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문제 정의
- 또한 전 세계적으로 각 race별 저항성 유전자를 도입한 저항성 품종이 개발되고 있고(Gabe, 1975; Jones 등, 1991), 국내에서도 마커 연관 선발 프로그램을 이용하여 다양한 병 저항성 유전자를 가진 우수한 품종을 만들려는 노력이 이어지고 있지만 시들음병 race 3에 대하여 I-3 유전자를 가지고 있는 일부 육성계통이 있음을 확인할 뿐이고 국내에 상용화된 품종이 없다(Kim 등, 2011). 이에 본 연구는 농촌진흥청 농업유전자원센터 보존하고 있는 토마토 유전자원 1,906점에 대하여 토마토 시들음병 race 3에 대한 저항성 유전자 I-3의 보유여부를 분자마커로 탐색하고, 선발된 저항성 자원 들을 토마토 육종가 및 병 연구자에게 제공하고자 수행 하였다.
제안 방법
- 육묘한 묘는 4월 하순에 비가림하우스에 정식하였고 농촌진흥청 표준재배법에 따라 재배하였다. 7월 초에 어린잎을 채취하여 DNA를 추출하였고, 이후 과실 특성을 조사하였다.
- PCR은 95℃에서 5분간 denaturation 과정을 거쳐 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초의 총 40 cycle로 수행하였다. HRM 분석은 PCR 과정이 끝난 후 Lightscanner(Idaho Technology, USA)의 프로그램화 된 온도 68℃에서 90℃까지 초 당 0.1℃ 간격으로 형광량을 측정하였다. Melting curve를 분석하기 위해 Lightscanner(Idaho Technology, USA)의 software version 2.
- 2 unit를 이용하였다. PCR은 95℃에서 5분간 denaturation 과정을 거쳐 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초의 총 40 cycle로 수행하였다. HRM 분석은 PCR 과정이 끝난 후 Lightscanner(Idaho Technology, USA)의 프로그램화 된 온도 68℃에서 90℃까지 초 당 0.
- pimpinellifolium을 비롯한 기타 야생근연종 252점 등 총 1,906점을 분양받아 시험 재료로 이용하였다(Table 1). 각각의 종자는 50공 플러그트레이에 원예용상토를 채우고 파종하여 비닐하우스에서 7주간 육묘하였다. 육묘한 묘는 4월 하순에 비가림하우스에 정식하였고 농촌진흥청 표준재배법에 따라 재배하였다.
- 본 연구도 2010−2012년 3년간의 증식 및 평가자원을 대상으로, 아직 국내에선 발병이 확인되지 않았지만 호주, 미국, 멕시코, 브라질, 일본 등지에서 확산되고 있는 토마토 시들음병 race 3에 대한 유전 분석을 실시하였다.
- Genomic DNA 추출. 어린 잎 조직을 채취하여 96 well type의 1.2 ml collection microtube에 tungsten carbide bead 2개를 함께 넣고 Tissue-Lyser(Qiagen, Alabama, USA)를 이용하여 마쇄하였다. 마쇄한 조직으로부터 hexa decyltrimethyl ammonium bromide(CTAB) 방법을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다(Kang 등, 2010).
- 9 g으로, 야생근연종에 기원을 둔 방울토마토와 일반형 토마토를 한꺼번에 살펴본 결과 큰 편차를 나타냈다(자료 미제시). 이들 중 당도가 6 oBrix 이상이거나 과중이 100 g 이상인 자원은 시들음병 저항성이면서 과실 특성이 우수한 자원으로 육종소재로 이용 가치가 있으므로 그 특성을 정리하였다(Table 4). 일본, 중국 등의 시판 품종이 8자원 포함되어 있으며, 육성계통 10점, 멕시코, 불가리아의 재래종 3점으로 어느 정도 농업적 형질이 고정된 자원들이다.
대상 데이터
- PCR을 수행하기 위해 반응액의 총 부피 20 µl에서 100 ng의 gDNA와 1.5 mM MgCl2, 60 mM KCl, 10 mM Tris-Cl, 2.5 mM의 dNTPs, 1.25 µM SYTO 9(Invitrogen, USA), 5 pmol forward와 reverse primer, Taq polymerase(Bioneer, Korea) 0.2 unit를 이용하였다.
- lycopersicum var. cerasiforme 13자원으로 총 78자원이었다. 원산지 미상인 자원 11점을 제외하면 중국 원산의 육성계통 및 육성품종이 28점으로 가장 많았고, 불가리아 재래종 자원이 6점으로 그 뒤를 따랐다.
- lycopersicum var. cerasiforme 335점, S. pimpinellifolium을 비롯한 기타 야생근연종 252점 등 총 1,906점을 분양받아 시험 재료로 이용하였다(Table 1). 각각의 종자는 50공 플러그트레이에 원예용상토를 채우고 파종하여 비닐하우스에서 7주간 육묘하였다.
이론/모형
- High Resolution Melting 분석. Park 등(2009)의 방법을 참고하여 HRM 분석을 진행하였다. Wang 등(2007)이 개발한 pGot-2 SNP 마커를 이용하여 primer 염기서열은 forward primer: 5'-AGTGGCAGTGAAAAGTCAGTTG-3', reverse primer: 5'-CCAAGTAACCAACATTTCCAGTAG3'로 제작하였다.
- 2 ml collection microtube에 tungsten carbide bead 2개를 함께 넣고 Tissue-Lyser(Qiagen, Alabama, USA)를 이용하여 마쇄하였다. 마쇄한 조직으로부터 hexa decyltrimethyl ammonium bromide(CTAB) 방법을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다(Kang 등, 2010). 추출한 DNA는 NanoDrop® ND-1000(Nanodrop-Technologies, USA)을 이용하여 260 nm에서 정량하고 최종 농도가 20 ng/µl가 되도록 희석하였다.
- 각각의 종자는 50공 플러그트레이에 원예용상토를 채우고 파종하여 비닐하우스에서 7주간 육묘하였다. 육묘한 묘는 4월 하순에 비가림하우스에 정식하였고 농촌진흥청 표준재배법에 따라 재배하였다. 7월 초에 어린잎을 채취하여 DNA를 추출하였고, 이후 과실 특성을 조사하였다.
- lycopersici는 전 세계적으로 그 피해가 막대한 토마토 시들음병의 원인균으로 알려져 있다. 토마토 유전자원 1,906 자원을 대상으로 토마토 시들음병 race 3 저항성유전자 I-3의 유전형을 high resolution melting 법을 사용 하여 분석하였다. 총 97점의 자원에서 homozygous resistant 피크가 확인되었으며, 8점은 이형접합성, 1,801점은 감수성으로 나타났다.
성능/효과
- cerasiforme는 총 335점 중 13점이 저항성으로, 322점이 이병성으로 나타났다. S. pimpinellifolium를 비롯한 12종의 야생근연종 252자원 중에서 저항성 자원은 S. pimpinellifolium 8점, S. habrochaites 3점, S. corneliomulleri 3점, S. galapagense 1점, S. peruvianum 3점, S. chilense 1점으로 총 19점이었다.
- sp. lycopersici race 3에 대한 저항성 유전자 I-3의 보유 여부를 확인코자 high resolution melting 분석법을 이용하여 유전형 분석을 실시한 결과 97점이 저항성, 8점이 이형 접합성, 1,801점이 감수성으로 나타났다(Table 2). 이를 종별로 세분하면, 일반형 토마토인 S.
- 조사된 과실의 특성을 살펴보면, 당도는 3.6−7.3 oBrix로 그리 높지 않았으며, 과중은 2.2−344.9 g으로, 야생근연종에 기원을 둔 방울토마토와 일반형 토마토를 한꺼번에 살펴본 결과 큰 편차를 나타냈다(자료 미제시).
- 본 연구도 2010−2012년 3년간의 증식 및 평가자원을 대상으로, 아직 국내에선 발병이 확인되지 않았지만 호주, 미국, 멕시코, 브라질, 일본 등지에서 확산되고 있는 토마토 시들음병 race 3에 대한 유전 분석을 실시하였다. 총 1,906자원을 대상으로 HRM 을 통하여 I-3 유전자의 보유여부를 확인한 결과, 총 97점의 자원에서 homozygous resistant 피크가 확인되었으며 이들의 종 분포는 일반형 토마토인 S. lycopersicum var. lycopersicum가 65점, 방울토마토인 S.
- 토마토 유전자원 1,906 자원을 대상으로 토마토 시들음병 race 3 저항성유전자 I-3의 유전형을 high resolution melting 법을 사용 하여 분석하였다. 총 97점의 자원에서 homozygous resistant 피크가 확인되었으며, 8점은 이형접합성, 1,801점은 감수성으로 나타났다. 저항성 자원 97점의 종 분포는 S.
후속연구
- 특히 IT173873은 미국 식물유전자원센터(National Plant Germplasm System)에서 PI79532로 부터 시들음병 저항성 유전자 I를 선발하기위해 10세대 이상 자가교배를 통하여 인위적으로 만든 자원으로 원산지는 미국으로 되어 있지만 PI79532로 부터 나온 자원이므로 그 기원은 페루 자원과 동일하다고 할 수 있다. 또한 이들 야생종 자원들은 세균성 반점병, 토마토황화잎말림바이러스, 토마토모자이크바이러스에 대해서도 하나 또는 세 가지 종류의 병 모두에 저항성 유전자를 가지고 있는 자원들이라 추후 재검정 및 생물검정을 통하여 병 저항성 자원으로 활용가치가 높다(자료 미제시).
- 따라서 농업유전자원센터가 보유중인 토마토 유전자원을 대상으로 주요 병에 대한 저항성 유전자의 보유 여부를 밝히는 것은 토마토 육종 프로그램에 안정적이면서 지속적인 유전적 다양성을 확보하는 중요한 소재를 제공하게 되는 것이다. 또한 이러한 유전적 인자를 재배품종에 이입함으로써 이미 밝혀진 병 외에 또 다른 race의 출현에 대비할 수 있는 가능성을 기대할 수 있다.
- 엘리트 라인에 원하는 형질을 도입하려면 4−6세대의 여교배를 수행해야 하고 형질이 안정적으로 발현되려면 또는 유전형질이 호모가 되기 위해서 최소한 3세대를 거쳐야 하는데(Kim 등, 2011), MAS는 희망하는 유전자좌에 유전적 고정을 이루는데 효과적으로 세대를 줄일 수 있는(Peleman과 Van Der Voort, 2003) 효과적인 방법이다. 하지만 보다 정확한 자원 선발을 위해서는 생물검정이 추가적으로 보완되어야 할 것이다.
- chilense 1점으로 총 19점이었다. 하지만 좀 더 정확한 시들음병 저항성 평가를 위하여 추후에 race 1과 2에 대한 유전분석과 생물검정이 필요하다.
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