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문제 정의
- . 따라서 이번 연구에서도 수풍순기환 분할 처방이 지방조직에 미치는 영향을 알아보기 위하여 쥐의 부고환 지방조직을 사용하여 지방 무게의 증가여부와 지방 크기를 측정하였다. 부고환 지방 조직을 선택한 이유는 부고환 지방조직이 포도당과 글리코겐을 합성하고, 인슐린에 민감하게 반응하며, 여러 가지 adipocytokine을 분비하는 조직으로 백색지방조직(white adipose tissue)의 변화를 평가하기 위한 지표로 여겨지기 때문이다31.
- 를 통해 단일 약재로서도 혈당 강하 효과가 있다고 알려진 산수유(Cornus officinalis), 산약(Dioscorea rhizoma), 지각(Aurantii Fructus)을선별하여 분할처방을 구성한 뒤, 이를 비만형 제2형 당뇨병이 유발된 쥐에게 투여하였다. 이를 통해 체중변화, 당대사, 지질대사, 지방조직에 미치는 영향을 규명하여 대사증후군에 해당 처방의 적용 가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- FBS 및 경구 OGTT 검사는 실험 7주째 8시간 이상 금식시킨 후 공복 시 혈당을 측정한 다음 glucose(1 g/kg body weight)를 D.W.에 녹여 경구 투여시킨 다음 30분 후, 60분 후, 90분 후 mouse의 tail vein에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다. 혈당은 strip-operated blood glucose sensor(ONETOUCH Ultra Inverness Medical Ltd.
- 그 후 정상군을 제외한 모든 실험군에 앞선 논문17에서 인슐린 저항성을 일으킨다고 알려진 Surwit's high fat, high sucrose diet(HFD, Research Diets #D 08020201, 45 kcal% Fat and 32 kcal% Sucrose)를 8주간 섭취시켜 비만형 제2형 당뇨병을 유발했다(Table 1).
- . 따라서 지질대사의 조절여부는 당뇨병 합병증 예방의 핵심이므로 본연구에서도 total cholesterol(TC), HDL cholesterol, LDL cholesterol와 triglyceride(TG) 검사를 시행하 였다. 수풍순기환 분할처방군은 높은 HDL cholesterol 농도를 보여 다수 연구자와 일치되는 결과5,7,14를보이는 동시에 높은 TC과 TG를 보여 기존 연구와는 반대되는 결과도 보여 상호 모순되는 모습을 보였다.
- 박절편기로 약 2㎛ 두께로 박절하여 Hematoxylin and Eosin(H&E) 염색하였다.
- 본 연구는 수풍순기환에 대해《萬病回春》21에서 脾․肺․腎이 약한 자에게는 적합하지 않다고 한점, 그리고 연령이 높은 환자에게 수풍순기환의 효과가 떨어진다는 이 등10의 연구를 고려하여 수풍순기환의 구성 약재 중 精氣를 다소 耗損시킬 수 있는 車前子(Plantaginaceae Semen), 郁李仁(Pruni Semen), 大黃(Rhei Radix et Rhizoma) 등을 제외하고, 약성이 비교적 완만하며 선행된 연구3,4,11,12,13,14,15,16를 통해 단일 약재로서도 혈당 강하 효과가 있다고 알려진 산수유, 산약, 지각을 선별하여 수풍순기환 분할처방으로 구성하였다.
- 본 연구에서는 산수유 · 산약 · 지각의 복합 처방을 사용하였는데, 이 약재의 구성은 다수의 논문7,8,9,10을 통해 혈당 강하 효과가 입증된 수풍순기환의 분할처방이다.
- 수풍순기환 분할처방 투여군은 Surwit's high fat, high sucrose diet에 분할처방을 5%의 비율로 섞어 8주간 섭취하도록 하였다.
- 실험 시작 8주째 mouse를 희생시킨 후 개복하여 부고환 지방 조직(epididymal fat pad) 및 간의 무게를 측정하였다.
- 실험 시작 8주째 식이 제한 없이 실험동물을 희생시키기 전 mouse의 심장에서 채혈을 시행하여 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 한 다음 上淸液을얻어 -40℃에 보관한 후 total cholesterol(TC), high density lipoprotein(HDL) cholesterol, low density lipoprotein(LDL) cholesterol, triglyceride(TG) 등의 생화학적 분석을 시행하였으며, 동시에 fructosamine (glycoprotein) 검사를 시행하였다.
- 실험군은 ICR mouse 10마리씩 정상군(ND), 대조군(HFD) 수풍순기환 분할처방 투여군(SPP)으로 나누어 진행하였다. 정상군을 제외한 나머지 2개 군들은 Surwit's high fat, high sucrose diet를 8주간 섭취시켜 비만형 제2형 당뇨병을 유발했다.
- 박절편기로 약 2㎛ 두께로 박절하여 Hematoxylin and Eosin(H&E) 염색하였다. 염색된 지방조직을 카메라가 부착된 광학현미경(BX61, Olympus, Japan)으로 찍어서 100배의 대물렌즈를 사용하여 개체 당 5장의 사진을 얻은 후 컴퓨터 영상분석프로그램 (ImageJ or Image analysis program, Metamorph, Japan)과 크기분석 프로그램(Float morphology, USA)으로 분석하였다.
- 비록 60분 후부터는 유의한 차이를 보이지 않으나 혈당의 최고치를 보이는 30분 후 혈당 증가를 억제 하여 혈당 조절 기능을 수행하는 것으로 보인다. 이러한 수풍순기환 분할처방의 장기적인 혈당 조절력을 보기위하여 fructosamine 측정도 병행하였다. Fructosamine은 단백질의 아미노기가 비효소반응으로 포도당과 결합한 것으로 반감기가 길어서 최근 2주간의 혈당 평균치를 알 수 있는 검사방법이다27.
- 이번 연구에서는 동양의학에서 당뇨병과 가장 가까운 개념인 消渴1,6에 사용되며 다수의 논문7,8,9,10을 통해 혈당 강하력이 입증된 수풍순기환의 구성 약재 중 약성이 비교적 완만하며, 선행된 연구3,4,11,12,13,14,15,16를 통해 단일 약재로서도 혈당 강하 효과가 있다고 알려진 산수유(Cornus officinalis), 산약(Dioscorea rhizoma), 지각(Aurantii Fructus)을선별하여 분할처방을 구성한 뒤, 이를 비만형 제2형 당뇨병이 유발된 쥐에게 투여하였다. 이를 통해 체중변화, 당대사, 지질대사, 지방조직에 미치는 영향을 규명하여 대사증후군에 해당 처방의 적용 가능성을 알아보고자 하였다.
- 제2형 당뇨병 모델은 ob/ob mouse나 db/db mouse와 같은 유전학적 모델도 있으나24 제 2형 당뇨병은 유전적 결함보다는 식이에서 비롯되는 경우가 많으므로 식이를 통해 비만을 유발 하였으며, 한국인의 식생활이 쌀을 중심으로 한 곡물편중의 식사패턴인 점25을 고려하여 고지방과 고탄 수화물 식이를 동시에 병행한 Surwit's high fat, high sucrose 식이를 시행하였다.
- 지방 조직 세포의 형태학적 관찰을 위해 부고환 조직의 일부를 적출하여 10% formaldehyde 용액에 고정 및 탈수 후 paraffin 투과과정을 거쳐 포매하였다. 박절편기로 약 2㎛ 두께로 박절하여 Hematoxylin and Eosin(H&E) 염색하였다.
- 체중은 실험 개시 일에 최초 측정 한 후 매주 1회씩 측정하였고, 실험종료일에 마지막 sampling하기 전에 측정하였다. 체중 측정은 아침 사료 공급 전에 일괄적으로 전자저울(CAS 2.5D, Korea)을사용하여 측정하였으며, 측정 시 mouse의 움직임에 따른 체중 오차를 최소화하기 위해 플라스틱 bowl에 mouse을 올려놓고, mouse가 안정 상태에 이르러 나타나는 체중을 기록하였다.
- 체중은 실험 개시 일에 최초 측정 한 후 매주 1회씩 측정하였고, 실험종료일에 마지막 sampling하기 전에 측정하였다. 체중 측정은 아침 사료 공급 전에 일괄적으로 전자저울(CAS 2.
- 총량 1,000 g씩의 산수유(Cornus officinalis), 산약(Dioscorea rhizoma), 지각(Aurantii Fructus)을각기 1,500 ㎖의 80% 에탄올에 넣고 heating mantle 을 이용하여 2시간 동안 가열 추출하고 여과한 여액을 500 ㎖ 플라스크에 applicator를 이용하여 넣은 후 filter로 걸러냈다. 걸러진 여과액을 Rotary evaporator(Model NE-1, 東京理化學株式會社, Japan) 로 건조한 뒤, 동결 건조된 산수유, 산약, 지각의 1차 추출물을 1:1:1의 비율로 혼합하여 실온에서 보관하였다.
- 에 녹여 경구 투여시킨 다음 30분 후, 60분 후, 90분 후 mouse의 tail vein에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다. 혈당은 strip-operated blood glucose sensor(ONETOUCH Ultra Inverness Medical Ltd. Stockport. UK)기기를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 체중 23-25 g의 6주령 Sprague-Dawley(SD) 系 male ICR mice(중앙실험동물, Korea)를 구매하여 12시간씩 낮과 밤이 교대되며 40-70%의 습도를 유지하고 stainless-steel cage에서 1주일간 사육하며 적응기를 거쳤다. 먹이와 물은 자유롭게 먹도록 하였다.
데이터처리
- 통계학적 비교분석은 GraphPad PRISM statistical package(ver 2.00, Graphpad software inc., San Diego, USA)를 이용하였고, 각 군 간의 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA)에 이어 Tuckey's post-hoc test로 사후 검증하였다.
이론/모형
- 비만형 제2형 당뇨병을 유발시키기 위해 이번 연구에서는 Surwit's high fat, high sucrose 식이를 이용하였다.
성능/효과
- 30분 후 혈당은 대조군(362.50 ±42.36 mg/dL)이 정상군(274.80±50.82 mg/dL)과비교하면 유의성 있게 높고(p<0.01), 수풍순기환 분할처방 투여군(325.70±34.30 mg/dL)은 대조군보다 혈당이 유의성 있게 낮아 고혈당이 억제되었다 (p<0.01).
- 01). 60분, 90분 후 혈당은 수풍순기환 분할처방 군과 대조군 사이에 유의한 차이가 없었다(Fig. 2).
- 8주간의 고지방, 고탄수화물 식이를 통해 대조군은 체중과 혈당이 유의성 있게 증가하고 fructosamine, total cholesterol, triglyceride 농도가 높아지면서 HDL cholesterol 농도는 낮아지고 부고환 지방층의 무게와 백색지방세포 크기는 증가하는 등 비만형 제2형 당뇨병이 효과적으로 유발되었다.
- Fructosamine 농도는 정상군(234.90±11.20 ㎛ol/L)보다 대조군(256.40±24.1 ㎛ol/L)에서 증가하는 방향으로 유의성 있는 차이가 관찰되었고(p<0.05), 수풍순기환 분할처방 투여 군(232.44±18.92 ㎛ol/L)은 대조군보다 유의성 있게 감소된 fructosamine이관찰되었다(p<0.05).
- 걸러진 여과액을 Rotary evaporator(Model NE-1, 東京理化學株式會社, Japan) 로 건조한 뒤, 동결 건조된 산수유, 산약, 지각의 1차 추출물을 1:1:1의 비율로 혼합하여 실온에서 보관하였다. 각각의 최종 수거율은 산수유는 18.9%, 산약은 3.4%, 지각은 16%였다.
- 다음으로 수풍순기환 분할처방 투여군은 FBS에서는 유의성은 없으나 대조군보다 낮고, OGTT에서는 30분 후 혈당이 유의성 있게 낮은 경향을 보여서 인슐린 저항성이 감소하였음을 알 수 있었다. 비록 60분 후부터는 유의한 차이를 보이지 않으나 혈당의 최고치를 보이는 30분 후 혈당 증가를 억제 하여 혈당 조절 기능을 수행하는 것으로 보인다.
- 대조군은 88.2%(23.80±0.91 g 에서 44.80±6.05 g으로 증가함)의 체중이 증가하여 정상군이 49.5%(24.00±0.94 g에서 35.90±3.24 g으로 증가함)의 체중증가를 보인 것에 비하여 유의한 비만이 유도되었다.
- 01). 대조군의 지방세포 크기가 1.0배 일 때 정상군과 수풍순기환 분할처방 투여군의 지방세포 크기는 각각 대조군의 0.79배와 0.66배로 감소하였다(Fig. 3).
- 01), 수풍순기환 분할처방군이 대조군에 비해 낮았으나 유의성은 없었다. 대조군이 전체적으로 높은 혈당 농도를 보였으며 다음으로 수풍순기환 분할처방투여군, 정상군의 순이었다. 실험 7주차에 시행한 OGTT 결과 모든 실험군은 30분 후에 혈당의 최고치를 보였으며, 그 뒤 지속적으로 감소하는 모습을 보여주었다.
- Fructosamine은 단백질의 아미노기가 비효소반응으로 포도당과 결합한 것으로 반감기가 길어서 최근 2주간의 혈당 평균치를 알 수 있는 검사방법이다27. 본 연구에서는 수풍순기환 분할처방 투여군에서 대조군과 유의성 있게 fructosamine 농도가 감소된 모습이 관찰되어 수풍순기환 분할처방 투여가 장기간에 걸쳐 우수한 혈당 조절력이 있다는 것을 보여주었다.
- 수풍순기환 분할처방 투여 군은 8주간의 고지방 고탄수화물 식이로 66.9% (23.60±0.51 g에서 39.40±3.71 g으로 증가함)의 체중 증가세를 보여 대조군보다 11.3% 억제된 체중 증가세를 보였다.
- 따라서 지질대사의 조절여부는 당뇨병 합병증 예방의 핵심이므로 본연구에서도 total cholesterol(TC), HDL cholesterol, LDL cholesterol와 triglyceride(TG) 검사를 시행하 였다. 수풍순기환 분할처방군은 높은 HDL cholesterol 농도를 보여 다수 연구자와 일치되는 결과5,7,14를보이는 동시에 높은 TC과 TG를 보여 기존 연구와는 반대되는 결과도 보여 상호 모순되는 모습을 보였다. 이러한 오류를 보정하기 위해 최근에는 단일 지질측정 보다는 TC/HDL ratio, LDL/HDL 또는 TG(triglyceride)/HDL ratio와 같은 지질간의 관계를 이용하여 심혈관 관계를 예측하는 것이 선호되고 있으며 TG/HDL ratio가 가장 강력하고 독립적인 심혈관 예측인자라고 연구된 바 있다29.
- 대조군이 전체적으로 높은 혈당 농도를 보였으며 다음으로 수풍순기환 분할처방투여군, 정상군의 순이었다. 실험 7주차에 시행한 OGTT 결과 모든 실험군은 30분 후에 혈당의 최고치를 보였으며, 그 뒤 지속적으로 감소하는 모습을 보여주었다. 30분 후 혈당은 대조군(362.
- 부고환 지방 조직을 선택한 이유는 부고환 지방조직이 포도당과 글리코겐을 합성하고, 인슐린에 민감하게 반응하며, 여러 가지 adipocytokine을 분비하는 조직으로 백색지방조직(white adipose tissue)의 변화를 평가하기 위한 지표로 여겨지기 때문이다31. 실험 결과 수풍순기환 분할처방은 지방조직의 무게증가와 부피증가를 모두 억제하는 것으로 나타나 수풍순기환 분할처방이 비만 예방 및 치료의 핵심인 지방축적을 감소시켰음을 알 수 있었다.
- 이러한 오류를 보정하기 위해 최근에는 단일 지질측정 보다는 TC/HDL ratio, LDL/HDL 또는 TG(triglyceride)/HDL ratio와 같은 지질간의 관계를 이용하여 심혈관 관계를 예측하는 것이 선호되고 있으며 TG/HDL ratio가 가장 강력하고 독립적인 심혈관 예측인자라고 연구된 바 있다29. 이번 실험에서도 수풍순기환 분할처방 투여군은 TC 과 TG 농도가 높음에도 불구하고 HDL cholesterol 농도가 현저히 높아서 TG/HDL ratio와 TC/HDL ratio를 대조군에 비하여 매우 유의성 있게 감소시켰다. 이는 수풍순기환 분할처방이 지질대사의 개선을 가져왔음을 보여주는 것이라 하겠다.
- 이상의 결과를 통해 산수유, 산약, 지각의 수풍순기환 분할처방은 고지방 고탄수화물 식이로 유발된 비만형 제2형 당뇨병 동물모델을 대상으로한 당대사 및 지질대사 실험에서 유의한 개선 효과가 있었으며, 지방조직의 무게증가와 부피증가를 모두 억제하였다. 본 실험 결과는 2형 당뇨병 환자, 특히 비만형 당뇨병 환자와 당뇨병 전단계에 있는 환자들에게 유효하면서도 안전성 있는 치료에 방향을 제시할 것으로 판단된다.
- 이에 반해 수풍순기환 분할처방 투여군은 대조군과 동일한 고지방 고탄수화물 식이를 시행 하였음에도 불구하고 지속적으로 대조군 보다 낮은 체중을 보였으며, 실험 8주차에 이르러서는 오히려 대조 군과 유의성 있는 체중 증가 억제가 관찰 되었다. 체중 감량이 인슐린 저항성을 개선하는 adiponectin 과 IL-10의 상승을 초래하고 triglyceride, total cholesterol 및 혈압을 개선시켜 당뇨병과 비만치료의 핵심26이라는 점을 고려하면 시일이 지날수록체중이 현저히 증가하는 대조군과 반대되는 이번 실험 결과는 수풍순기환 분할처방의 체중 조절 가능성을 보여준다.
- 지방세포 크기는 대조군(10,198.53±9073.98 ㎛ 2 ) 에서 정상군(8,086.88±5,545.178 ㎛ 2 )과 비교하여 유의성 있게 증가하였는데(p<0.05), 수풍순기환 분할처방 투여군(6,804.21 ± 4,753.65 ㎛ 2 )은 대조군에 비해 매우 유의성 있게 지방세포의 크기 증가가 억제되었다(p<0.01).
- 이에 반해 수풍순기환 분할처방 투여군은 대조군과 동일한 고지방 고탄수화물 식이를 시행 하였음에도 불구하고 지속적으로 대조군 보다 낮은 체중을 보였으며, 실험 8주차에 이르러서는 오히려 대조 군과 유의성 있는 체중 증가 억제가 관찰 되었다. 체중 감량이 인슐린 저항성을 개선하는 adiponectin 과 IL-10의 상승을 초래하고 triglyceride, total cholesterol 및 혈압을 개선시켜 당뇨병과 비만치료의 핵심26이라는 점을 고려하면 시일이 지날수록체중이 현저히 증가하는 대조군과 반대되는 이번 실험 결과는 수풍순기환 분할처방의 체중 조절 가능성을 보여준다.
- 체중변화를 주 단위로 살펴보면 4주차부터 정상군(33.00±3.09 g)보다 대조군(36.80±3.88 g)에서 유의성 있는 체중증가가 관찰되기 시작하여(p<0.05), 6주차부터는 정상군(33.60 ±3.80 g)보다 대조군(39.80±4.89 g)에서 더욱 현저한 체중 증가가 관찰되어 실험종료시점까지 비만이 유지되었다(p<0.01).
- 체중변화를 주 단위로 살펴보면 7 주차까지 대조군과 비슷한 증가세를 보이다 8주차에 이르러서 대조군(44.80±6.05 g)과 유의성 있는 체중 증가 억제가 관찰되었다(p<0.05)(Fig. 1).
- 체중은 8주간 모든 실험군에서 지속적으로 증가하는 양상을 보였다. 대조군은 88.
후속연구
- 이상의 결과를 통해 산수유, 산약, 지각의 수풍순기환 분할처방은 고지방 고탄수화물 식이로 유발된 비만형 제2형 당뇨병 동물모델을 대상으로한 당대사 및 지질대사 실험에서 유의한 개선 효과가 있었으며, 지방조직의 무게증가와 부피증가를 모두 억제하였다. 본 실험 결과는 2형 당뇨병 환자, 특히 비만형 당뇨병 환자와 당뇨병 전단계에 있는 환자들에게 유효하면서도 안전성 있는 치료에 방향을 제시할 것으로 판단된다.
- 이에 비해 수풍순기환 분할처방은 지질대사와 내당능을 개선시키는 동시에 지방 세포의 비대와 축적 및 체중 증가를 억제하여 비만과 당뇨병의 예방과 치료에 동시에 적용 가능해 현재 별다른 치료법이 없는 대사증후군에도 이용이 가능할 것으로 보인다. 앞으로 본 연구에서는 진행되지 못한 장기간의 영향 평가와 투여 용량에 따른 실험이 이루어져야 할 것으로 보이며, 더 나아가 지질 강하 기전과 관련된 물질들에 대한 연구와 임상연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 비만과 당뇨병 모두를 포괄하는 대사증후군에 사용하기 어려웠다. 이에 비해 수풍순기환 분할처방은 지질대사와 내당능을 개선시키는 동시에 지방 세포의 비대와 축적 및 체중 증가를 억제하여 비만과 당뇨병의 예방과 치료에 동시에 적용 가능해 현재 별다른 치료법이 없는 대사증후군에도 이용이 가능할 것으로 보인다. 앞으로 본 연구에서는 진행되지 못한 장기간의 영향 평가와 투여 용량에 따른 실험이 이루어져야 할 것으로 보이며, 더 나아가 지질 강하 기전과 관련된 물질들에 대한 연구와 임상연구가 필요할 것으로 판단된다.
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