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문제 정의
- 화학 구조적으로 서로 다른 카테콜 아민류와 세로토닌 신경전달물질들을 생체 시료에서 동시에 추출하고 분석할 수 있는 방법의 개발은 중추신경계 또는 말초신경계 신경전달물질들의 통합적인 연구를 가능케 한다. 본 연구에서는 혈청 시료에서 카테콜류와 인돌유도체를 모두 추출할 수 있는 추출방법을 연구하고 내부 표준물(IS)로 3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid를 사용하여 분절 기울기 용리를 활용한 HPLC/ECD법으로 카테콜류(NE, E, DA, DOPAC)와 인돌 유도체(5HT, 5HIAA)를 합리적인 분석시간에 동시에 정량하는 분석방법을 개발하고 이 분석방법의 정확도, 정밀도, 직선 농도 범위, 검출한계 및 혈청에서의 회수율을 조사하며 스트레스를 준 Sprague-Dawley 흰쥐의 혈청 시료 중 NE와 5HT의 농도 변화를 대조군과 비교 연구 하여서 생체 시료 중 카테콜 아민류와 세로토닌 및 대사물질들을 동시에 분석하는 방법을 제시하고자 한다.
가설 설정
- 0 ml/min와 20 µl이었다. ISSC 기준 전극에 대하여 유리질 탄소 작업 전극에 0.75 V를 가하였다. 분석저울은 Mettler Toledo의 XS 105를 사용하였다.
제안 방법
- C18 cartridge는3 ml의 methanol과 6ml의 초 순수로 세척한 후에 NE, E, DA, DOPAC, 5HIAA 및 5HT 각각의 화합물을 50 nmoles 첨가 한 혈청 1.00 ml를 주입하고 methanol : citrate 완충용액의 비율이 9:1인 추출용매로 1.00 ml씩 2회 연속 추출하고 0.45 µm 멤브레인으로 걸러내어 분석시료를 준비하였다.
- 5분에 나타났다. E와 BA는 잘 분리되지 않았고 DA피크는 methanol피크와 겹쳐 DA양과 관련하여 양(+)의 오차를 초래하였기 때문에 새로운 내부 표준품으로 3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid(IS)를 선택하였고 Table I에 기술된 바와 같이 두 분절에서 이동상 조성 변화를 갖는 기울기 용리로 새로운 IS를 포함하여 7가지 화합물이 잘 분리되었다. 칼럼의 온도는 30℃이었고 Vf는 1.
- IS에 대한 각 X의 피크 면적 비(Ax/AIS) 값에 IS의 농도, 7.35×10-5 M를 곱하고 각 X의 F값으로 나누어 실험적으로 각 X의 농도를 계산하였다.
- NE, E, DA, DOPAC, 5HIAA 및 5HT 각각의 화합물을 50 nmoles 첨가 한 혈청 1.00 ml를 C18 cartridge로 고상 추출한 분석시료 용액은 2회 이상 HPLC/ECD로 분석한 후 각 화합물의 평균 피크 면적을 blank(혈청시료 자체)에 대하여 보정하고 IS의 피크 면적에 대한 각 화합물의 알짜 피크 면적의 비(Rxi)를 계산하였다. 표준용액에 대해서도 IS의 피크 면적에 대한 각 화합물의 피크 면적의 비(Rsi)를 계산한 다음(Rxi/Rsi)×100으로 회수 율을 계산하였다.
- NE, E, DA, DOPAC, 5HIAA, 5HT와 IS로 구성된 5×10-3M 모액을 citrate 완충용액으로 희석하여 5×10-6M~1×10-4M 농도 범위의 표준용액을 제조하였다.
- 또한 citrate 완충용액을 사용하여 NE, E, DA, DOPAC, 5HIAA 및 5HT 각각의 농도가 2.50×10-5M인 표준용액을 제조하였으며 혈청 시료에서 고상 추출한 분석시료 용액과 표준용액에 IS를 각각 2.50×10-5M로 첨가하고 그 중 20 µl를 HPLC/ECD로 분석하였다.
- 멤브레인 필터(Millipore;0.45 µm HA)를 통하여 citrate 완충용액을 여과한 후 20분간 음파파쇄를 하였다.
- 본 HPLC/ ECD 방법의 정확도를 조사하기 위해 5.96×10-5 M NE, 8.82×10-5 M E, 4.42×10-5 M DA, 7.35×10-5 M DOPAC, 2.94×10-5 M 5HIAA 및 1.48×10-5 M 5HT로 구성된 표준용액을 pH 4.0, 0.0500 M citrate 완충용액으로 제조하고 7.35×10-5 M IS를 사용한 분절 기울기 용리법으로 9회 반복 분석하였다.
- 본 연구에서 제시한 HPLC/ECD 방법의 정확도를 조사하기 위해 5.96×10-5M의 NE, 8.82×10-5M의 E, 4.42×10-5M의 DA, 7.35×10-5M의 DOPAC, 2.94×10-5M의 5HIAA와 1.48×10-5M의 5HT로 구성된 표준용액을 pH 4.0, 0.0500 M citrate 완충용액으로 제조하고 7.35×10-5M의 IS를 사용하여 9회 반복 분석하였다.
- NE, E, DA, DOPAC, 5HIAA 또는 5HT에 대한 전기화학 검출기(ECD)의 감응 인자(F)는 같은 농도의 내부 표준품인 3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid(IS)의 피크 면적에 대한 각 화합물의 피크 면적의 비이다. 본 연구에서는 각 화합물의 F는 IS의 피크 면적에 대한 각 화합물(X)의 피크 면적의 비를 각각의 농도에서 5회(또는 10회) 측정하여 평균하고 이 값에 농도 인자([IS]/[X])를 곱하여 계산한 후 서로 다른 농도에서의 각 X의 F값을 평균하여 계산하였다(Table IV). 각 화합물의 F값은 다음과 같았다.
- 본 연구에서는 예전에 사용되었던 알루미나 추출법으로 생체시료를 추출하고 등용매 용리로 분석하는 대신 C18 cartridge를 사용하여 생체 시료를 전 처리하고 30℃에서 C18(5 µm 4.6×150 mm)칼럼을 통하여 분절 기울기 용리방법으로 norepinephrine(NE), epinephrine(E), dopamine(DA), serotonin(5HT), 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC)와 5-hydroxyindoleacetic acid(5HIAA)를 3,4-dihydroxyhydrocinnamic aicd를 내부 표준품(IS)으로 사용하여 20분이내에 동시 정량분석 하였다.
- 45 µm 멤브레인으로 걸러내어 분석시료를 준비하였다. 사람의 혈청시료 자체에 포함된 신경전달물질들을 분석하기위해 혈청 1.00 ml를 세척한 C18 cartridge에 주입한 후 동일한 방법으로 추출하였다. 또한 citrate 완충용액을 사용하여 NE, E, DA, DOPAC, 5HIAA 및 5HT 각각의 농도가 2.
- 위에 기술한 HPLC조건으로 각각의 표준용액을 5회(5×10-6M는 10회) 반복 실험하였다.
- 참수한 흰쥐의 혈청시료를 C18 cartridge 로 고상 추출한 HPLC 분석시료 중 각각의 화합물(X), 즉 NE 와 5HT의 농도는 IS에 대한 각 X의 피크 면적 비(Ax/AIS) 값에 IS의 농도, 4.67×10-6 M를 곱하고 각 X의 F값(NE; 1.217, 5HT;2.081)으로 나누어 실험적으로 각 X의 농도를 계산하였다.
- 카테콜 아민류, 세로토닌과 대사물질들을 분리 분석하기 위하여 처음에는 benzyl amine(BA)을 내부 표준품으로 사용하고 분절 기울기 용리(pH 4.0 citrate 완충용액을 실험 시작 후 7분간 칼럼을 통하여 흐르게 하고 그 후 8분 까지 methanol을 10%로 증가하여 완충용액 : methanol의 부피 비를 9:1한 이동상을 분석 종료 시점까지 유지)를 시도하였다. 칼럼의 온도와 흐름 속도 (Vf)는 각각 20℃와 1.
- 칼럼은 30℃로 항온 유지된 Waters XbridgeTM C18(5 µm 4.6×150 mm), 보호 칼럼은 Agilent Eclipse XDB-C18(5 µm 4.6×12.6 mm)이며 이동상은 methanol과 pH 4.0 citrate 완충용액의 혼합액으로서 Table I에 나타낸 바와 같이 4.0~4.5분 및 10.0~10.5분 사이에 이동상의 조성 변화를 갖는 분절 기울기 용리를 실행하였다.
- 혈청 추출용액 중 신경전달물질의 정량 분석은 4.67×10-6 M IS의 피크 면적에 대한 신경전달물질들의 피크 면적의 비와 검출기의 감응인자로부터 계산하였다.
- 혈청시료 5.00 ml를 세척한 C18 cartridge에 주입한 후 methanol : buffer의 비율이 9:1인 추출용매로 1.00 ml씩 2회 연속 추출하고 0.45 µm 멤브레인으로 걸러내었으며 여과 액 500 µl에 9.804×10-5 M IS를 25 µl 주입하여 IS의 농도가 4.67×10-6 M로 첨가된 혈청 추출용액 20 µl를 HPLC 분석시료로 사용하였다.
대상 데이터
- Citrate 완충용액(pH 4.0, 0.0500 M)은 Sigma-Aldrich(U.S.A.)에서 구입한 citric acid(FM 192.12) 9.606 g, NaCl(FM 58.44) 5.844 g, 1-octanesulfonic acid sodium salt 20.0 mg, Na2EDTA·2H2O 20.0 mg, sodium metabisulfite 20.0 mg 및 0.014 ml의 triethylamine(Junsei, Japan)을 800 ml의 초 순수에 녹이고 1.0 M NaOH(Sigma-Aldrich)용액을 사용하여 pH를 4.0으로 조절한 뒤 초 순수로 1000 ml까지 희석하였다.
- HPLC 등급(100%) methanol은 J. T. Baker에서 구입 하였고 norepinephrine L-bitartrate hydrate(C12H17NO9· xH2O, FM 319.27, 99%; NE), (-)-epinephrine (+)-bitartrate salt(C9H13NO3·C4H6O6, FM 333.30, 98%; E), 3-hydroxytyramine hydrochloride(C8H11NO2·HCl, FM 189.64, ≥98%, dopamine hydrochloride; DA), 3,4-dihydroxyphenylacetic aicd (C8H8O4, FM 168.15, 98%; DOPAC), 5-hydroxyindole-3-acetic acid(C10H9NO3, FM 191.18, ≥98%; 5HIAA), serotonin hydrochloride(C10H12N2O·HCl, FM 212.68, ≥98%, 5-hydroxytryptamine hydrochloride; 5HT)와 3,4-dihydroxyhydrocinnamic aicd(C9H10O4, FM 182.17, 98%; IS)는 모두 Sigma-Aldrich(U.S.A.)의 제품이었다.
- Sprague-Dawley(SD) strain의 성숙한 암컷 흰쥐(250~300 g;생후 11개월)를 상명대학교 실험동물 사육장에서 18~22℃로 일정하게 유지되는 온도와 일정한 광주기(12시간 조명, 12시간 소등), 그리고 먹이와 물의 접근을 자유롭게(ad libitum) 사육하고 실험에 사용하였다. 스트레스를 주기위한 실험 모델은 흰쥐를 30분 간 움직이지 못하게 몸통을 플라스틱 원통에 넣어 속박시키고, 대조군은 자유롭게 사육된 흰쥐를 사용하였다.
- 75 V를 가하였다. 분석저울은 Mettler Toledo의 XS 105를 사용하였다.
- 사람의 혈청(from human male AB plasma)은 Sigma-Aldrich에서, 회수율 검사에 사용한 카트리지는 Sep-Pak® Plus C18으로서 Waters(U.S.A.)에서 구입하였다.
- Sprague-Dawley(SD) strain의 성숙한 암컷 흰쥐(250~300 g;생후 11개월)를 상명대학교 실험동물 사육장에서 18~22℃로 일정하게 유지되는 온도와 일정한 광주기(12시간 조명, 12시간 소등), 그리고 먹이와 물의 접근을 자유롭게(ad libitum) 사육하고 실험에 사용하였다. 스트레스를 주기위한 실험 모델은 흰쥐를 30분 간 움직이지 못하게 몸통을 플라스틱 원통에 넣어 속박시키고, 대조군은 자유롭게 사육된 흰쥐를 사용하였다. 흰쥐를 참수시켜 채취한 혈액은 14,000 rpm에서 30분 간 원심 분리하고 상층 액인 혈청시료를 사용하였다.
- 시약은 모두 1급 이상 분석용 시약을 사용하였으며 용액은 초순수 제조장치(ELGA Purelab Classic, UK)를 통과시켜 물의 전기저항이 18.0 MΩ 이상인 순수를 사용하여 제조하였다. Citrate 완충용액(pH 4.
이론/모형
-
혈청 중 NE, E, DA, DOPAC, 5HIAA 및 5HT의 회수율 검사
사람의 혈청으로부터 카테콜 아민류, 세로토닌 및 대사물질들을 추출하기 위하여 처음에는 문헌에 제시되었던 alumina 추출법을 시도하였으나9) 5HIAA와 5HT의 인돌화합물은 전혀 회수되지 않아서 C18 고상추출법10)을 사용하였다. C18 cartridge는3 ml의 methanol과 6ml의 초 순수로 세척한 후에 NE, E, DA, DOPAC, 5HIAA 및 5HT 각각의 화합물을 50 nmoles 첨가 한 혈청 1.
성능/효과
- 9%이었다. 3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid를 내부 표준품으로 사용하여 분절 기울기 용리법을 적용한 본 HPLC/ECD 방법의 정확도와 정밀도는 합리적이었다.
- 7가지 화합물에 대한 날자간 정밀도(inter-day precision)는 표준용액을 제조한 당일, 둘째 날, 다섯째 날에 실험한 각 화합물의 평균 피크 면적으로부터 계산하였으며, 5×10-6 M(5.3~10.0%)를 제외하고는 모두 0.4%와 7.2% 사이의 RSD(%)를 나타내었다(Table III).
- 국내외에서 널리 사용되고 있는 교과서에서도 HPLC/ECD를 사용할 때에는 기울기 용 리가 유용하지 않은 것으로 기술하고 있다.8) Serotonin(5HT)과 그 대사물질인 5-hydroxyindoleacetic acid(5HIAA)의 화학구조는 카테콜 고리(3,4-dihydroxyphenyl moiety)를 포함하고 있는 카테콜 아민류의 구조와 다르기(Fig. 1) 때문에 등용매 용리를 사용하여 이러한 신경전달물질들을 동시에 분석하려면 30분정도의 긴 분석시간7) 또는 분리가 잘 안 되는 결과5)를 초래하였다. 구조적으로 유사한 카테콜 아민류와 그 대사물질 만이 합리적인 분석시간 내에 등용매 용리로 분리 될 수 있었으며3,4,6) 문헌상 기울기 용리를 채택한 HPLC/ECD법은 보고된 바 없다.
- 표준용액에 대해서도 IS의 피크 면적에 대한 각 화합물의 피크 면적의 비(Rsi)를 계산한 다음(Rxi/Rsi)×100으로 회수 율을 계산하였다. Methanol의 농도가 낮은 추출용매인 MeOH : citrate 완충용액(1.0 : 9.0) 1 ml의 경우 5HIAA 및 5HT는 전혀 혈청에서 회수되지 않았으며 methanol의 농도가 커질수록 인돌류 화합물인 5HIAA 및 5HT의 회수율이 증가하는 경향을 보였다. C18 cartridge를 3ml의 methanol과 6ml의 초 순수로 세척한 후에 NE, E, DA, DOPAC, 5HIAA 및 5HT 각각의 화합물을 50 nmoles 첨가 한 혈청 1.
- 그 결과 Table VII에 나타난 바와 같이 HPLC 분석시료 중 대조군에서 NE와 5HT의 농도는 각각 1.99×10-6 M와 5.61×10-6 M이었으며 스트레스를 받은 흰쥐에서의 NE와 5HT의 농도는 각각 1.11×10-5 M와 7.92×10-6 M이었다.
- 67×10-6 M IS 피크이다. 대조군과 스트레스를 준 흰쥐의 분석시료를 각각 3회 반복하여 크로마토그램을 그렸을 때 측정한 각 화합물의 피크면적에 대한 정밀도는 1.0~3.2%로 합리적 이었다. 참수한 흰쥐의 혈청시료를 C18 cartridge 로 고상 추출한 HPLC 분석시료 중 각각의 화합물(X), 즉 NE 와 5HT의 농도는 IS에 대한 각 X의 피크 면적 비(Ax/AIS) 값에 IS의 농도, 4.
- 본 연구의 HPLC/ECD방법으로 1.48×10-5M ~8.82×10-5 M 범위의 NE, E, DA, 5HT, DOPAC과 5HIAA로 구성된 표준 용액에 대하여 9회 반복 정량하였을 때 각 화합물에 대한 정밀도(상대 표준편차)는 0.4% 내지 1.9% 범위 이었고 정확도(상대 오차)는 -1.4% 내지 1.1%로 합리적 이었다.
- 8분에 피크가 나타났다. 분석시료에 NE 표준용액을 첨가하였을 때 머무름 시간 3.2분의 피크면적이 증가하였고 분석시료에 5HT의 표준용액을 첨가하였을 때 15.2분의 피크면적이 증가함으로서 3.2분과 15.2분의 피크는 각각 NE와 5HT로 확인되었다. 머무름 시간 16.
- 45 µm 멤브레인으로 걸러낸 분석시료에 대한 회수율을 Table VI에 수록하였다. 사람의 혈청 시료 자체에서는 NE만 검출되었고 다른 신경전달물질들은 검출되지 않았다. 혈청 시료 중 각 화합물의 회수율(%)은 NE; 57%, E; 60%, DA; 80%, DOPAC;84%, 5HIAA; 80% 그리고 5HT; 86%이었다.
- 6×10-6M 로 추정된다. 스트레스를 받은 쥐는 안 받은 쥐에 비하여 혈청 중 NE와 5HT의 농도가 각각 5.6배와 1.4배로 더 높게 나타났다.
- 참수한 Sprague-Dawley 흰쥐의 혈청 중 NE와 5HT의 농도는 각각 1.4×10-6 M와 2.6×10-6 M로 분석되었으며 30분간 몸통을 플라스틱 원통에 넣어 스트레스를 준 흰쥐에서 NE와 5HT의 농도는 각각 5.6배와 1.4배로 더 높게 나타났다.
- 사람의 혈청 시료 자체에서는 NE만 검출되었고 다른 신경전달물질들은 검출되지 않았다. 혈청 시료 중 각 화합물의 회수율(%)은 NE; 57%, E; 60%, DA; 80%, DOPAC;84%, 5HIAA; 80% 그리고 5HT; 86%이었다.
- 4배로 더 높게 나타났다. 혈청 시료를 C18 cartridge를 사용하여 고상 추출하고 3,4-dihydroxyhydrocinnamic aicd를 내부 표준품으로 분절 기울기 용리법을 시도한 본 연구의 HPLC/ECD법은 생체 시료 중 카테콜 아민류와 세로토닌 및 대사물질들을 20분 이내에 동시에 정량할 수 있음을 입증하였다.
후속연구
- 이와 같이 예전의 연구에서는 시료의 전처리나 용리방법의 문제로 인하여 생체 시료 중 카테콜 아민류와 대사물질 또는 세로토닌과 대사물질을 구분하여 연구가 진행되었다고 사료된다. 화학 구조적으로 서로 다른 카테콜 아민류와 세로토닌 신경전달물질들을 생체 시료에서 동시에 추출하고 분석할 수 있는 방법의 개발은 중추신경계 또는 말초신경계 신경전달물질들의 통합적인 연구를 가능케 한다. 본 연구에서는 혈청 시료에서 카테콜류와 인돌유도체를 모두 추출할 수 있는 추출방법을 연구하고 내부 표준물(IS)로 3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid를 사용하여 분절 기울기 용리를 활용한 HPLC/ECD법으로 카테콜류(NE, E, DA, DOPAC)와 인돌 유도체(5HT, 5HIAA)를 합리적인 분석시간에 동시에 정량하는 분석방법을 개발하고 이 분석방법의 정확도, 정밀도, 직선 농도 범위, 검출한계 및 혈청에서의 회수율을 조사하며 스트레스를 준 Sprague-Dawley 흰쥐의 혈청 시료 중 NE와 5HT의 농도 변화를 대조군과 비교 연구 하여서 생체 시료 중 카테콜 아민류와 세로토닌 및 대사물질들을 동시에 분석하는 방법을 제시하고자 한다.
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