청갓과 적갓에서 추출한 GSLs에 의한 4종류의 암세포주를 이용하여 항암 활성을 조사하였다. 또한 갓 추출물에 함유된 GSLs를 HPLC와 LC-ESI/MS로 분석한 결과는 다음과 같다. 1. 갓에서 추출한 GSLs의 항암 활성을 분석한 결과, SNU-354 (간암)>SNU-C4결정암)>SNU-251(난소암)>MCF-7(유방암) 순으로 높게 나타났다. 또한 GSLs 추출물의 처리 시간(24, 48시간)에 따르면 적갓 추출물의 항암 효과가 청갓 추출물의 항암 효과보다 큰 것으로 나타났다. 2. 갓의 주요한 GSLs 성분은 sinigrin이었으며, 청갓이 적갓보다 더 높은 함량을 나타내었으며, 또한 청갓에서만 glucoiberin이 미량으로 검출되었다. 3. 항암 활성 평가에서 적갓 GSLs 추출물이 청갓보다 더 높은 활성을 나타낸 것은 GSLs 물질 이외에 다른 물질들이 관여 했을 것으로 생각되므로 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
청갓과 적갓에서 추출한 GSLs에 의한 4종류의 암세포주를 이용하여 항암 활성을 조사하였다. 또한 갓 추출물에 함유된 GSLs를 HPLC와 LC-ESI/MS로 분석한 결과는 다음과 같다. 1. 갓에서 추출한 GSLs의 항암 활성을 분석한 결과, SNU-354 (간암)>SNU-C4결정암)>SNU-251(난소암)>MCF-7(유방암) 순으로 높게 나타났다. 또한 GSLs 추출물의 처리 시간(24, 48시간)에 따르면 적갓 추출물의 항암 효과가 청갓 추출물의 항암 효과보다 큰 것으로 나타났다. 2. 갓의 주요한 GSLs 성분은 sinigrin이었으며, 청갓이 적갓보다 더 높은 함량을 나타내었으며, 또한 청갓에서만 glucoiberin이 미량으로 검출되었다. 3. 항암 활성 평가에서 적갓 GSLs 추출물이 청갓보다 더 높은 활성을 나타낸 것은 GSLs 물질 이외에 다른 물질들이 관여 했을 것으로 생각되므로 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
The objective of this study was to compare the anticancer activity of glucosinolates against four different cancer cells; SNU-251, SNU-354, SNU-C4, MCF-7 and to determine the amounts of glucosinolates in mustard leaves. Green and red mustard leaves were cultivated on the field of Rural Development A...
The objective of this study was to compare the anticancer activity of glucosinolates against four different cancer cells; SNU-251, SNU-354, SNU-C4, MCF-7 and to determine the amounts of glucosinolates in mustard leaves. Green and red mustard leaves were cultivated on the field of Rural Development Administration from May to July, 2010. After the leaves were harvest and lypophilized, the fine powder was extracted with boiling 70% methanol(v/v) for the measurement of anticancer activity and then applied to the cancer cells obtained from Korean Cell Line Bank(KCLB). The anticancer activity of red leaf mustard was higher than that of green mustard leaf, particularly in SNU-251 for 24 hr and in SNU-C4 for 48 hr. In both green and red mustard leaf, sinigrin was the most abundant glucosinolte and was determined as 4.71 and 3.06 mg/g dry wt., respectively, but glucoiberin only presented 0.14 mg/g dry wt. with minor amounts.
The objective of this study was to compare the anticancer activity of glucosinolates against four different cancer cells; SNU-251, SNU-354, SNU-C4, MCF-7 and to determine the amounts of glucosinolates in mustard leaves. Green and red mustard leaves were cultivated on the field of Rural Development Administration from May to July, 2010. After the leaves were harvest and lypophilized, the fine powder was extracted with boiling 70% methanol(v/v) for the measurement of anticancer activity and then applied to the cancer cells obtained from Korean Cell Line Bank(KCLB). The anticancer activity of red leaf mustard was higher than that of green mustard leaf, particularly in SNU-251 for 24 hr and in SNU-C4 for 48 hr. In both green and red mustard leaf, sinigrin was the most abundant glucosinolte and was determined as 4.71 and 3.06 mg/g dry wt., respectively, but glucoiberin only presented 0.14 mg/g dry wt. with minor amounts.
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문제 정의
본 연구에서는 토종 청색갓과 적색갓의 잎에서 메탄올로 GSLs를 추출하여 한국인에게 흔히 발병되는 4종류의 암세포(난소암, 간암, 결장암, 유방암)에 처리해 갓의 종류에 따른 항암 활성을 비교 분석하였다. 또한 GSLs의 추출액의 처리 시간을 다르게 하여 처리시간에 따른 항암 활성의 차이도 분석하였다.
제안 방법
Loading이 끝나면 초순수로 column을 3회 세척한 후 하단을 파라필름(parafilm)으로 밀봉한 다음에 aryl sulfatase(75 ㎕)를 loading하고, 상단을 파라필름으로 봉인하여 상온에서 16～18시간 동안 반응시켰다. 그 후, 초순수로 1 ㎖씩 3회 세척하여 걸러진 용액(desulfo-GSLs)을 필터한 다음, HPLC로 분석하였다.
또한 GSLs의 추출액의 처리 시간을 다르게 하여 처리시간에 따른 항암 활성의 차이도 분석하였다. 그리고 청갓과 적갓의 추출물 중 GSLs를 PLC와 LC-MS로 동정 및 정량화 하였다.
본 연구에서는 토종 청색갓과 적색갓의 잎에서 메탄올로 GSLs를 추출하여 한국인에게 흔히 발병되는 4종류의 암세포(난소암, 간암, 결장암, 유방암)에 처리해 갓의 종류에 따른 항암 활성을 비교 분석하였다. 또한 GSLs의 추출액의 처리 시간을 다르게 하여 처리시간에 따른 항암 활성의 차이도 분석하였다. 그리고 청갓과 적갓의 추출물 중 GSLs를 PLC와 LC-MS로 동정 및 정량화 하였다.
여개의 세포가 되도록 희석한다. 적갓과 청갓에서 추출한 GSLs를 PBS로 100배 희석한 용액 600 ㎕를 실온에 준비하여, 추출물 각각에 myrosinase 0.0096 g(2.4 unit)을 투여하고 1시간 30분 동안 교반기 상에서 반응시켰다. 준비한 세포 250 ㎕와 활성화된 glucosinolates를 50㎕를 24-well plate에서 세포주별로 24시간, 48시간 동안 반응·배양한 시킨 다음 bio-assay에 의한 항암 활성을 비교하였다.
Trypan blue를 세포 부유액과 1:1의 부피비로 되도록 혼합하고 1～2분 후 관찰하면 죽은 세포들만 푸른색으로 염색된다. 죽은 세포는 haemacytometer로 계수하여 세포 생존율을 측정하였다.
준비한 세포 250 ㎕와 활성화된 glucosinolates를 50㎕를 24-well plate에서 세포주별로 24시간, 48시간 동안 반응·배양한 시킨 다음 bio-assay에 의한 항암 활성을 비교하였다.
청갓과 적갓에서 추출한 GSLs에 의한 4종류의 암세포주를 이용하여 항암 활성을 조사하였다. 또한 갓 추출물에 함유된 GSLs를 HPLC와 LC-ESI/MS로 분석한 결과는 다음과 같다.
대상 데이터
A-25(GE Healthcare, Sweden)이었다. Desulpho-GSL 용 aryl sulfatase 효소는 Helix promatia(Type H1, Sigma Aldrich Laboratories Inc., St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. GSLs를 분해(isothiocynate 활성)를 위한 thioglucosidase(myrosinase) 효소는 Sinapis alba(White mustard)에서 추출한 것을 Sigma Aldrich Laboratories Inc.
갓의 종자는 국립유전자원센터에서 제공된 것으로서 2010년 5월에 농촌진흥청 포장(수원)에 직접 파종하여 7월에 잎(지상부)을 수확한 다음 곧바로 －70℃ 초저온 냉동기에 보관하였다. 식물체는 얼린 상태로 동결건조(FDS5508, lshinBioBase, Korea) 시킨 다음 분쇄기로 곱게 분말화하였다.
암세포주는 한국세포주은행(KCLB)에서 4종류의 세포주를 분양받아 100 ㎍/㎖ penicillin/streptomycin(GIBCO BRL) 항생제를 혼합한 배지[RPMI1640(Gibco BRL, Carlsbad, USA), 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco BRL)에서 배양(5% CO2, 37℃)하여 사용하였다. 배양된 세포는 일주일에 2～3회 새로운 배지로 갈아주고 4～5일마다 phosphate buffered saline(PBS)로 세척한 후, 0.
암세포주는 한국인의 일반적인 암질병과 관련된 SNU-251 (난소암), SNU-354(간암), SNU-C4(결장암), MCF-7(유방암)와 같은 4종류를 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 계대배양하여 실험에 사용하였다. 암세포주를 배양하는 incubator는 SHEL LAB Sheldon Mfg.
Inc(USA)이었고, 배지는 RPMI1640 (Gibco BRL, Carlsbad, USA), 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco BRL), 100 ㎍/㎖ penicillin/streptomycin(GIBCO BRL) 항생제를 혼합하여 사용하였다. 암세포주를 장기간 보관하기 위해 Recovery Cell Culture Freezing Medium contained in D-MEM with FBS and calf sera(GIBCO)를 사용하였으며, cell counting은 C-Chip DHC-N01(inCYTO, Korea)로 하였으며, 세포 염색용 염료는 Trypan Blue Stain, 0.4%(GIBCO)를 사용하였다.
성능/효과
2. 갓의 주요한 GSLs 성분은 sinigrin이었으며, 청갓이 적갓보다 더 높은 함량을 나타내었으며, 또한 청갓에서만 glucoiberin이 미량으로 검출되었다.
Electrospray ionization(ESI) source를 장착한 single quadrupole Mass Spectrometry에서 positive-ion mode로 분석하였을 때, GSLs의 MS spectrum은 ([M+H]+)와 기본구조로부터 당 한 분자(β-D-glucose, C6H10O5, m/z 162)가 잘려나간 프레그먼트(fragment)([M+H-glucose]+)가 확인되었다(Fig. 1).
GSLs 추출물을 암세포에 처리한 다음에 처리시간에 따른 생존율을 보면, 24시간 처리한 실험군과 48시간 처리한 실험군 사이에서는 MCF-7를 제외한 세포주에서는 24시간 처리구의 항암 활성이 매우 높았다. 세포주별로 처리 시간에 따른 세포생존율을 비교한 결과, SNU-251과 MCF-7의 경우 처리 시간을 48시간으로 했을 경우 생존율 변화가 거의 없었다.
주요 성분은 sinigrin이었으며, MS spectrum에서 해당 DS-sinigrin의 분자량(m/z 280)뿐만 아니라 당이 잘려나간 패턴(m/z 118)을 정확히 확인할 수 있었다. 각 GSL의 정량 결과, sinigrin 함량은 청갓(4.71 ㎎/g dry wt.)이 적갓(3.06)보다 정도 더 높은 함량을 나타내었다(Table 2). 또한 glucoiberin은 청갓에서만 미량(0.
갓에서 추출한 GSLs의 항암 활성 효과는 SNU-354, SNU-C4, SNU-251, MCF-7의 순서로 높게 나타났다. 세포주에 따른 GSLs 추출물의 항암 활성을 비교해 본 결과, SNU-354 세포에서 가장 높은 항암 활성(평균 15% 사멸)을 보이고, MCF-7 세포주에서는 낮은 항암 활성(평균 4.
갓에서 추출한 GSLs의 항암 활성을 분석한 결과, SNU-354(간암)>SNU-C4결정암)>SNU-251(난소암)>MCF-7(유방암) 순으로 높게 나타났다.
1990년대부터 이러한 isothiocyanates는 특히 cytochrome P450, Phase 1 and 2 enzymes와 관련된 항암 예방 효과에 매우 뛰어난 효과를 가진 것으로 알려져 있다(Zhang 등 1992; Zhang & Talalay 1994; Fahey 등 1997). 농촌진흥청이 국내에서 수집․보존하고 있는 토종 갓 240종을 직접 재배하여 GSLs 성분을 조사한 결과, 항암 성분으로 알려진 sinigrin의 함유량이 일반 배추보다 더 많이 함유하고 있는 것으로 확인되었고, 적갓과 청갓에서 그 함유량이 가장 높았다.
갓에서 추출한 GSLs의 항암 활성을 분석한 결과, SNU-354(간암)>SNU-C4결정암)>SNU-251(난소암)>MCF-7(유방암) 순으로 높게 나타났다. 또한 GSLs 추출물의 처리 시간(24, 48시간)에 따르면 적갓 추출물의 항암 효과가 청갓 추출물의 항암 효과보다 큰 것으로 나타났다.
GSLs 추출물을 암세포에 처리한 다음에 처리시간에 따른 생존율을 보면, 24시간 처리한 실험군과 48시간 처리한 실험군 사이에서는 MCF-7를 제외한 세포주에서는 24시간 처리구의 항암 활성이 매우 높았다. 세포주별로 처리 시간에 따른 세포생존율을 비교한 결과, SNU-251과 MCF-7의 경우 처리 시간을 48시간으로 했을 경우 생존율 변화가 거의 없었다.
갓에서 추출한 GSLs의 항암 활성 효과는 SNU-354, SNU-C4, SNU-251, MCF-7의 순서로 높게 나타났다. 세포주에 따른 GSLs 추출물의 항암 활성을 비교해 본 결과, SNU-354 세포에서 가장 높은 항암 활성(평균 15% 사멸)을 보이고, MCF-7 세포주에서는 낮은 항암 활성(평균 4.5% 사멸)이 나타났다. 이와 같은 결과는 Wattenberg & Loud(1987)이 GSLs 중에서 indol-3-carbinol, indol-3-acetonitrile 및 3,3-diindolymethane 등 화합물이 유방암과 위암 등의 종양을 억제한다고 보고한 것과 비교했을 때, 유방암에 대한 효과도 있지만 그보다는 간암 세포에서 항암 활성이 더 높게 나타난 것으로 보인다.
암세포주에 따른 GSLs의 항암 활성을 비교한 결과(Table 1), GSLs는 SNU-354(간암) 세포주에서 가장 높은 항암 활성(평균 15% 사멸)을 보인 반면에 MCF-7(유방암) 세포주에서 가장 낮은 항암 활성(평균 4.5% 사멸)을 나타내었다. 또한 한국인 유래 세포인 SNU-354, SNU-C4(결장암), SNU-251(난소암)의 경우 GSLs의 항암 활성에 큰 차이가 나타나지 않았으나, 백인 유래 세포인 MCF-7의 경우 다른 세포주에 비해 항암 활성이 현저하게 떨어졌다.
1). 주요 성분은 sinigrin이었으며, MS spectrum에서 해당 DS-sinigrin의 분자량(m/z 280)뿐만 아니라 당이 잘려나간 패턴(m/z 118)을 정확히 확인할 수 있었다. 각 GSL의 정량 결과, sinigrin 함량은 청갓(4.
후속연구
3. 항암 활성 평가에서 적갓 GSLs 추출물이 청갓보다 더 높은 활성을 나타낸 것은 GSLs 물질 이외에 다른 물질들이 관여 했을 것으로 생각되므로 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
갓의 용도에 따라 재배지는 어떻게 다른가?
) Czern.)은 배추과에 속하는 1년생 또는 2년생 초본식물로 원산지는 중앙아시아로 추정되고 있으며, 용도에 따라 유료용은 유럽, 인도, 소련 남부에서 재배되고 있으며, 채소용은 중국을 중심으로 아시아에서 많이 재배되고 있다. 우리나라에서 재배되고 있는 일반 재래종 채소용 갓은 퇴화되고 보존이 안 되어 거의 찾아 볼 수 없으며, 현재 재배되고 있는 돌산갓은 50여 년 전 일본 “만 생평경대엽고채” 계통을 도입하여 재배된 것이다.
갓의 매운맛은 무엇에 의한 것인가?
갓의 잎은 넓고 톡 쏘는 매운 맛이 적고 섬유질이 거의 없어 부드럽고 잎과 줄기에 잔털이 없다(농촌진흥청 2003). 갓의 매운맛은 세포조직이 손상을 입을 때 휘발성 성분인 isothiocyanate의 발생에 의한 것으로 특히 갓의 잎에서는 주요한 GSL 성분인 sinigrin이 가수 분해되어 allylisothiocyanate(AITC)가 생성되면서 매운맛이 난다(Choi 등 2001). 생성된 isothiocyanate 성분 들은 효모, 곰팡이, 각종 박테리아 등에 대해 항균력이 있어서 갓김치로 제조 시에 미생물 군에 항균작용을 하여 갓김치의 발효를 지연시켜 저장성을 높여준다(Jeon 등, 1995).
isothiocyanate는 무슨 역할을 하는가?
생성된 isothiocyanate 성분 들은 효모, 곰팡이, 각종 박테리아 등에 대해 항균력이 있어서 갓김치로 제조 시에 미생물 군에 항균작용을 하여 갓김치의 발효를 지연시켜 저장성을 높여준다(Jeon 등, 1995). ITC는 세포자살 유도, 혈관신생 억제, 세포주기 저해에 연관되어 있어 항암 효과가 나타난다. ITC는 시토크롬 c의 mitochondrial release, Bcl-2 집단을 조절하고 MAPK 신호표시 및 세포사멸의 시작에 관여하는 단백질 분해효소를 후속 활성화 시켜 세포자살을 유도하며, VEGF의 표현과 분비를 제한하여 혈관의 신생을 억제한다. AITC를 처리하면 Cdk1, Cdc25B, Cdc25C의 감소조절에 의해 세포주기가 저해된다(Mithen R 2001; Cartea & Velsco 2009; Clarke DB 2010).
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