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문제 정의
- 단일제제가 아닌 여러 약제의 혼합 사용이 많은 한약재의 특성상 두 물질의 혼합이 나타낼 수 있는 안전성과 독성에 대한 평가는 더욱 큰 의미를 가질 것이다. 이에 본 연구는 고성능 액체크로마토그래피를 이용하여 그 함량과 조성이 확인된 황금과 단삼의 표준화시료를 병용 투여하여 급성독성학적 안전성을 검증하고자 한다.
- 이에 본 연구는 항염, 항암, 세균성 감염 등 다양한 효과를 나타내는 황금 (黃芩, Scutellaria baicalensis GEORGI) 과 항암, 간섬유화 억제, 간보호효과 등의 효과를 갖는 단삼 (丹蔘, Salvia miltiorrhiza BUNGE) 추출물의 병용투여에 대한 급성독성학적 안전성을 검증하고자 한다. 황금과 단삼의 각각의 약리학적 작용 및 임상적 이용가치에 대해서는 많은 연구가 진행되었으나 그 안전성과 독성에 관한 정보는 제한적이며, 단미가 아닌 복방으로 많이 사용되는 생약재의 특성상 두 물질의 혼합이 나타낼 수 있는 안전성과 독성에 대한 평가는 더욱 큰 의미를 가질 것이다.
제안 방법
- 투여방법은 동물을 경배부 피부고정법으로 고정 후 금속제 경구투여용 존대를 이용하여 위내에 직접주입 하였다. 1일 1회 당일 체중을 기준으로 체중 kg당 10 mL을 투여하였다. 시험동물에 시험물질투여 후 2시간 동안은 사료를 제한하였으며, 시험기간 동안 물의 공급은 제한하지 않았다.
- 실험동물 및 사육 환경 − 본 실험에서는 오리엔트 (주)으로부터 입수한 6주령의 암수 ICR 마우스를 사용하였다. 1주일간 적응기를 둔 후 체중범위에 따른 무작위법에 의하여 군 분리를 실시한 후, 본 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 동물들은 인수 시 및 순화기간 동안 이상증상이 관찰 되지 않았다.
- 001 수준에서 검정하였다. 본 시험에서는 사망동물이 관찰되지 않아 반수치사량 (LD50) 의 산출을 위한 통계처리는 실시하지 않았다.
- 부검 − 투여 후 14일째에 마우스 ethyl ether로 마취하고, 방혈 치사시킨 후 모든 장기를 적출하고, 개체 시험동물의 육안적 병변 관찰하고 장기의 무게를 측정하였다.
- 순화 및 실험 기간 동안 사육 환경은 온도 23 ± 2oC, 상대습도 55 ± 5%, 조명시간 12시간 및 조도 150~300 Lux로 설정하였고, 살균 처리된 실험동물용 고형사료(PICO 5053, Labdiet)와 물(tap water)은 자유섭취 조건으로 하였다.
- 여러 가지 약리학적 효과를 나타내는 표준화된 황금과 단 삼의 병용투여의 급성독성을 평가하기 위하여 식품의약품안전청의 독성시험기준에 근거하여 수행하였다. 시험물질을 단회 경구투여하고 14일간 사망률, 일반증상, 체중변화, 부검소견 및 장기무게를 관찰하였다. 투여된 최고용량인 2,000mg/kg에서 사망하는 개체가 관찰되지 않았으며, 시험물질의 반수치사량(mean lethal dosage, LD50)은 자웅 랫트 모두에서 2,000 mg/kg을 상회하는 것으로 확인되었다.
- 용량 및 시험물질의 투여 − 본 연구에서는 시험물질 투여전 4시간 절식 후, 체중을 측정하고, 분말상태의 표준화 시료 황금 및 단삼을 각각을 3:1로 혼합하여 사용 하였다.
- 일반 임상증상 관찰 − 식품의약품안전청의 독성시험기준5) 에 따라 투여 후 처음 6시간 동안을 특별한 주의를 가지고 시험동물의 피부, 털, 눈, 점막, 호흡기, 순환기, 자율신경계, 중추신경계, 신체 운동 활동성, 행동형태 및 시험동물의 진전 (tremors), 경련(convulsions), 유연(salivation), 설사(diarrhoea), 기면(lethargy), 수면(sleep), 혼수(coma) 등의 유무를 관찰하였다.
- 임상증상 − 황금단삼 혼합시료를 투여하고 피부, 털, 눈, 점막, 호흡기, 순환기, 자율신경계, 중추신경계, 신체 운동 활동성, 행동형태 및 시험동물의 진전(tremors), 경련(convulsions), 유연(salivation), 설사(diarrhoea), 기면(lethargy), 수면 (sleep), 혼수(coma) 등의 유무를 관찰하였다.
- 에 따라 투여 후 처음 6시간 동안을 특별한 주의를 가지고 시험동물의 피부, 털, 눈, 점막, 호흡기, 순환기, 자율신경계, 중추신경계, 신체 운동 활동성, 행동형태 및 시험동물의 진전 (tremors), 경련(convulsions), 유연(salivation), 설사(diarrhoea), 기면(lethargy), 수면(sleep), 혼수(coma) 등의 유무를 관찰하였다. 투여 후 14 일 동안 1일 1회씩 일반 임상증상을 관찰하고 시험동물의 개별체중은 시험물질을 투여하기 전과 후, 시험기간 동안 1일 1회씩 측정하였다.
- 투여용량 및 방법은 식품의약품안전청의 독성시험기준5)및 OECD Guideline6)에 따라 2,000 mg/kg을 최고 용량으로 정하고, 정제 증류수로 희석하여 500 mg/kg, 50 mg/kg, 5 mg/ kg의 시험물질을 제조하였다. 투여는 임상에서의 주요 적용 경로인 경구투여로 하였다. 투여방법은 동물을 경배부 피부고정법으로 고정 후 금속제 경구투여용 존대를 이용하여 위내에 직접주입 하였다.
- 투여는 임상에서의 주요 적용 경로인 경구투여로 하였다. 투여방법은 동물을 경배부 피부고정법으로 고정 후 금속제 경구투여용 존대를 이용하여 위내에 직접주입 하였다. 1일 1회 당일 체중을 기준으로 체중 kg당 10 mL을 투여하였다.
대상 데이터
- 실험동물 및 사육 환경 − 본 실험에서는 오리엔트 (주)으로부터 입수한 6주령의 암수 ICR 마우스를 사용하였다.
- 순화 및 실험 기간 동안 사육 환경은 온도 23 ± 2oC, 상대습도 55 ± 5%, 조명시간 12시간 및 조도 150~300 Lux로 설정하였고, 살균 처리된 실험동물용 고형사료(PICO 5053, Labdiet)와 물(tap water)은 자유섭취 조건으로 하였다. 실험동물은 꼬리에 개별인식 처리한 후 각각의 동물을 관찰하는데 방해가 되지 않는 범위에서 폴리카보네이트 케이지에 투여용량별로 5마리씩 구성하여 사육하였다.
- 시료의 제조 − 건조한 황금 600 g에 10배량의 증류수를 가한 후 24시간동안 실온에서 방치하고, 생성된 침전을 여과하여 침전물이 잔사 62 g를 수득하였다. 황금 잔사 62 g에 에탄올 1L를 가하여 가열 교반하여 용해시킨 다음 여과한 여액을 감압 농축 (EYELA사, N-1000, 일본) 하여 황금의 표준화시료인 정제 추출물 60 g (수득률 : 10%)를 얻어 표준화시료로 사용하였다. 상기의 방법을 통해 얻어진 황금표준화시료는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 를 통하여 주요 유효물질인 바이칼레인(56.
데이터처리
- 대조군과 시험물질 투여군의 측정치의 차이를 Student's t-test로 비교하고 유의성을 P≤ 0.05, 0.01 및 0.001 수준에서 검정하였다.
- 통계처리 − 시험에서 얻은 모든 측정치의 통계적인 분석 방법은 two-tailed Student's t-test를 이용하였다.
이론/모형
- 여러 가지 약리학적 효과를 나타내는 표준화된 황금과 단 삼의 병용투여의 급성독성을 평가하기 위하여 식품의약품안전청의 독성시험기준에 근거하여 수행하였다. 시험물질을 단회 경구투여하고 14일간 사망률, 일반증상, 체중변화, 부검소견 및 장기무게를 관찰하였다.
- 용량 및 시험물질의 투여 − 본 연구에서는 시험물질 투여전 4시간 절식 후, 체중을 측정하고, 분말상태의 표준화 시료 황금 및 단삼을 각각을 3:1로 혼합하여 사용 하였다. 투여용량 및 방법은 식품의약품안전청의 독성시험기준5)및 OECD Guideline6)에 따라 2,000 mg/kg을 최고 용량으로 정하고, 정제 증류수로 희석하여 500 mg/kg, 50 mg/kg, 5 mg/ kg의 시험물질을 제조하였다. 투여는 임상에서의 주요 적용 경로인 경구투여로 하였다.
성능/효과
- 사용한 어떠한 용량에 서도 관찰된 모든 지표에서 표준화된 황금과 단삼의 혼합시료의 투여에 의한 독성은 유발되지 않았다. 결론적으로 자웅성 마우스에 단회 경구투여된 표준화된 황금과 단삼의 혼합시료는 체내에서 안전한 것으로 사료된다.
- 사망동물 및 치사량 − 자웅성 ICR 마우스에 황금단삼 혼합시료 5, 50, 500, 2,000 mg/kg 투여 후 14일간 사망유무 관찰한 결과 시험물질 투여에 기인한 사망은 관찰되지 않았다 (Table I).
- OECD test guideline 420은 2,000 mg/kg의 용량에서 사망개체가 없는 경우 무독성으로 간주하므로, 표준화된 황금과 단삼의 혼합시료의 안전성을 확인할 수 있었다. 사용한 어떠한 용량에 서도 관찰된 모든 지표에서 표준화된 황금과 단삼의 혼합시료의 투여에 의한 독성은 유발되지 않았다. 결론적으로 자웅성 마우스에 단회 경구투여된 표준화된 황금과 단삼의 혼합시료는 체내에서 안전한 것으로 사료된다.
- 상기의 방법을 통해 얻어진 단삼표준화시료는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 통하여 크립토탄시논(31.25±0.02), 탄시논 I(49.75±0.06), 탄시논 IIA(55.15±0.05) 함량이 일반추출물에 비해 탁월함을 확인하였다.
- 상기의 방법을 통해 얻어진 황금표준화시료는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 를 통하여 주요 유효물질인 바이칼레인(56.0±0.04%), 우고닌(10.2±0.06), 오록시린A (4.4±0.05)을 확인하였으며, 표준화 시료 중의 유효성분 함량이 일반추출물 함량에 비해 현저히 높음을 확인하였다.
- 시험물질을 단회 경구투여하고 14일간 사망률, 일반증상, 체중변화, 부검소견 및 장기무게를 관찰하였다. 투여된 최고용량인 2,000mg/kg에서 사망하는 개체가 관찰되지 않았으며, 시험물질의 반수치사량(mean lethal dosage, LD50)은 자웅 랫트 모두에서 2,000 mg/kg을 상회하는 것으로 확인되었다. OECD test guideline 420은 2,000 mg/kg의 용량에서 사망개체가 없는 경우 무독성으로 간주하므로, 표준화된 황금과 단삼의 혼합시료의 안전성을 확인할 수 있었다.
- 해부병리소견 − 시험 종료 후 모든 투여군을 부검하여 장기에 대한 육안적 병변을 관찰한 결과 간, 비장, 생식기, 폐, 심장, 신장 등 관찰된 모든 장기에서 시험물질에 의하여 발생되었다고 인정되는 병리 소견은 발견되지 않았다.
- 사망동물 및 치사량 − 자웅성 ICR 마우스에 황금단삼 혼합시료 5, 50, 500, 2,000 mg/kg 투여 후 14일간 사망유무 관찰한 결과 시험물질 투여에 기인한 사망은 관찰되지 않았다 (Table I). 황금단삼 혼합시료에 독성학적 영향을 받지 않는 최소치사량은 자웅성 마우스 모두에서 2,000 mg/kg을 훨씬 상회하는 것으로 나타났다.
후속연구
- 1) 또한 주요 성분에 따라서 각각 다른 면역학적 반응을 나타냄도 확인되었다.1) 따라서 황금의 임상처방에 주의를 요하며, 복합제 복용을 통한 독성 저감의 연구 등의 황금 사용에 대한 종합적인 연구가 계속되어야 할 것으로 사료된다.
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