysosome fbsion을 보이고 있으나, 탐식세포 내 증식및 마우스 접종시험에서 표준주와 유사한 비장 내 증식능력을 보이는 것으로 나타났다. 이와는 반대로 class II 균주는 표준주와 유사한 lysosome fusion을 보이고 유사한 탐식세포 내 증식능력을 보이고 있지만, 마우스 접종시험에서 표준주에 비해 현저히 저하된 비장 내 증식능력을 보였다.
- 또한 브루셀라 균 표면단백 중 하나인 SP41 이 브루셀라 균의 탐식세포 내 침입 및 부착에 중요한 역할을 하는 것으로 보고하였다 [6]. 본 연구에서 수행한 브루셀라 야외주의 표면단백 pattern을 표준주와 비교해본 결과 class I의 경우 약 45-50kDa 정도에서 표준 주에 비해 미약한 표면단백이 나타났으며, 이 균주는 표준 주에 비해 낮은 탐식세포 내 침입능력과 부착능력을 보였다. 이에 반해 class 111 균주의 경우 표준주에 비해 10종 이상의 표면단백을 보유하고 있는 것으로 나타났으며, 이 균주는 표준주에 비해 높은 탐식세포 내 침입능력과 부착능력을 보였다.
- abmhis임을 확인한 후 야외 주와 표준주의 병원성에 대한 특성을 규명하였다. 브루셀라 야외주 12주와 표준주를 대상으로 생쥐 유래 대식세포인 RAW 264.7 세포 내 침입능력을 확인 해 본 바, 각 야외 주들은 표준주에 비해 다양한 양상을 보였으며, 이들 토대로 야외주를 세 개의 그룹으로 나눌 수 있었다. 각 그룹의 대표 균주를 선발하여, RAW 264.
- 야외 분리균주들의 표면 단백질을 분석해 본 결과, K3 및 K9 균주는 표준주와 거의 비슷한 양상을 나타낸 반면, K5 균주는 표준주에 비해 35 kDa 이상에서 10개 이상의 많은 표면단백을 보유하고 있음이 확인되었다(Fig. 4).
- 이에 반해 class 111 균주의 경우 표준주에 비해 10종 이상의 표면단백을 보유하고 있는 것으로 나타났으며, 이 균주는 표준주에 비해 높은 탐식세포 내 침입능력과 부착능력을 보였다. 이상의 결과를 토대로 브루셀라 균의 표면단백 이 탐식세포 내 침 입 및 부착에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
- 본 연구에서 수행한 브루셀라 야외주의 표면단백 pattern을 표준주와 비교해본 결과 class I의 경우 약 45-50kDa 정도에서 표준 주에 비해 미약한 표면단백이 나타났으며, 이 균주는 표준 주에 비해 낮은 탐식세포 내 침입능력과 부착능력을 보였다. 이에 반해 class 111 균주의 경우 표준주에 비해 10종 이상의 표면단백을 보유하고 있는 것으로 나타났으며, 이 균주는 표준주에 비해 높은 탐식세포 내 침입능력과 부착능력을 보였다. 이상의 결과를 토대로 브루셀라 균의 표면단백 이 탐식세포 내 침 입 및 부착에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
- 본 연구에서 class 1 균주는 표준주에 비해 다소 높은 lysosome fbsion을 보이고 있으나, 탐식세포 내 증식및 마우스 접종시험에서 표준주와 유사한 비장 내 증식능력을 보이는 것으로 나타났다. 이와는 반대로 class II 균주는 표준주와 유사한 lysosome fusion을 보이고 유사한 탐식세포 내 증식능력을 보이고 있지만, 마우스 접종시험에서 표준주에 비해 현저히 저하된 비장 내 증식능력을 보였다. 본 결과를 토대로 브루셀라 야외주의 병원성 발현에 있어 탐식세포의 lysosome 이외에도 다양한균 측 및 숙주 측 요인이 작용할 것으로 판단된다.
- 2). 탐식세포 내 탐식 경로를 확인하기 위하여 lysosome associated membrane protein-1 (LAMP-1) proteir과 brucella conlairing phagosome과의 colocalization 정도를 확인해본 결과, K3 균주는 표준주에 비해 높은 colocalization을 보였고, K9 균주는 유사하였으며, K5 균주는 낮은 colocalization을 보였다(Fig. 3).
- 표준주에 비해 높은 탐식세포 내 침입능력을 보인 class Ill 균주는 마우스 접종시험에서 표준주에 비해 높은 비장 내 증식 능력을 보이는 것으로 나타나, 야외주의 탐식세포 내 침입능력에 비례해 실험동물 내 높은 병원성을 보이는 것으로 판단된다. Kim 등 [9]은 브루셀라균의 유전자 변형을 통해 저병원성 변이주에 대한 특성을 분석하여, 표준주에 비해 높은 세포 내 침입능력을보이지만 낮은 세포 내 증식능력과 마우스 접종시험에서도 낮은 병원성을 보이는 변이주를 규명하였다.
후속연구
- 결과적으로 본 실험 결과는 국내 한우 및 유우 농가에서 발생하는 브루셀라 감염증의 특징과 병원성에 대한 기초로 사용될 것이며, 고병원성 브루셀라 야외주를이용한 백신 개발 및 브루셀라 감염증의 발병기전을 해석하는데 있어 중요한 기초가 될 것이다.
- 이와는 반대로 class II 균주는 표준주와 유사한 lysosome fusion을 보이고 유사한 탐식세포 내 증식능력을 보이고 있지만, 마우스 접종시험에서 표준주에 비해 현저히 저하된 비장 내 증식능력을 보였다. 본 결과를 토대로 브루셀라 야외주의 병원성 발현에 있어 탐식세포의 lysosome 이외에도 다양한균 측 및 숙주 측 요인이 작용할 것으로 판단된다.
- Kim 등 [9]은 브루셀라균의 유전자 변형을 통해 저병원성 변이주에 대한 특성을 분석하여, 표준주에 비해 높은 세포 내 침입능력을보이지만 낮은 세포 내 증식능력과 마우스 접종시험에서도 낮은 병원성을 보이는 변이주를 규명하였다. 본 결과를 토대로 탐식세포 내 침입능력에 따라 병원성을 규명한다는 것은 다소 어려운 측면이 있지만, 브루셀라 야외주를 대상으로 한 병원성 실험에서는 유용하게 사용될 것으로 사료된다.
- 7 세포 내 증식능력, 세포 부착능력, 표면단백 형태, 탐식세포 내 탐식 경로 및 마우스 병원성 실험을 수행해 본 결과 탐식세포 내 침입능력이 높을수록 병원성이 높게 나타나는 것으로 나타났다. 본 결과를 통하여 국내 한우 및 젖소 농가에서 발생 된 브루셀라 감염증은 다양한 병원성을 보이는 B. abortus^ 의해 발생되는 것으로 나타났으며, 본 연구를 통해 고병원성 및 저병원성을 보이는 야외 주를 활용한 브루셀라 감염증의 발병기전 해석 및 백신 개발과 같은 예방적 접근에 유용하게 사용 될 것으로 판단된다.
- 본 연구결과는 국내 한우 및 유우 농장에서 브루셀라 감염증을 유발하는 원인체에 대한 특징을 규명함은 물론, 브루셀라 감염증 연구를 위한 역학적 기초자료로 활용 될 수 있을 것이다.
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