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문제 정의
- 식물의 성장에 필수 원소인 철을 공급하는 역할을 수행하는 siderphores합성능력에 대해 평가하였다. Siderphores합성능은 양성과 음성으로 구분하여 균주 주변에 orange halo가 생기면 양성으로 평가하였다.
- 이에 본 연구에서는 해안사구에서 서식하고 있는 6종의 토착식물 중에 식물성장촉진 능력이 있으면서 동시에 염분에 강한 내성을 가지는 근권세균을 분리하여 colony library를 구축 하였고, 그들의 식물성장촉진 활성을 확인하여 염분내성능력과 식물성장촉진능력의 상관관계를 분석하였다.
제안 방법
- 분홍색으로 발색되는 정도는 530 nm의 파장 영역에서 흡광광도계(HACH, USA)를 이용하여 측정하였다. 3-Indoleacetic acid (C8H6N-CH2COOH, SHOWA chemical Co., Japan)를 이용하여 동일한 방법으로 실험을 수행한 후 검량선을 작성하여 OD값을 IAA 농도로 환산하였다.
- 6종의 식물 근권토양과 뿌리로부터 분리한 95개의 근권세균 colony들을 대상으로 식물성장촉진 능력을 비교 평가하였다. Fig.
- 6종의 식물 근권토양과 뿌리조직에서 분리한 세균 중에서 PGPA를 가진 세균을 대상으로 각각의 식물성장 촉진능력과 내염성간의 상관관계 분석을 수행하였다(Table 3). 그 결과 ACC deaminase 활성과 siderphore(s) 합성능 사이에는 양의 상관관계를 형성하였다(r=0.
- 95개의 균주를 대상으로 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC)를 제거하는 ACC deaminase 활성을 비교 평가하였다. 실험한 균주 중 JS1RS3, MH1RS8, 그리고 SH1RP8가 0.
- ACC deaminase 활성은 다음과 같은 방법으로 평가하였다(실험에 사용된 배지는 (NH4)2SO4 대신 3 mM의 ACC를 넣은 DF medium이다). 분리된 각각의 colony들을 배지에 접종하여 30℃에서 180 rpm으로 48시간 동안 배양하였다.
- 선별된 균주의 염분 내성을 평가하기 위해 LB broth 10 mL에 colony를 접종 한 후, 1일간 전배양하였다. NaCl 농도가 0.0, 4.0, 그리고 8.0%가 되도록 주입한 LB broth를 제조한 후 10 mL culture tube에 배지 3 mL씩 분주한 후 전배양액을 5%가 되도록 접종하였다. 접종 후, shaking incubator 에서 30℃, 180 rpm으로 4일간 배양하며, 매일 시료를 채취하여 600 nm 파장의 흡광광도계(HACH, USA)에서 흡광도를 측정하여 colony의 성장 여부를 평가하였다.
- 식물의 성장에 필수 원소인 철을 공급하는 역할을 수행하는 siderphores합성능력에 대해 평가하였다. Siderphores합성능은 양성과 음성으로 구분하여 균주 주변에 orange halo가 생기면 양성으로 평가하였다.
- 각각의 세균을 CAS blue agar plate에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였으며, colony 주변에 orange halo가 형성되는 경우를 siderphores 합성 양성으로 평가하였다.
- 분리된 각각의 colony들을 배지에 접종하여 30℃에서 180 rpm으로 48시간 동안 배양하였다. 배양기간 동안 흡광광도계를 이용하여 4시간마다 600 nm에서 흡광도를 측정하였다[4].
- 본 연구에서는 경기도 궁평항 지역의 해안사구에 서식하고 있는 토착식물 6종(Rorippa islandica, Rumex crispus, Artemisia princeps var. orientalis, Lilium sp Stellaria media, and Gramineae)의 식물 뿌리와 근권토양으로부터 colony library를 구축하여 식물성장촉진 능력과 내염능을 평가하였다. 분리한 근권세균 중 4.
- 분리한 colony들을 대상으로 식물성 호르몬인 IAA 생산 능을 다음과 같은 방법으로 평가하였고, 모든 실험은 3반복 하였다. 0.
- 5 mL)를 1:2(v/v)의 비율로 섞은 후 상온에서 20분간 정치하였다. 분홍색으로 발색되는 정도는 530 nm의 파장 영역에서 흡광광도계(HACH, USA)를 이용하여 측정하였다. 3-Indoleacetic acid (C8H6N-CH2COOH, SHOWA chemical Co.
- 선별된 균주의 염분 내성을 평가하기 위해 LB broth 10 mL에 colony를 접종 한 후, 1일간 전배양하였다. NaCl 농도가 0.
- 0%가 되도록 주입한 LB broth를 제조한 후 10 mL culture tube에 배지 3 mL씩 분주한 후 전배양액을 5%가 되도록 접종하였다. 접종 후, shaking incubator 에서 30℃, 180 rpm으로 4일간 배양하며, 매일 시료를 채취하여 600 nm 파장의 흡광광도계(HACH, USA)에서 흡광도를 측정하여 colony의 성장 여부를 평가하였다.
대상 데이터
- 사구토양에서 채취한 식물의 뿌리(rhizoplane, RP)와 근권 토양(rhizosphere soil, RS)을 대상으로 각각의 시료에 서식하고 있는 세균의 library를 다음과 같이 준비하였다. 뿌리는 멸균수로 차례로 처리한 다음, 막자 사발을 이용하여 각 식물의 뿌리 1 g을 분쇄하였다.
데이터처리
- Correlation coefficient analysis was carried out for significance at the 1% level (p<0.01**).
- Correlation coefficient analysis was carried out for significance at the 5% level (p<0.05*).
- 각각의 근권토양과 식물뿌리 조직으로부터 분리한 세균의식물 생장 촉진 능력(plant growth promoting ability, PGPA)의 특성을 내염능의 차이에 따라 비교하기 위하여 이변량 상관계수(bivariate correlation coefficient) 분석을 수행하였다 (SPSS 14.0K).
이론/모형
- Siderphores 합성능은 chrom azurol S (CAS) blue agar plate assay 방법을 이용하였다 [28]. siderphores indicator인 dark-blue dye solution의 제조방법은 다음과 같다: 50 mL 증류수에 60.
성능/효과
- 0%의 염분이 존재하는 환경에서 50% 이상의 세균이 염분에 강한 내성을 가지고 있었다. 95개의 균주를 대상으로 식물성호르몬인 IAA생산능을 가지는 균주는 근권토양에서는 13.9%, 식물뿌리에서는 7.6%였으며, 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC)를 제거하는 ACC deaminase 활성을 가진 균주는 근권토양에서는 55.8%, 뿌리에서는 36.6%였다. 또한, Siderphores 합성능을 가지고 있는 균주는 근권에서 62.
- IAA 생산능, ACC deaminase 활성 및 siderphore(s) 합성능을 동시에 가진 근권세균은 소리쟁이의 뿌리로부터 분리된 세균(28.6%)에서 가장 높았다. 서식지별로 분리하여 PGPA 3가지를 모두 가지고 있는 근권세균은 근권토양(RS)은 6.
- Siderphores 합성능을 가지고 있는 PGPR의 비율을 비교 하면 나리류에서 분리된 균주가 47.6% (10/21)로 가장 높았으며, 소리쟁이, 속속이풀, 별꽃, 사초과 그리고 쑥에서 분리된 균주의 순서로 높았다(각각 45.5%, 35.7%, 30.8%, 27.3% 그리고 21.4%)(Table 2). 식물 별 근권토양에서 분리된 균주와 뿌리에서 분리된 균주로 비교하였을 경우에는 JS1RP, JS2RS, SH1RS가 각각 50%(각각 4/8, 2/4, 4/8)로 가장 높았으며, MH1RP가 10% (1/10)로 가장 낮았다.
- 그 결과 ACC deaminase 활성과 siderphore(s) 합성능 사이에는 양의 상관관계를 형성하였다(r=0.605, p<0.037).
- 0%의 염분을 가지고 있었기 때문에 분리된 colony의 50% 이상이 염분에 강한 내성을 가지고 있다고 판단된다. 또한 근권토양과 뿌리에서 서식하는 균주 중 4.0%의 염분 조건에서 OD 0.5 이상 생장을 보인 균주가 각각 21개와 19개로 서식지에 별 영향을 받지 않고 비슷하게 나타났다. 이러한 경향은 8.
- 또한, JS2RP3, SH1RS4, 그리고 SH1RP8도 6.1 ± 0.5 ~ 19.4 ± 3.3 mg·L-1으로 높은 농도의 IAA를 생산하였고(Fig. 1) 동시에 염분에 강한 내성을 가지고 있었다(Table 1).
- 6%였다. 또한, Siderphores 합성능을 가지고 있는 균주는 근권에서 62.7%, 뿌리에서는 50%를 차지하였다. 식물성장촉진능과 내염능을 가진 세균을 대상으로 상관관계를 분석한 결과, ACC deaminase 활성과 siderphore(s) 합성능 사이에는 양의 상관관계를 형성하였고(r=0.
- 2). 또한, 각 식물 별로 ACC deaminase 활성을 가지고 있는 PGPR의 비율을 비교 하면 소리쟁이가 45.5% (5/11)로 가장 높았으며, 그 다음으로는 속속이풀로 30% (3/10)였고, 쑥, 나리류, 사초과가 비슷한 수준으로 각각 28.6% (4/14), 28.6% (6/21) 그리고 27.3% (6/22) 이었다. 별꽃의 경우, ACC deaminase 활성을 지닌 세균의 비율은 7.
- 또한, 식물 종류에 따라서는 10~50%의 근권세균이 ACC deaminase 활성을 가지고 있었고 서식지 별로는 근권토양에서 분리된 균주(32.6%)가 식물의 뿌리에서 분리된 균주 (32.2%)에 비해 큰 차이가 없었다. 이는 에틸렌이 생산되는 기작과 깊은 관계가 있다.
- 또한, 염분 내성능과 ACC deaminase 활성, 염분 내성능과 siderphore(s) 합성능 사이에도 양의 상관관계를 형성하였다(r=0.762, p<0.004, r=0.771, p<0.003, 각각).
- 본 연구에서 분리한 JS2RP2균주는 지금까지 보고된 균주들에 비해 월등히 많은 양의 IAA (84.76 ± 2.10 mg·L-1)를 생산하였고(Fig. 1) 동시에 염분에 강한 내성을 가지고 있었다(Table 1).
- 0% (7/116)였고[2], 벼과 식물에서 분리한 근권세균은 5% (5/84)였다[4]. 본 연구에서도 식물로부터 분리한 총 95개의 근권세균 중 25개로 26%의 근권세균이 ACC deaminase 활성을가지고 있는 것으로 나타났다(Table 2). 이러한 결과는 기존에 보고된 연구 보다 높은 비율이었다.
- 6%)에서 가장 높았다. 서식지별로 분리하여 PGPA 3가지를 모두 가지고 있는 근권세균은 근권토양(RS)은 6.9% 그리고 식물뿌리는 5.8% 로 나타났다.
- 1 mg·L-1로 다른 균주에 비해 많은 양의 IAA를 생산하였다. 소리쟁이에서 분리한 균주 중 IAA 생산능을 가진 균주는 18.2% (2/11)로 가장 높은 비율을 보였으며, 나리류 (9.5%), 사초과 (9.1%)의 순서로 높았다(Table 2). 이를 다시 근권토양(RS)과 뿌리(RP)로 나누어 비교하였을 경우에는 JS2RP가 28.
- 배양된 colony 중에서 모양 및 색등 형태적 특성에 따라 세균을 선별한 후 새로운 배지에 옮겼다. 속속이풀의 근권에서는 6개, 뿌리에서는 8개, 소리쟁이의 근권에서는 4개, 뿌리에서는 7개, 사초의 근권토양에서는 12개, 뿌리에서는 10개, 쑥의 근권토양에서는 8개, 뿌리에서는 6개, 나리류의 근권토양에서는 8개, 뿌리에서는 13개, 별꽃의 근권토양에서는 5개 그리고 뿌리에서는 8개로 총 95개 colony가 선별 되었다.
- 4%)(Table 2). 식물 별 근권토양에서 분리된 균주와 뿌리에서 분리된 균주로 비교하였을 경우에는 JS1RP, JS2RS, SH1RS가 각각 50%(각각 4/8, 2/4, 4/8)로 가장 높았으며, MH1RP가 10% (1/10)로 가장 낮았다. 전체적으로 비교하였을 때에는 siderphores 합성능을 가지고 있는 PGPR의 비율은 근권토양에서 39.
- 식물성장촉진능과 내염능을 가진 세균을 대상으로 상관관계를 분석한 결과, ACC deaminase 활성과 siderphore(s) 합성능 사이에는 양의 상관관계를 형성하였고(r=0.605, p<0.037), 염분 내성능과 ACC deaminase 활성, 염분 내성능과 siderphore(s) 합성능 사이에도 양의 상관관계를 형성하였다(r=0.762, p<0.004, r=0.771, p<0.003, 각각).
- 실험한 균주 중 JS1RS3, MH1RS8, 그리고 SH1RP8가 0.40 ± 0.00, 0.44 ± 0.00, 그리고 0.44 ± 0.0으로 ACC deaminase 활성이 가장 우수하였다(Fig. 2).
- 일반토양에서 분리한 근권세균에서는 대략 3.4 (4/116) ~13.3% (6/45)의 siderphores 합성능을 가지고 있는 반면에[3, 25], 본 연구에서 분리한 균주는 높은 분포율을 보였다. 이는 바닷물에는 일반적으로 철분이 적고 해안 사구에는 유효한 형태의 철이 적기 때문에[6] 일반토양에 비해 siderphores 합성능을 가지는 근권세균이 많을 것이라고 사료된다.
- 7% (1/13)로 가장 낮았다. 전체적으로 근권토양에서 분리된 균주 중 IAA를 생산할 수 있는 비율은 7.0% (3/43)였고, 뿌리에서 분리된 균주에서는 5.8% (3/52)로 서로 비슷하였다.
- 근권토양과 뿌리로 나누어 비교하였을 경우, JS2RS가 50% (2/4)로 매우 높은 비율을 나타내었고, SH1RP가 0% (0/8)로 가장 낮았다. 전체적으로 근권토양에서는 32.6% (14/43), 뿌리에서는 21.2% (11/52)로 ACC deaminase 활성을 가지는 PGPR의 비율은 뿌리에서보다 근권토양에서 더 높은 것으로 나타났다.
- 식물 별 근권토양에서 분리된 균주와 뿌리에서 분리된 균주로 비교하였을 경우에는 JS1RP, JS2RS, SH1RS가 각각 50%(각각 4/8, 2/4, 4/8)로 가장 높았으며, MH1RP가 10% (1/10)로 가장 낮았다. 전체적으로 비교하였을 때에는 siderphores 합성능을 가지고 있는 PGPR의 비율은 근권토양에서 39.5% (17/43), 뿌리에서 34.6% (18/52)로 RS가 조금 더 높았다.
- 분리한 colony들을 대상으로 염분 내성도를 평가한 결과를 Table 1에 나타내었다. 총 95개의 균주 중 4.0%의 염분이 함유된 배지에서 58개의 균주가 성장하였다. 그 중에서 OD값이 0.
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