[논문]항생제 대체제로서 Clostridium butyricum IDCC 9207 백미 발효물의 항균작용과 장관 면역증진효과

이승훈; 김성범; 강재훈; 강대중

doi:10.5187/jast.2011.53.4.341

항생제 대체제로서 Clostridium butyricum IDCC 9207 백미 발효물의 항균작용과 장관 면역증진효과
White Rice Fermented by Clostridium butyricum IDCC 9207 as an Alternative to Antibiotic having Antibacterial and Immunostimulatory Activity 원문보기

한국동물자원과학회지 = Journal of animal science and technology, v.53 no.4, 2011년, pp.341 - 348

이승훈 (일동제약(주) 중앙연구소) , 김성범 (일동제약(주) 중앙연구소) , 강재훈 (일동제약(주) 중앙연구소) , 강대중 (일동제약(주) 중앙연구소)

초록
AI-Helper

이 연구는 천연소재 probiotics 발효물을 대상으로 가축의 장내 유해세균으로 알려진 S. typhimurium KCTC 2054와 E. coli O157:H7의 생장을 억제시키는 유효 발효물을 선발하여 특성을 연구하는 데 있다. 실험 샘플 444개 중 유해 세균에 대한 항균력이 가장 우수한 것으로 C. butyricum IDCC 9207 백미 발효물(FWR)을 최종 선발하였다. C. butyricum IDCC 9207이 함유된 백미 발효물 (FWRCb9207)을 S. typhimurium KCTC 2054로 감염시킨 ICR-mice에 일정기간 투여하였을 때, salmonella의 생육이 억제됨을 확인하였으며, 장관에서 분비되는 secretory immunoglobulin A (sIgA)의 양이 증가됨을 확인하였다. FWRCb9207은 기존의 생균제 보다 빠른 정장효과를 나타낼 수 있으며, 발효물보다 생균보강을 통해 정장작용의 기간을 늘릴 수 있는 것이 장점이다. 또한 FWRCb9207의 급여를 통해 사료로부터 쉽게 감염되는 S. typhimurium, S. gallinarum, S. pullorum, S. choleraesuis ssp. choleraesuis 등의 유해세균 증식을 효과적으로 억제시키고 면역력을 증진시킴으로써 가축의 증체율을 높였다. 이러한 FWRCb9207의 synbiotic effects는 궁극적으로 기존 항생제를 대체함으로써 항생제 오남용으로 발생되는 문제점을 해소할 수 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The antagonistic activities against animal entero-pathogenic bacteria were investigated with 444 natural substances fermented by various probiotics. A white rice product fermented (FWR) by Clostridium butyricum IDCC 9207 with a high growth inhibition of Salmonella typhimurium KCTC 2054 and Escherichia coli O157:H7 was selected. Also, a FWR was shown to suppress 8 among 21 pathogenic bacteria. In a mouse model with salmonella (${\times}10^9$ CFU/mouse) infection, 5 samples (200 ${\mu}{\ell}$/mouse/day) were fed to mice (n = 25) for 18 days. A fermented white rice containing C. butyricum IDCC 9207 (FWRCb9207) among 5 samples significantly inhibited the growth of salmonella, while in the control group (PBS, tetracycline) the number of salmonella increased. And the treatment with FWRCb9207 was found to increase the secretory immunoglobulin A (sIgA) level in the feces of salmonella-infected mice. The results obtained in this study suggest that a FWRCb9207 might be utilized as a feed additive in pigs and poultry diets.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

, 1995). 본 연구에서는 C.butyricum IDCC 9207의 백미 발효물이 in vitro에서 가축의 장내 유해세균 및 감염성 병원균의 생육억제 효과를 평가하고 S. typhimurium이 감염된 mouse model에서 감염균의 증식억제와 장관면역에 미치는 영향을 조사함으로써 C. butyricum IDCC 9207의 함유된 백미 발효물이 항생제 대체제로서의 잠재성을 기초로 한 산업화에 목적을 두었다.
이 연구는 천연소재 probiotics 발효물을 대상으로 가축의 장내유해세균으로 알려진 S. typhimurium KCTC 2054와 E. coli O157:H7의 생장을 억제시키는 유효 발효물을 선발하여 특성을 연구하는 데 있다. 실험 샘플 444개 중 유해 세균에 대한 항균력이 가장 우수한 것으로 C.

제안 방법

1주일 경과 후, S. typhimurium KCTC 2054 (×109 CFU/mouse)를 시료 투여기간 초기 3일간 200 ㎕/mouse/day씩 경구투여하고 동시에 5가지 실험샘플도 2.5주 동안 250 ㎕/mouse/day씩 경구투여하였다.
typhimurium KCTC 2054를 감염시킨 mouse model에서 항균력을 조사하였다. 6주령된 female ICR mouse 5마리/cage를 1개군으로 하고 샘플은 live cells(Cb9207), cell-free 백미 발효물 (FWR), C. butyricum IDCC 9207이 함유된 백미 발효물 (FWRCb9207), 0.02% tetracycline(positive control), PBS 투여군(negative control)의 총 5개군으로 구분하였다. 계류기간이 끝난 mouse를 대상으로 0.
C. butyricum IDCC 9207이 함유된 백미 발효물 투여를 통한 면역증강효과를 확인하기 위해, 샘플 투여 전과 후로 구분하여 분변에서 장관면역에 관여하는 secretory immunoglobulin A (sIgA)의 양을 ELISA kit (Bethyl Company, France)로 측정하였다. 즉, mouse 분변 샘플을 20 mg/㎖의 농도로 현탁하고 3,000 RPM에서 1차 원심분리한 후, 회수한 상등액을 14,000 RPM에서 2차 원심 분리하여 상등액을 회수하였다.
C. butyricum IDCC 9207이 함유된 백미 발효물(FWRCb9207)을 S. typhimurium KCTC 2054를 감염시킨 mouse model에서 항균활성 평가를 위해 Fig. 5와 같은 일정으로 in vivo 실험을 진행하였다.
typhimurium KCTC 2054 infection ; 7~24 day, samples administration ; 24~28 day, follow up. Each experimental group was administered PBS (negative control), 0.02% tetracycline (Tet, positive control), C. butyricum IDCC 9207 live cells (Cb9207), cell-free fermented white rice(FWR), and fermented white rice containing C. butyricum IDCC 9207 (FWRCb9207) for 18 days, respectively.
In vivo에서 C. butyricum IDCC 9207이 함유된 백미 발효물의 유해세균 억제능을 확인하기 위해 S. typhimurium KCTC 2054를 감염시킨 mouse model에서 항균력을 조사하였다. 6주령된 female ICR mouse 5마리/cage를 1개군으로 하고 샘플은 live cells(Cb9207), cell-free 백미 발효물 (FWR), C.
choleraesuis ssp. choleraesuis 등의 유해세균 증식을 효과적으로 억제시키고 면역력을 증진시킴으로써 가축의 증체율을 높였다. 이러한 FWRCb9207의 synbiotic effects는 궁극적으로 기존 항생제를 대체함으로써 항생제 오남용으로 발생되는 문제점을 해소할 수 있을 것으로 기대된다.
typhimurium KCTC 2054의 장내 증식을 효과적으로 억제시켰다. 각각의 sample별 효능의 수치적 해석은 실험 28일차의 S. typhimurium KCTC 2054의 균수(S_T D₂₈)와 실험 7일차의 S. typhimurium KCTC 2054의 균수(S_T D₇)의 비율인 S. typhimurium KCTC 2054 증식도 (S_T D₂₈ / S_T D₇)로 나타내고, 이를 다시 positive control인 tetracycline 투여군의 S. typhimurium KCTC 2054 증식도와 상대비교를 하였다. 실험결과, tetracycline 투여군의 S.
각각의 배양액을 2.5N NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 중화시킨 후 10,000 RPM, 10분동안 원심분리하고 회수한 cell-free supernatant를 0.2µm 필터를 이용하여 제균하였다.
02% tetracycline(positive control), PBS 투여군(negative control)의 총 5개군으로 구분하였다. 계류기간이 끝난 mouse를 대상으로 0.2% tetracycline을 200 ㎕/mouse/day씩 1주일간 투여하여 mouse 고유의 장내 세균총을 억제 및 교란시켰다. 1주일 경과 후, S.
coli O157:H7이 접종된 배양배지에 1% (m/v) 되게 첨가하고 37℃에서 1시간 간격으로 배양액 colony수를 계수하여 항균력을 측정하였다. 대조군으로 C.butyricum IDCC 9207과 백미를 혼합한 후 발효시키지 않고 바로 얻은 상등액을 사용하여 상기와 같은 방법으로 분석하였다.
면역증강효과는 각 시료를 투여하기 전(D₇)과 후(D₂₄) 분변의 sIgA 양을 비교하여 관찰하였다. Fig.
이후 cell-free 백미 발효물 현탁액을 ×2^－5까지 serial dilution하여 100㎕씩 적하하였다. 반응은 37℃ 배양기에서 16시간 진행하였으며, 결과는 clear zone 생성 유무를 토대로 21주에 대한 항균 스펙트럼을 조사하였다. 실험에 사용한 지시균은 Table 2와 같다
butyricum IDCC 9207 백미 발효물의 장내 유해세균에 대한 생육억제 효과를 액체배양을 통해 조사하였다. 백미 발효물을 S. typhimurium KCTC 2054와 E. coli O157:H7이 접종된 배양배지에 1% (m/v) 되게 첨가하고 37℃에서 1시간 간격으로 배양액 colony수를 계수하여 항균력을 측정하였다. 대조군으로 C.
상기 여액을 지시균 S. typhimurium KCTC 2054와 E. coli O157:H7가 1 × 107 CFU/㎖로 도말된 MH agar와 EMB agar plate 위에 직경 8 mm의 페니실린 컵으로 뚫은 wells에 100 ㎕씩 접종하고 지시균의 배양조건(37℃, 16시간 배양)으로 배양한 다음, clear zone 형성여부 및 크기를 상대 비교함으로써 항균력이 가장 우수한 probiotic strain과 천연기질을 최종 선발하였다.
선발된 C. butyricum IDCC 9207 백미 발효물의 장내 유해세균에 대한 생육억제 효과를 액체배양을 통해 조사하였다. 백미 발효물을 S.
3,000 cut off)을 통해 여과하였다. 여액을 evaporation system을 통해 10배 감압 농축하고 동결 건조하여 항균활성을 측정하기 위한 발효 농축물을 조제하였다(Fig. 1).
butyricum IDCC 9207 백미 발효물의 항균 스펙트럼을 조사하기 위하여 well diffusion 방법을 이용하였다. 이를 위해 병원성 미생물 21주(Gram positive bacteria 11주, Gram negative bacteria 10주)를 각각의 agar plate에 접종하였다. 이후 cell-free 백미 발효물 현탁액을 ×2^－5까지 serial dilution하여 100㎕씩 적하하였다.
5주 동안 250 ㎕/mouse/day씩 경구투여하였다. 장내 salmonella 균수는 mouse의 분변 샘플에서 분석하였으며, 이를 위해 30분간 mouse의 분변을 회수하고 PBS로 다단계 희석하여 BG agar plate에 도말하고 37℃, 24시간 배양 후, 발현된 colony를 계수하였다.
천연 발효물 조제를 위해 발효기질 5%, glucose 0.5%가 첨가된 배지(pH 6.5)에 probiotic strains 균원시료를 10% (v/v) 되게 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 각각의 배양액을 2.

대상 데이터

com/)에서 보유하고 있는 산업용 균주 11종이며, 항균활성을 측정하기 위하여 사용한 지시균들은 한국생물자원센터(KCTC, The Korean Collection for Type Cultures)에서 분양 받아 사용하였다. 발효기질로 사용한 국내산 천연소재 식물자원 37종을 경동시장(서울 동대문구 제기동 소재)의 온라인 마켓인 산들약초(http://www.hanyaksale.com/)에서 구입하여 사용하였다. 유산균 배양배지로는 de Man-Rogosa-Sharpe medium (MRS, BD, USA)을 사용하였으며, Bacilli 배양배지로는 tryptic soy broth (TSB), Clostridium 배양배지는 fluid thioglycollate medium (FTM)을 사용하였다.
본 연구에 발효균주로 사용된 probiotic 균주는 일동제약(http://www.ildong.com/)에서 보유하고 있는 산업용 균주 11종이며, 항균활성을 측정하기 위하여 사용한 지시균들은 한국생물자원센터(KCTC, The Korean Collection for Type Cultures)에서 분양 받아 사용하였다. 발효기질로 사용한 국내산 천연소재 식물자원 37종을 경동시장(서울 동대문구 제기동 소재)의 온라인 마켓인 산들약초(http://www.
coli O157:H7의 생장을 억제시키는 유효 발효물을 선발하여 특성을 연구하는 데 있다. 실험 샘플 444개 중 유해 세균에 대한 항균력이 가장 우수한 것으로 C. butyricum IDCC 9207 백미 발효물(FWR)을 최종 선발하였다. C.
com/)에서 구입하여 사용하였다. 유산균 배양배지로는 de Man-Rogosa-Sharpe medium (MRS, BD, USA)을 사용하였으며, Bacilli 배양배지로는 tryptic soy broth (TSB), Clostridium 배양배지는 fluid thioglycollate medium (FTM)을 사용하였다. 그 밖의 지시균은 brain heart infusion (BHI) broth, Muller Hinton (MH), Eosin Methylene Blue (EMB), Brilliant Green (BG) 배지를 이용하여 37℃에서 배양하였다.

이론/모형

Antibacterial activities were measured by well diffusion method. 20 ㎖ of the appropriate agar (1.
선발된 C. butyricum IDCC 9207 백미 발효물의 항균 스펙트럼을 조사하기 위하여 well diffusion 방법을 이용하였다. 이를 위해 병원성 미생물 21주(Gram positive bacteria 11주, Gram negative bacteria 10주)를 각각의 agar plate에 접종하였다.

성능/효과

6에서 보는 바와 같다. 0.2% tetracycline을 1주일간 경구 투여하였을 때, 모든 실험군에서 mouse 고유의 S. typhimurium의 개체수가 낮아지는 경향을 나타냈다. 이후, S.
typhimurium KCTC 2054가 잠복기와 장내 정착기를 거쳐 증식기로 접어들었기 때문이다. 2.5주 간 S. typhimurium KCTC 2054에 감염된 mouse에 준비된 샘플들을 투여한 결과, FWR과 FWRCb9207은 S. typhimurium KCTC 2054의 장내 증식을 효과적으로 억제시켰다. 각각의 sample별 효능의 수치적 해석은 실험 28일차의 S.
C. butyricum IDCC 9207 백미 발효물(FWR)이 S. typhimurium KCTC 2054와 E. coli O157:H7 외의 시험균주 21주에 대한 항균 활성을 well diffusion method를 이용하여 조사한 결과, 총 21주의 시험균 중 8주(E. coli DC2, E. faecium Van R, E. faecalis Van R, S. aureus Met R, P. aeruginosa 9207, S. agalactiae, S. gallinarum, S. choleraesus)에 저해효과를 나타내었다(Fig. 4). FWR이 항균력을 나타낸 지시균은 Gram positive bacteria가 4종, Gram negative bacteria가 4종으로 조사되어 항균 스펙트럼의 범위가 넓은 것으로 확인되었다.
butyricum IDCC 9207 백미 발효물(FWR)을 최종 선발하였다. C. butyricum IDCC 9207이 함유된 백미 발효물 (FWRCb9207)을 S. typhimurium KCTC 2054로 감염시킨 ICR-mice에 일정기간 투여하였을 때, salmonella의 생육이 억제됨을 확인하였으며, 장관에서 분비되는 secretory immunoglobulin A (sIgA)의 양이 증가됨을 확인하였다. FWRCb9207은 기존의 생균제 보다 빠른 정장효과를 나타낼 수 있으며, 발효물보다 생균보강을 통해 정장작용의 기간을 늘릴 수 있는 것이 장점이다.
FWR 단독 투여시 S. typhimurium KCTC 2054에 대한 억제효과는 tetracycline 투여군에 비해 209배의 증식억제 효과를 나타냈다. 이는 백미 발효물에 포함되어 있는 항균활성 성분이 생체 내 각종 효소에 분해되지 않고 안정한 물질로 구성되어 있어 S.
FWRCb9207을 투여한 결과, tetracycline 투여군에 비해 448배의 높은 S. typhimurium KCTC 2054에 대한 증식억제 효과를 나타냈다. 이러한 결과는 백미 발효물이 S.
4). FWR이 항균력을 나타낸 지시균은 Gram positive bacteria가 4종, Gram negative bacteria가 4종으로 조사되어 항균 스펙트럼의 범위가 넓은 것으로 확인되었다.
) 분변의 sIgA 양을 비교하여 관찰하였다. Fig. 7에서 보는 바와 같이 대조군은 큰 변화가 없는 반면, tetracycline 투여군(Tet)의 sIgA 양은 25 ng/g feces 증가하였고 Cb9207 투여군은 10 ng/g feces 감소하였으며, FWR 투여군은 12 ng/g feces 로 오차범위 내에서 소폭 증가하였다. 실험군 중 가장 뚜렷한 증가효과를 나타낸 것은 FWRCb9207 투여군으로 100 ng/g feces 증가하였다.
Probiotics 발효물 444종을 대상으로 S. typhimurium KCTC 2054와 E. coli O157:H7에 대한 항균활성을 조사한 결과, C. butyricum IDCC 9207로 백미를 발효시킨 발효물 (FWR)이 가장 높은 항균력을 나타냈다(Fig. 2).
배양 시간에 따라 배양액 1 ㎖를 회수하고 PBS로 다단계 희석하여 지시균의 생육저해 정도를 생존균수의 분석을 통해 확인한 결과 Fig. 3에서 보는 바와 같이 백미 발효물 (FWR)을 처리하였을 때, S. typhimurium KCTC 2054가 초기 균수 4.6 × 109 CFU/㎖에서 4시간 후 3.0 × 109 CFU/㎖, E. coli O157:H7는 초기 균수 2.6 × 109 CFU/㎖에서 2.2 × 109 CFU/㎖으로 증가하지 않았다.
typhimurium KCTC 2054 증식도와 상대비교를 하였다. 실험결과, tetracycline 투여군의 S. typhimurium KCTC 2054 증식도(S_T D₂₈ / S_T D₇)는 2511, Cb9207 투여군은 199, FWR 투여군은 12, FWRCb9207 투여군은 5.6으로 나타났다.

후속연구

choleraesuis 등의 유해세균 증식을 효과적으로 억제시키고 면역력을 증진시킴으로써 가축의 증체율을 높였다. 이러한 FWRCb9207의 synbiotic effects는 궁극적으로 기존 항생제를 대체함으로써 항생제 오남용으로 발생되는 문제점을 해소할 수 있을 것으로 기대된다.
22 g으로 5개 실험군 중 가장 우수하였다. 이러한 결과는 경제동물 투여시 경제성에 유리한 영향을 미쳐 산업화 가능성을 높일 수 있을 것이라 예상된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	병원성 미생물에 감염된 가축의 치료로 사용되는 대표적인 항생제는 어떤 것이 있는가?	병원성 미생물에 감염된 가축의 치료로 항생제 및 화학적 치료법이 사용되고 있다. 대표적 항생제로 penicillin, ampicillin, tetracycline 등이 있으며, 치료효과 외에 폐사율 감소 및 성장촉진 효과가 있어 사료급여와 함께 지속적으로 사용해오고 있다. 그러나 지나친 항생제 오남용으로 내성문제를 일으켜 유럽의 경우 항생제를 축산용으로 사용하는 것을 금지하고 있으며(Dixon, 2000), 국내의 경우도 주요 항생제에 대한 내성균 발생률이 20~90% 이상 높아짐에 따라 치료 목적외 인수공통 항생제의 사료첨가제 사용이 전면 금지되었다.
	Clostridium butyricum의 기본적인 특성 이외 병원성 미생물의 생육 억제 및 예방목적에 관한 선행연구로 무엇이 있었는가?	이러한 기본적인 특성외에 특정 병원성 미생물의 생육억제 및 예방목적에 관한 C. butyricum의 선행연구로 E. coli O157:H7을 감염시킨 mouse model에 C. butyricum 투여한 결과, 유의적인 효과를 나타내었다는 보고가 있었으며(Takahashi et al., 2004), C.butyricum 의 경구투여시 mouse model에서 장관면역력을 향상시킨다는 보고가 있었다(Taka-ichi et al., 1995). 본 연구에서는 C.
	사료 첨가용 항생제 대체제들과 다른 Clostridium butyricum의 강점은 무엇인가?	사료첨가용 항생제 대체제로 probiotics가 있으며, lactobacilli, bacilli, clostridia 등이 대표적이다. 이 중, Clostridium butyricum은 spore 형성균으로 일부 probiotics가 가축의 위장관을 통과하면서 위산과 담즙산에 의해 사멸되어 probiotic effects를 발휘하지 못하는 것과는 달리, 열과산, 알칼리 조건에 대한 저항성이 강하고 외부 환경이 양호해지면 다시 영양세포로 발아하여 probiotic effects를 나타낸다. 이러한 기본적인 특성외에 특정 병원성 미생물의 생육억제 및 예방목적에 관한 C.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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