선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 sonicator를 장착하여 세포막을 파쇄하고 현장에서 형광을 이용하여 조작이 간편하고 단시간에 DNA를 측정할 수 있는 자동화 된 형광기를 개발하기 위하여 포자인 Bacillus anthracis Δ-strene을 대상으로 최적의 세포 파쇄조건을 확립하고자 하였다.
- 포자를 파쇄하는 연구는 고주파를 이용한 초음파 파쇄방법[3-4], bead와 초음파 파쇄의 혼용 방법[5-6], bead mill homogenization를 이용하는 방법[7-8] 등 다양하게 연구 되었지만, 현장에서 직접 DNA 탐지를 위한 체계적인 연구는 미약하여, 본 연구에서는 sonicator를 장착하여 세포막을 파쇄하고 현장에서 형광반응을 이용하여 조작이 간편하고 단시간에 포자의 DNA를 측정할 수 있는 자동화 된 형광기를 개발하기 위하여 포자인 Bacillus anthracis Δ-sterne를 대상으로 최적의 세포막 파쇄조건을 확립하고자 하였다.
제안 방법
- 한 실험구에서는 zirconia bead를 첨가하지 않고 0, 104, 105, 106, 107, 108 CFU/mL의 Bacillus anthracis Δ-sterne 포자 2 mL를 15 mL의 disposable centrifuge tube에 주입하고, 다른 시험구에서는 포자 1.5 mL를 15 mL의 disposable centrifuge tube에 주입하고 zirconia bead를 0.5 g을 첨가하였다.
- DNA의 형광은 OptiPlate Black 96-Well plate (PerkinElmer사, 6005279)에 시료 180 μL를 혼합하여 200 μL를 분주하고 1분동안 반응을 시킨 후 PerkinElmer사의 1,420 Multilabel Counter (Ex. 485 nm/Em. 535 nm, CW-Lamp Energy: 1548, counting time: 1 sec)를 이용하여 측정하였다.
- 또한 포자를 초음파로 처리하는 시간이 길수록 zirconia bead를 첨가한 시험군은 zirconia bead를 첨가하지 않은 시험군 보다 형광 값이 높게 나타나서 zirconia bead 첨가시 포자의 파쇄가 훨씬 잘 일어나는 것으로 판단된다. Zirconia bead 첨가 유무에 따른 포자의 파쇄 효과를 관찰하기 위하여 포자 입자의 부피 변화를 측정하였다. Zirconia bead를 첨가하지 않은 시험군의 측정 결과를 Fig.
- 20 kHz sonicator는 Sonic & Materials사의 130 Watt Ultrasonic Processor (VCX 130)를 사용하였다. sonication에 따른 시료의 형태 변화는 Scanning Electron Microscope (Hitachi S-3000N)를 이용하여 분석하였다.
- zirconia bead 0 g, 0,4 g, 0,5 g, 0.67 g, 1 g을 108 CFU/mL의 포자 2 mL, 1.6 mL, 1.5 mL, 1.33 mL, 1.0 mL에 각각 혼합하여 15 mL의 disposable centrifuge tube에 주입하고 직경이 13mm probe를 사용하여 시료 표면에서 10 mm 잠기게 한 후, 각각 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60초 동안 sonication 시키고 형광시약 SybrGreen의 농도를 1.0X가 되도록 첨가하여 DNA의 형광량을 각각 4회 측정하여 평균하였다.
- zirconia bead가 포자를 초음파로 파쇄할 때 미치는 파쇄 영향을 살펴보기 위하여 총 파쇄하는 시료 부피가 2 mL가 되게 108 CFU/mL의 Δ-sterne 포자와 zirconia bead의 비율이 1 : 0, 4 : 1, 3 : 1, 2 : 1, 1 : 1이 되도록 하였다.
- 단백질 및 DNA와 결합하여 형광을 발생하는 Quant-iT 및 SybrGreen 형광시약을 이용하여 Bacillus anthracis Δ-sterne 포자의 농도별로 초음파 처리후 측정한 형광값 측정 결과는 Fig. 1에 나타냈다.
- 단백질을 측정하는 Quant-iT 시약과 포자와의 반응성을 알아보고, 초음파 처리가 포자에 미치는 파쇄 영향을 알아보기 위하여 0, 105, 106, 107, 108, 109 CFU/mL의 Bacillus anthracis Δ-sterne 포자 2 mL를 15 mL의 disposable centrifuge tube에 주입하여 직경이 13 mm probe를 사용하여 20 kHz에서 20초 동안 sonication하고, 형광시약 SybrGreen과 Quant-iT의 농도를 1.0X가 되도록 첨가하여 DNA와 단백질의 형광량을 각각 4회 측정하여 평균하였다.
- 또한 이때 시료 중의 미생물 입자의 부피 변화를 sonication 시간별로 3회 측정하여 평균하였고 시간별로 sonication시킨 시료 100 μL를 3개로 분주하고 각각 colony counting하고 평균하여 생균수를 측정하였으며, 시료 중의 포자 입자가 sonication 시간에 따른 형태의 변화를 SEM 영상으로 관찰하였다.
- 0 mL/L, 50% (w/v) 포도당/L, Agar 15 g/L)에 접종하여 37℃에서 7일 동안 배양한 후 배지 표면에 있던 포자를 수확하고 lysozyme (200 mg/mL)을 첨가하여 37℃ 항온수조에서 10분 동안 처리하고 8,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 침전물을 수확하였다. 배양 후 얻어진 조포자액으로부터 순수한 포자를 얻기 위해 여러 단계의 정제 과정을 실시하였다. 즉, 4배의 멸균증류수로 3회 반복하여 세척한 후 65℃에서 30분동안 열처리하여 잔존하는 영양세포를 제거하였고, 이를 다시 4배의 멸균증류수로 4℃에서 10분동안 2,000 g에서 원심분리를 3회 반복하여 세척된 용액을 순수포자 원액으로 사용하였다[9].
- 용액중의 미생물 입자 부피는 시료 100 μL를 10 mL의 Diluent에 희석하여 20 mL의 sample cup에 넣고 Beckman사의 Multisizer-3 (Aperture size 30 μm, 300 Size Bins)를 이용하여 측정하였다.
- 5 g을 첨가하였다. 직경이 13 mm probe를 사용하여 시료 표면에서 10 mm 잠기게 한 후 각각 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60초 동안 sonication 시켜 형광시약 SybrGreen의 농도를 1.0X가 되도록 첨가하여 DNA의 형광량을 각각 4회 측정하여 평균하였다. 또한 이때 시료 중의 미생물 입자의 부피 변화를 sonication 시간별로 3회 측정하여 평균하였고 시간별로 sonication시킨 시료 100 μL를 3개로 분주하고 각각 colony counting하고 평균하여 생균수를 측정하였으며, 시료 중의 포자 입자가 sonication 시간에 따른 형태의 변화를 SEM 영상으로 관찰하였다.
- 5 g을 첨가하였다. 직경이 13 mm probe를 사용하여 시료를 20 kHz에서 20초 동안 sonificating시키고, 형광시약 SybrGreen의 농도를 1.0X가 되도록 첨가하여 DNA의 형광량을 각각 4회 측정하여 평균하였다.
대상 데이터
- 20 kHz sonicator는 Sonic & Materials사의 130 Watt Ultrasonic Processor (VCX 130)를 사용하였다.
- SybrGreen Green 1 nucleic acid gel stain 형광시약은 Molecular Probes사 (S7563), BSA와 Quant-iT Protein Assay Kit는 Molecular Probes사 (Q33210), zirconia bead는 BioSpec Products사 (11079101z, 0.1 mm)의 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용한 포자 균주는 Bacillus anthracis Δ-sterne이며, 포자 제조방법은 활성화 시킨 배양액을 접종액으로 사용하여 포자를 수확하였다.
성능/효과
- Zirconia bead를 첨가하여 초음파 파쇄를 시킨 포자 시험군은 zirconia bead를 첨가하지 않고 초음파 파쇄를 시킨 포자 시험군 보다 형광값이 높게 나타나서 zirconia bead의 첨가가 포자의 파쇄에 중요한 역할을 하는 것으로 판단되었다. 이러한 사실은 초음파 파쇄 전후의 포자 입자의 푸비 변화와 생균수 변화를 통해서도 확인되었다.
- Zirconia bead를 첨가한 시험군에서는 106 CFU/mL 농도의 포자를 탐지 가능한 것으로 나타났으며, zirconia bead를 첨가하지 않은 시험군에서는 5 × 107 CFU/mL의 농도에서 탐지 가능한 것으로 나타나 sonication으로 포자를 파쇄할 때 zirconia bead는 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
- 7,8에 나타내었다. zirconia bead를 첨가하지 않은 시험군은 sonication 시간에 따라 포자의 표면 변화가 약간 발생되어 일부 leaking이 발생한 것으로 나타났으며, sonication으로 포자를 파쇄하는데 zirconia bead가 큰 상승 작용을 하는 것으로 나타났다.
- 5에 나타내었다. 두 시험군 모두 원래 포자 크기에서 입자의 부피가 감소 되었으나 zirconia bead를 첨가하지 않은 시험군에서 작은 크기의 입자가 증가가 훨씬 뚜렷하여 전체적으로 zirconia bead를 첨가한 시험군이 훨씬 파쇄가 잘 일어나는 것으로 나타났다. 생균수의 변화를 측정한 Fig.
- Zirconia bead를 첨가한 시험군에서는 106 CFU/mL의 농도의 포자를 탐지 가능하였다. 따라서 Zirconia bead와 포자를 1 : 3 비율로 혼합한 후 20초 동안 sonication하는 것이 포자의 최적 파쇄조건으로 나타났다.
- 3에서, sonication기간이 10초까지는 파쇄가 잘되어 형광량이 증가하나 10초 이후에는 sonication에 의한 마찰열 발생으로 DNA의 변성에 의해 형광량이 감소하는 것으로 판단된다. 또한 포자를 초음파로 처리하는 시간이 길수록 zirconia bead를 첨가한 시험군은 zirconia bead를 첨가하지 않은 시험군 보다 형광 값이 높게 나타나서 zirconia bead 첨가시 포자의 파쇄가 훨씬 잘 일어나는 것으로 판단된다. Zirconia bead 첨가 유무에 따른 포자의 파쇄 효과를 관찰하기 위하여 포자 입자의 부피 변화를 측정하였다.
- 포자와 zirconia bead의 비율이 1 : 1, 2 : 1, 3 : 1, 4 : 1인 시료는 포자 만을 파쇄한 시료 보다 형광값이 훨씬 높게 나타나 초음파로 포자를 파쇄 할 때 zirconia bead의 사용은 유용한 방법으로 판단된다. 하지만 포자와 zirconia bead의 비율에 따른 차이는 zirconia bead의 양이 많을수록 높은 경향은 있으나 유의성은 없는 것으로 나타났다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.