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문제 정의
- 인삼에서 분리된 다당체가 강력한 면역자극활성이 있다는 이전 연구들을 고려해 보았을 때, 산삼 배양근 다당체 역시 면역자극활성이 있을 것으로 추론되었다. 따라서 본 연구에서는 산삼 배양근의 다당체를 분리하여, 성분분석 및 각종 면역자극 활성 특히 자연면역계를 구성하고 있는 보체계 및 macrophage에 대한 영향을 평가함으로써, 면역자극활성제로서의 산삼 배양근 다당체의 가능성을 살펴보았다.
- 최근 산삼근의 배양이 실험실에서 가능해짐에 따라 산삼에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다. 본 연구에서는 산삼 배양근으로부터 다당을 분리하여 보체계 및 macrophage에 대한 면역자극활성을 측정하였다. 산삼 배양근을 열수 추출한 뒤, 80% ethanol 침전을 통하여 조다당을 추출하여 특성을 검토한 결과, 산삼 배양근 조다당체(WGAR-CP)의 neutral sugar 함량은 64.
제안 방법
- 5 hr 반응시켜 가수분해 후, 1 ㎖의 1 M NH4OH (ammonia solution)에 용해하여 10 ㎎의 NaBH4로 4 hr 환원시켰다. Acetic acid를 적당량 가하여 잔존 NaBH4를 제거한 후 methanol을 가하며, 반복 건조함으로써 과량으로 가해진 acetic acid를 제거하여 각 구성당에 상당하는 alditol로 전환하였다. 중성당의 구성을 알기 위해 각각의 alditiol을 1 ㎖의 acetic anhydride를 가하여 121℃에서 30 min 동안 반응시켜 alditol acetate로 전환시켰으며, 이를 chloroform/H2O2상 용매계로 분리하여 추출하고, 추출물은 건조 후 소량의 acetone에 용해하여 GC 분석용 시료로 사용하였다.
- NO의 활성 정도는 ELISA 판독기(Infinite M200 Pro, TECAN, Männedorf, Switzerland)를 사용하여 540 ㎚에서 측정하였다.
- 한편, WGAR-CP는 인체 초기 면역반응에 있어 중요한 역할을 담당하는 보체계에 대하여 농도 의존적인 활성을 나타냈다. WGAR-CP를 0.1, 1, 10, 50, 100 ㎍/ ㎖ 농도로 mouse peritoneal macrophage에 처리하여 면역자극을 유도한 후, NO 생성 및 cytokine 분비활성을 평가하였다. 그 결과 WGAR-CP의 NO 생성은 저농도에서는 유의적인 활성을 보이지 않았으나, 50, 100 ㎍/㎖에서 농도별로 유의적인 차이를 보였다.
- 면역계 세포인 mouse peritoneal macrophage와 spleen cell에 대한 WGAR-CP의 독성을 확인하였다. WGAR-CP를 0.1～100㎍/㎖의 농도로 peritoneal macrophage와 spleen cell에 처리한 후 세포의 생존율을 측정하였다. Peritoneal macrophage cell에 서는 100 ㎍/㎖를 제외한 모든 농도에서 유의적인 세포사멸이 나타나지 않아 세포독성이 낮음을 확인할 수 있었고, spleen cell에서는 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다(Fig.
- Injection 온도 250℃, detector 온도 270℃, 컬럼 온도는 60℃에서 220℃까지 30℃/min, 220℃에서 250℃까지 8℃/ min의 조건하에서 실험하였다. 각 구성당의 mole%는 각 유도체의 peak 면적, 분자량 및 FID에 대한 molecular response factor를 각각 산출하여 계산하였다.
- 구성당 분석은 Albersheim 등의 방법(Thomas & Albersheim 1972)을 일부 변형하여 가수분해 후 각 구성당을 alditol acetate 와 aldonolactone로 유도체화 하였고, gas chromatography(GC ACME-6100, Young-Lin Co. Ltd. Anyang, Korea)를 이용하여 분석하였다.
- 분리한 용액에 2 M TFA를 가하여 100℃에서 5 min간 반응시켜 aldonolactone으로 전환시켰다. 그 후 chloroform/H2O2상 용매계로 분리하여 추출하고, 건조하여 GC 분석 시료로 사용하였다. GC column은 SP-2380 capillary column(0.
- 반응액을 ,500 rpm에서 약 10 min간 원심분리하여 얻어진 상등액을 412 ㎚에서 흡광도를 측정하여 잔존 용혈 활성을 측정하였다. 다당체의 항보체 활성은 대조군의 총 보체용혈(50% total complement hemolysis, TCH50, %)에 대한 저지율(inhibition of 50% total complement hemolysis, ITCH50, %)로서 나타내었다.
- 그 결과 WGAR-CP의 NO 생성은 저농도에서는 유의적인 활성을 보이지 않았으나, 50, 100 ㎍/㎖에서 농도별로 유의적인 차이를 보였다. 또한 50, 100 ㎍/㎖ 용량에서 IL-6 생성을 농도 유의적으로 증가시켰고, 10, 50 ㎍/㎖에서 농도 유의적으로 IL-12의 생성을 증가시켰다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, WGAR-CP는 자연면역계를 구성하고 있는 보체계와 macrophage의 활성인자로 작용할 수 있음이 확인되었고, WGAR-CP에의해 활성화된 macrophage는 NO 및 IL-6, IL-12와 같은 염증성 cytokine의 분비를 유도함으로써 체내 면역기능을 증강시킬 수 있는 가능성이 있을 것으로 사료되었다
- 면역계 세포인 mouse peritoneal macrophage와 spleen cell에 대한 WGAR-CP의 독성을 확인하였다. WGAR-CP를 0.
- 5 ㎖를 넣어 반응을 정지시켰다. 반응액을 ,500 rpm에서 약 10 min간 원심분리하여 얻어진 상등액을 412 ㎚에서 흡광도를 측정하여 잔존 용혈 활성을 측정하였다. 다당체의 항보체 활성은 대조군의 총 보체용혈(50% total complement hemolysis, TCH50, %)에 대한 저지율(inhibition of 50% total complement hemolysis, ITCH50, %)로서 나타내었다.
- 배지로 희석시킨 고분자 분획물을 농도 별로 세포에 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24 hr 배양한 후, 상등액으로 분비된 IL-6, IL-12의 양을 ELISA kit(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)을 이용하여 측정하였다. 즉, anti-cytokine capture antibody를 coating buffer(0.
- 산성당 함량은 carbazole-sulfuric acid법(Bitter 등 1962)으로 측정하였다. 시료분말을 1%(w/v)농도로 증류수에 용해한 시료용액을 0.45 ㎛ 막필터로 여과한 후 여액을 각각 0.5 ㎖씩 취하고, 0.125% carbazole 0.25 ㎖ 를 가하여 잘 혼합시켰다. 여기에 진한 황산 3 ㎖를 가하고, 85℃ water bath에서 15 min간 발색시킨 후 525 ㎚에서 흡광도를 측정하여 검량선으로 부터 구해진 β-D-galacturonic acid를 표준물질로 하여 함량을 계산하였다.
- 여기에 진한 황산 3 ㎖를 가하고, 85℃ water bath에서 15 min간 발색시킨 후 525 ㎚에서 흡광도를 측정하여 검량선으로 부터 구해진 β-D-galacturonic acid를 표준물질로 하여 함량을 계산하였다.
- 45 ㎛ 막필터로 여과하여 여액을 각각 1 ㎖씩 취하여 5% phenol 1 ㎖에 잘 혼합시켰다. 여기에 황산 5 ㎖를 첨가한 후 30분 반응시키고, 490 ㎚에서 흡광도를 측정하여 검량선으로부터 구해진 glucose의 함량으로 총 당 함량을 계산하였다. 산성당 함량은 carbazole-sulfuric acid법(Bitter 등 1962)으로 측정하였다.
- 이 후 0.2% 식염수를 이용하여 적혈구를 제거하고, RPMI 1640(with 10% FBS)로 2～3회 세척하여 세포수를 2.5×106 cells/㎖가 되도록 조정하였다.
- Acetic acid를 적당량 가하여 잔존 NaBH4를 제거한 후 methanol을 가하며, 반복 건조함으로써 과량으로 가해진 acetic acid를 제거하여 각 구성당에 상당하는 alditol로 전환하였다. 중성당의 구성을 알기 위해 각각의 alditiol을 1 ㎖의 acetic anhydride를 가하여 121℃에서 30 min 동안 반응시켜 alditol acetate로 전환시켰으며, 이를 chloroform/H2O2상 용매계로 분리하여 추출하고, 추출물은 건조 후 소량의 acetone에 용해하여 GC 분석용 시료로 사용하였다. 또 산성당의 구성을 분석하기 위하여 전환된 alditol을 증류수에 녹인 뒤, Sep-pak QMA Cartridge(Waters, Milford, MA, USA)에 전개하고, 1 M HCl로 aldonic acid를 분리하였다.
- 즉, 여러 농도(250, 500, 1,000 ㎍/ ㎖)로 증류수에 녹인 시료에 정상인의 혈청과 GVB++(gelatin veronal buffered saline, pH 7.4, 2% gelatin, 500μM Ca2+, 2 mM Mg2+ 함유) 완충액을 각각 50 ㎕ 씩 혼합하여 37℃에서 30min간 1차 반응시키고, GVB++를 350 ㎕를 가한 후 이를 10～ 160배로 연속 희석하였다.
- 분리한 상등액은 최종농도가 80%가 되도록 ethanol을 첨가하여 하룻밤 방치한 후, 발생한 침전물을 회수하였다. 침전물을 소량의 증류수에 용해하여 Spectra/ Por 투석막(MWCO; 6,000～8,000, Spectrrum Medical Industries Inc., Laguna Hills, CA, USA)을 이용하여 2～3일간 투석을 행하고 동결건조를 행하여 조다당 시료(WGAR-CP)를 얻었다.
- 활성화된 macrophage가 분비하는 것으로 알려진 nitric oxide (NO)의 생성량을 측정하였다. NO의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite양을 측정하였다.
대상 데이터
- C57BL/6 mouse(웅성, 5주령, 한림)의 복강에 5% thioglycollate 배지(Sigma, St Louis, MO, USA)를 1 ㎖ 주입하고, 72～96 hr내에 유도된 macrophage를 PBS를 이용하여 회수하였다. 그 후 RPMI 1640 medium(GibcoTM, Grand Island, NY, USA)으로 2～3 회 세척하고, 세포수를 2.
- 배지는 RPMI 1640에 10%(v/v) fetal bovine serum (FBS, GibcoTM)과 1%(v/v) penicillin-streptomycin을 가한 배지를 사용하였다. C57BL/6 mouse에서 비장을 적출하여 마쇄 및 여과를 거쳐 비장세포를 획득하였다. 이 후 0.
- 5×106 cells/㎖로 조정하여 96-well plate 에 배양하였다. 배지는 RPMI 1640에 10%(v/v) fetal bovine serum (FBS, GibcoTM)과 1%(v/v) penicillin-streptomycin을 가한 배지를 사용하였다. C57BL/6 mouse에서 비장을 적출하여 마쇄 및 여과를 거쳐 비장세포를 획득하였다.
- 본 연구에서 사용된 산삼 배양근은 ㈜바이오벨류(Jeju, Korea) 에서 제공받은 것을 사용하였다. 산삼 배양근을 1 ㎝ 이하로 절단하여 환류추출기에 10배의 D.
데이터처리
- Different corresponding letters indicate significant differences at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- 실험에서 얻은 모든 data는 SAS(Statistical Analysis System 1996) 8.0 프로그램을 이용하여 ANOVA 분산분석과 Duncan의 다중범위 검정법으로 시행하였다.
이론/모형
- 활성화된 macrophage가 분비하는 것으로 알려진 nitric oxide (NO)의 생성량을 측정하였다. NO의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite양을 측정하였다. 100 ㎕의 세포배양 상층액을 취하여 동량의 Griess reagent(Sigma)을 가하여 상온에서 15 min 반응시켰다.
- 다양한 농도로 희석된 시료를 100 ㎕씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 72 hr 배양하였다. 각 세포에 대한 독성은 MTT assay 방법에 따라 측정하였다. 96 well-plate의 상등액을 조심스럽게 제거한 후, MTT 0.
- 여기에 진한 황산 3 ㎖를 가하고, 85℃ water bath에서 15 min간 발색시킨 후 525 ㎚에서 흡광도를 측정하여 검량선으로 부터 구해진 β-D-galacturonic acid를 표준물질로 하여 함량을 계산하였다. 단백질 함량 측정은 Lowry method(Lowry 등 1951)으로 측정하였으며, 표준물질로는 BSA를 사용하였다.
- 여기에 황산 5 ㎖를 첨가한 후 30분 반응시키고, 490 ㎚에서 흡광도를 측정하여 검량선으로부터 구해진 glucose의 함량으로 총 당 함량을 계산하였다. 산성당 함량은 carbazole-sulfuric acid법(Bitter 등 1962)으로 측정하였다. 시료분말을 1%(w/v)농도로 증류수에 용해한 시료용액을 0.
- 총 당 함량은 phenol-sulfuric acid법(Dubois 등 1956)으로 측정하였다. 즉, 시험관에 시료의 조다당체 분말을 1%(w/v) 로 증류수에 녹인 시료용액을 0.
- 항보체활성은 Mayer 방법(Kabat & Mayer 1965)을 이용하여 시료에 의한 보체소비(complement consumption) 후 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈 정도에 근거를 둔 complement fixation test로 측정하였다.
성능/효과
- 1～100㎍/㎖의 농도로 peritoneal macrophage와 spleen cell에 처리한 후 세포의 생존율을 측정하였다. Peritoneal macrophage cell에 서는 100 ㎍/㎖를 제외한 모든 농도에서 유의적인 세포사멸이 나타나지 않아 세포독성이 낮음을 확인할 수 있었고, spleen cell에서는 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다(Fig. 2). 특히 spleen cell의 경우, 1 ㎍/㎖의 농도에서 유의적인 세포 증식을 확인할 수 있었다.
- 32%이었다. WGAR-CP 의 구성당 조성을 확인한 결과, glucose를 높은 비율로 함유하고 있었으며, rhamnose, arabinose, galactose, glucose를 미량 함유하고 있었다. Uronic acid에서는 galacturonic acid를 높은 비율로 함유하고 있었다.
- 활성화된 macrophage에서 생산되는 NO는 비특이적 숙주 방어 기작인 대식작용(Phagocytosis)을 증대시키고, 세균 및 암세포의 증식 억제 활성을 보여 생체방어기전의 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Sorimachi 등 2001). WGAR-CP 자극에 의한 NO 생성은 저농도에서는 유의적인 활성을 보이지 않았으나, 50, 100 ㎍/㎖에서 농도별로 유의적인 차이를 보였다(Fig. 3). Hong 등(2008)은 산삼 배양근 열수 추출물이 내피 세포에서 농도 의존적으로 NO의 생산을 증가시킨다고 보고였고, Kim 등(2002)은 홍삼 다당체에 의해 자극된 peritoneal macrophage가 NO 생성을 증가시키고, 증가된 NO에 의해 암세포 사멸도가 유의성 있게 증가함을 밝힌 바 있다.
- 1, 1, 10, 50, 100 ㎍/ ㎖ 농도로 mouse peritoneal macrophage에 처리하여 면역자극을 유도한 후, NO 생성 및 cytokine 분비활성을 평가하였다. 그 결과 WGAR-CP의 NO 생성은 저농도에서는 유의적인 활성을 보이지 않았으나, 50, 100 ㎍/㎖에서 농도별로 유의적인 차이를 보였다. 또한 50, 100 ㎍/㎖ 용량에서 IL-6 생성을 농도 유의적으로 증가시켰고, 10, 50 ㎍/㎖에서 농도 유의적으로 IL-12의 생성을 증가시켰다.
- 보체계(complement system)는 C1～C9의 활성단백질과 조절인자를 포함하여 약 20여 종의 혈중 순환 단백질들로 구성되어 있으며, 외부 감염 병원체 등 침입인자를 항체의 존재 또는 비존재 하에 비특이적으로 제거하는 생체의 주요 방어 기구이다(Kwon & Sung 1997). 산삼 배양근 유래 다당에 의한 보체계 활성화능을 측정한 결과, WGAR-CP는 1,000 ㎍/㎖에서 ITCH 50 값이 약 44%에 이르는 보체계 활성화능을 보였으며, 농도 의존적으로 활성이 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 1). 이는 보체계의 강력한 활성인자로 알려져 있는 면역활성 다당체인 구름버섯(Coriolus versicolor, 운지) 유래 PSK(Satio 등 1988)보다는 상대적으로 낮은 활성이나 WGAR-CP가 보체계의 활성인자임을 확인할 수 있었다.
- Macrophage가 분비하는 대표적인 면역 유도 사이토카인에는 IL-6, IL-12, TNF-α 등이 있다(Wang 등 2003). 산삼 배양근 유래 활성 다당 WGAR-CP의 자극에 의한 peritoneal macrophage의 cytokine 생산을 ELISA 방법으로 측정한 결과, IL-6, IL-12의 분비를 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 확인되었다(Fig. 4). IL-6는 50, 100 ㎍/㎖의 WGAR-CP 농도에서 각각 0.
- 본 연구에서는 산삼 배양근으로부터 다당을 분리하여 보체계 및 macrophage에 대한 면역자극활성을 측정하였다. 산삼 배양근을 열수 추출한 뒤, 80% ethanol 침전을 통하여 조다당을 추출하여 특성을 검토한 결과, 산삼 배양근 조다당체(WGAR-CP)의 neutral sugar 함량은 64.77%였고, uronic acid 함량은 34.32%이었다. WGAR-CP 의 구성당 조성을 확인한 결과, glucose를 높은 비율로 함유하고 있었으며, rhamnose, arabinose, galactose, glucose를 미량 함유하고 있었다.
- 1). 이는 보체계의 강력한 활성인자로 알려져 있는 면역활성 다당체인 구름버섯(Coriolus versicolor, 운지) 유래 PSK(Satio 등 1988)보다는 상대적으로 낮은 활성이나 WGAR-CP가 보체계의 활성인자임을 확인할 수 있었다. 식물유래 다당체에선 천년초 (Seo & Shin 2012), 감잎(Jung 등 2002), 고사리(Oh 등 1994) 등의 다당체가 항보체 활성을 가지고 있다고 보고되었다.
- 또한 50, 100 ㎍/㎖ 용량에서 IL-6 생성을 농도 유의적으로 증가시켰고, 10, 50 ㎍/㎖에서 농도 유의적으로 IL-12의 생성을 증가시켰다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, WGAR-CP는 자연면역계를 구성하고 있는 보체계와 macrophage의 활성인자로 작용할 수 있음이 확인되었고, WGAR-CP에의해 활성화된 macrophage는 NO 및 IL-6, IL-12와 같은 염증성 cytokine의 분비를 유도함으로써 체내 면역기능을 증강시킬 수 있는 가능성이 있을 것으로 사료되었다
- 91%로 미량 존재하였다. 한편, WGAR-CP를 가수분해하여 alditol acetate 유도체로 전환하고 구성당을 분석한 결과, glucose가 85.5% 로 가장 높았으며, 그 외 rhamnose 2.9%, arabinose 5.4%, galactose 5.9%를 함유하고 있었다. 또 uronic acid는 galacturonic acid가 71.
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