Multiplex PCR 분석을 통한 건강한 20대 여성의 질 내에 서식하는 Lactobacillus 속 유산균의 신속한 검출 Rapid Detection of Lactobacillus Genus Inhabiting in Vagina of 20's Healthy Women Using Multiplex PCR원문보기
본 연구는 multiplex PCR 방법을 적용하여 질 내부에 서식하는 유산균을 동시에 그리고 신속하게 검출하는 방법을 개발하는 것을 목적으로 수행되었다. 세균의 감염에 의한 질염 증상이 없는 건강한 20대 여성 166명으로부터 질 분비물을 채취하였다. 건강한 여성의 질 내부에 서식하는 것으로 확인된 Lactobacillus 속에 속하는 6종의 유산균을 종 특이 multiplex PCR primer를 제작하기 위해 선정하였다. Multiplex primer I은 L. iners, L. crispatus, L. gasseri를 선택적으로 검출하기 위해 특성화하였고 multiplex primer II는 L. acidophilus, L. jensenii, L. fermentum를 선택적으로 검출하기 위해 특성화하였다. Multiplex PCR 기술을 이용하여 분석한 결과 L. crispatus (77%)가 가장 높은 빈도로 검출되었고 L. acidophilus (57%)과 L. jensenii (57%)는 상대적으로 높은 빈도로 검출되었다. L. iners (59%)는 L. acidophilus (57%)와 L. jensenii (57%) 보다 높은 빈도로 검출되었지만 항생제 치료 과정 후 또는 세균성 질염의 경우에도 발견되는 균종으로 건강한 여성에게서 주로 서식하는 종이라고 결론 내리기는 어렵다. 결론적으로, 특정 유산균의 특이적인 primer를 이용한 multiplex PCR 기술은 질의 건강상태의 변화 또는 질의 질병으로부터 회복 과정을 예측할 수 있는 도구로서 유용할 것으로 생각된다.
본 연구는 multiplex PCR 방법을 적용하여 질 내부에 서식하는 유산균을 동시에 그리고 신속하게 검출하는 방법을 개발하는 것을 목적으로 수행되었다. 세균의 감염에 의한 질염 증상이 없는 건강한 20대 여성 166명으로부터 질 분비물을 채취하였다. 건강한 여성의 질 내부에 서식하는 것으로 확인된 Lactobacillus 속에 속하는 6종의 유산균을 종 특이 multiplex PCR primer를 제작하기 위해 선정하였다. Multiplex primer I은 L. iners, L. crispatus, L. gasseri를 선택적으로 검출하기 위해 특성화하였고 multiplex primer II는 L. acidophilus, L. jensenii, L. fermentum를 선택적으로 검출하기 위해 특성화하였다. Multiplex PCR 기술을 이용하여 분석한 결과 L. crispatus (77%)가 가장 높은 빈도로 검출되었고 L. acidophilus (57%)과 L. jensenii (57%)는 상대적으로 높은 빈도로 검출되었다. L. iners (59%)는 L. acidophilus (57%)와 L. jensenii (57%) 보다 높은 빈도로 검출되었지만 항생제 치료 과정 후 또는 세균성 질염의 경우에도 발견되는 균종으로 건강한 여성에게서 주로 서식하는 종이라고 결론 내리기는 어렵다. 결론적으로, 특정 유산균의 특이적인 primer를 이용한 multiplex PCR 기술은 질의 건강상태의 변화 또는 질의 질병으로부터 회복 과정을 예측할 수 있는 도구로서 유용할 것으로 생각된다.
The purpose of this study is to simultaneously detect and identify specific genus of Lactobacillus distributed in vagina of healthy women in their twenties by using multiplex primer. Vaginal fluid samples were taken from 166 women who were healthy and did not have vaginosis symptoms caused by bacter...
The purpose of this study is to simultaneously detect and identify specific genus of Lactobacillus distributed in vagina of healthy women in their twenties by using multiplex primer. Vaginal fluid samples were taken from 166 women who were healthy and did not have vaginosis symptoms caused by bacterial infection. Six species of lactic acid bacteria belong to Lactobacillus genus that are known to inhabit in healthy vagina were selected to make a species-specific multiplex primer. Multiplex primer I was specified to selectively detect L. iners, L. crispatus, L. gasseri and multiplex primer II was specified to selectively detect L. acidophilus, L. jensenii, L. fermentum. L. crispatus (77%) was most frequently detected, and L. acidophilus (57%) and L. jensenii (57%) were relatively higher than others. Although the proportion of L. iners (59%) was a little higher than those of L. acidophilus and L. jensenii, this should be further validated in healthy women's vagina to be sure since they often appear in women having bacterial vaginosis and/or during the antibiotic therapy. Conclusively, the multiplex PCR technique using the species-specific primer could a useful tool to predict variation of vaginal health condition and process of recovery from vaginal disease.
The purpose of this study is to simultaneously detect and identify specific genus of Lactobacillus distributed in vagina of healthy women in their twenties by using multiplex primer. Vaginal fluid samples were taken from 166 women who were healthy and did not have vaginosis symptoms caused by bacterial infection. Six species of lactic acid bacteria belong to Lactobacillus genus that are known to inhabit in healthy vagina were selected to make a species-specific multiplex primer. Multiplex primer I was specified to selectively detect L. iners, L. crispatus, L. gasseri and multiplex primer II was specified to selectively detect L. acidophilus, L. jensenii, L. fermentum. L. crispatus (77%) was most frequently detected, and L. acidophilus (57%) and L. jensenii (57%) were relatively higher than others. Although the proportion of L. iners (59%) was a little higher than those of L. acidophilus and L. jensenii, this should be further validated in healthy women's vagina to be sure since they often appear in women having bacterial vaginosis and/or during the antibiotic therapy. Conclusively, the multiplex PCR technique using the species-specific primer could a useful tool to predict variation of vaginal health condition and process of recovery from vaginal disease.
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문제 정의
본 연구는 multiplex PCR 방법을 적용하여 질 내부에 서식하는 유산균을 동시에 그리고 신속하게 검출하는 방법을 개발하는 것을 목적으로 수행되었다. 세균의 감염에 의한 질염 증상이 없는 건강한 20대 여성 166명으로부터 질 분비물을 채취하였다.
본 연구는 간편하고 새로운 multiplex PCR 방법을 적용하여 건강한 20대 여성들의 질 내부에 서식하는 유산균의 다양성과 분포를 분석하는 것이 목적이다. 이를 위하여 2004년 한국여성을 대상으로 진행된 임상실험 결과 한국여성의 질에서 주로 발견되었던 유산균 중 Lactobacillus crispatus, Lactobacillus acidophilus가 우점균임을 참고하여(Park et al.
제안 방법
건강한 여성의 질 내부에 서식하는 것으로 확인된 Lactobacillus 속에 속하는 6종의 유산균을 종 특이 multiplex PCR primer를 제작하기 위해 선정하였다. Multiplex primer I은 L. iners, L. crispatus, L. gasseri를 선택적으로 검출하기 위해 특성화하였고 multiplex primer II는 L. acidophilus, L. jensenii, L. fermentum를 선택적으로 검출하기 위해 특성화하였다. Multiplex PCR 기술을 이용하여 분석한 결과 L.
PCR 증폭산물은 0.05 μg/ml의 EtBr을 포함한 2.5% agarose gel (FMC Bioproduct, USA)을 1X TAE buffer (0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA)에서 100 mA, 200 V로 25분간 전기 영동하여 확인하였다.
Template DNA 3 μl, free water 9.7 μl, deoxynucleoside triphosphate (dNTP) (Genenmed, Korea) 1 μl (0.2 mM 각각 dATP, dCTP, dGTP과 0.6 mM dUTP), multiplex primer 1 μl, uracil-DNA glycosylase (UDG) 0.2 U (Solgent, Korea), dye (60% sucrose, cresol red) 4 μl, PCR buffer (Genenmed) 2 μl, taq 중합효소(Genenmed) 1.5 U의 조성으로 수행되었다.
본 연구는 간편하고 새로운 multiplex PCR 방법을 적용하여 건강한 20대 여성들의 질 내부에 서식하는 유산균의 다양성과 분포를 분석하는 것이 목적이다. 이를 위하여 2004년 한국여성을 대상으로 진행된 임상실험 결과 한국여성의 질에서 주로 발견되었던 유산균 중 Lactobacillus crispatus, Lactobacillus acidophilus가 우점균임을 참고하여(Park et al., 2004) Lactobacillus 속에 속하는 6종의 유산균 종을 선정하고(Dickson et al., 2005; Sul et al., 2007; Zozaya et al., 2010), 이를 다시 Lactobacillus iners, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri 그룹과 Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus fermentum 그룹으로 구분하여 각 균종의 특이적인 염기서열을 기준으로 multiplex PCR system을 이용한 검출도구를 제작하였다. 본 연구에서 활용한 multiplex PCR system은 여러 종의 유산균을 동시에 검출할 수 있는 기술로서 기존의 단일 PCR 방법이나 PCR RFLP 방법과 비교하여 빠르고 효율적인 방법이며(Sung et al.
Sample transfer container에는 세포를 파괴하고 핵산을 고정하는 cell lysis buffer를 포함하며 주요성분은 guanidine hydrochloride이다. 핵산의 추출은 진올사(Korea)에서 제조한 핵산 추출 시약을 사용하였으며 추출 방법은 제조사의 방법을 따랐고 추출된 핵산을 PCR template로 사용하였다.
대상 데이터
166명의 건강한 20대 여성으로부터 채취한 시료를 Lactobacillus multiplex PCR을 이용하여 분석한 결과 Fig. 1과 같은 결과를 얻을 수 있었다.
fermentum 등을 분석 대상 균종으로 선택하였다. Primer의 design에 사용된 16S rRNA 유전자의 서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)으로부터 얻었으며(Table 1), 본 실험에서 사용된 primer 의 sequence는 Table 2에 나타내었다.
세균의 감염에 의한 질염 증상이 없는 건강한 20대 여성 166명으로부터 질 분비물을 채취하였다. 건강한 여성의 질 내부에 서식하는 것으로 확인된 Lactobacillus 속에 속하는 6종의 유산균을 종 특이 multiplex PCR primer를 제작하기 위해 선정하였다. Multiplex primer I은 L.
반응에 사용된 모든 물은 RNase-DNase free water (Sigma, USA)를 사용하였다. PCR 증폭은 Thermal Cycler XP (Bioer, China)를 이용하여 증폭하였으며 조건은 아래와 같다.
여러 종류의 primer들이 동시에 반응하는 multiplex PCR 반응의 특성상 각 primer들 사이에 교차 혹은 저해 반응이 없어야 한다. 본 연구의 대상 균종은 질 내 서식 유산균들 가운데 검출 빈도가 높은 종으로 알려진 L. crispatus, L. acidophilus, L. iners, L. gasseri, L. jensenii, L. fermentum 등을 분석 대상 균종으로 선택하였다. Primer의 design에 사용된 16S rRNA 유전자의 서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)으로부터 얻었으며(Table 1), 본 실험에서 사용된 primer 의 sequence는 Table 2에 나타내었다.
본 연구의 분석 대상 시료는 2011년 9월부터 12월까지 서경대학교에 재학중인 여학생들 중 통증, 화끈거림, 가려움증이나 질 분비물 등과 같은 질염 자각 증상이 없는 건강한 20대 여성들을 대상으로 하였다. Vaginal swab은 전용 brush와 sample transfer container를 사용하여 채취되고 운송되었다.
본 연구는 multiplex PCR 방법을 적용하여 질 내부에 서식하는 유산균을 동시에 그리고 신속하게 검출하는 방법을 개발하는 것을 목적으로 수행되었다. 세균의 감염에 의한 질염 증상이 없는 건강한 20대 여성 166명으로부터 질 분비물을 채취하였다. 건강한 여성의 질 내부에 서식하는 것으로 확인된 Lactobacillus 속에 속하는 6종의 유산균을 종 특이 multiplex PCR primer를 제작하기 위해 선정하였다.
성능/효과
fermentum를 선택적으로 검출하기 위해 특성화하였다. Multiplex PCR 기술을 이용하여 분석한 결과 L. crispatus (77%)가 가장 높은 빈도로 검출되었고 L. acidophilus (57%)과 L. jensenii (57%)는 상대적으로 높은 빈도로 검출되었다. L.
jensenii (57%) 보다 높은 빈도로 검출되었지만 항생제 치료 과정 후 또는 세균성 질염의 경우에도 발견되는 균종으로 건강한 여성에게서 주로 서식하는 종이라고 결론 내리기는 어렵다. 결론적으로, 특정 유산균의 특이적인 primer를 이용한 multiplex PCR 기술은 질의 건강상태의 변화 또는 질의 질병으로부터 회복 과정을 예측할 수 있는 도구로서 유용할 것으로 생각된다.
, 2010), 이를 다시 Lactobacillus iners, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri 그룹과 Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus fermentum 그룹으로 구분하여 각 균종의 특이적인 염기서열을 기준으로 multiplex PCR system을 이용한 검출도구를 제작하였다. 본 연구에서 활용한 multiplex PCR system은 여러 종의 유산균을 동시에 검출할 수 있는 기술로서 기존의 단일 PCR 방법이나 PCR RFLP 방법과 비교하여 빠르고 효율적인 방법이며(Sung et al., 2007) 여성 질 건강 및 질염의 진행 여부를 확인하는데 유용한 방법으로 판단된다.
아울러 Fig. 3과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 실험 대상 166명 가운데 50% 이상의 시료에서 L. iners, L. crispatus, L. acidophilus 와 L. jensenii는 공통적으로 검출되는 유산균 종으로 나타났다.
전체적으로 L. crispatus가 가장 높은 77% 의 빈도로 확인되었고 L. iners, L. acidophilus, L. jensenii의 분포는 약 57–59% 빈도로 검출되었다.
채취한 166개의 시료로부터 multiplex PCR 기술을 적용하여 최종적으로 얻어진 목적하는 특정 유산균 종의 특이적인 16S rRNA의 단편을 이용하여 Fig. 2에서 보는 바와 같이 건강한 20대 여성의 질 내에 서식하는 보편적인 유산균 종의 종류와 분포를 확인할 수 있었다. 전체적으로 L.
후속연구
, 2011). 따라서 생식기에 문제가 있거나 질병이 의심되는 여성의 질 내부에 서식하는 유산균의 생물량, 분포와 종 등을 확인하면 건강의 정도나 질병의 가능성을 예측할 수 있는 자료로서 이용이 가능하다고 보여진다.
, 1990) 면역학적 방어기전 이외에 생화학적 방어 작용을 강화함으로서 숙주의 건강상태를 유지하는 데 직접적인 도움을 준다. 이러한 유산균의 특징으로 인하여 인체의 구강, 대장 그리고 질 등에 서식하는 유산균의 종 다양성과 양을 확인함으로써 해당 기관의 미생물학적 안정성을 확인하는 지표로 활용될 수 있을 것으로 보인다.
이와 같은 결과로 볼 때 질 내부에 서식하는 유산균 종의 분포와 우점종의 종류를 확인하는 것만으로 생식기관의 건강상태 및 질염의 발병 여부를 예측할 수 있을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
여성의 질이 서식 미생물을 위한 영양 조건을 충족하는 까닭은 무엇인가?
여성의 질은 분비물에 함유된 또는 유산균이 생산하는 유기산에 의해 약한 산성조건이 유지되며 다당류인 글리코겐을 포함 하는 분비물에 의해 서식 미생물을 위한 영양 조건을 충족하고 있다(Barbérs and Boris, 1999). 이러한 인체 생리조건에 의해 형성된 온도, 수분, 영양, 공간 등은 유산균의 생장을 위해 요구되는 최적의 서식환경을 조성하기 때문에 인체의 생리적인 건강상태가 양호할 때는 다양한 종의 유산균의 밀도가 증가하여 정상적인 유산균이 우점하는 질 내 환경을 형성한다.
여성의 질에서 유산균은 어떤 항균물질을 생산하는가?
이렇게 낮아진 질의 산도는 다른 종류의 미생물들의 생장을 억제하여 건강한 질 내 환경을 유지할 수 있도록 한다. 그리고 이와 함께, 유산균은 organic acid, hydrogen peroxide, bacteriocins, reuterin, diacetyl, acetaldehyde 등의 항균 물질을 생산함으로써 (Redondo-Lopez et al., 1990) 면역학적 방어기전 이외에 생화학적 방어 작용을 강화함으로서 숙주의 건강상태를 유지하는 데 직접적인 도움을 준다.
유산균이 숙주의 면역반응을 발생시키지 않고 병원성 미생물의 생장을 억제할 수 있는 환경을 조성할 수 있는 까닭은 무엇인가?
, 1991). 또한 숙주가 생산하거나 대사하는 당을 발효하여 젖산, 아세트산, 알코올 등 숙주의 세포에 생리적인 영향을 주지 않는 대사산물을 생산하기 때문에 숙주의 면역학적 반응을 유발하지 않고 유기산에 의한 pH를 저하하는 기능이 있어 기타 오염균이나 동식물의 조직에서 고도 생장이 가능한 병원성 미생물의 생장을 억제할 수 있는 환경을 조성한다 (Redondo-Lopez et al., 1990).
참고문헌 (20)
Ahn, H.R., So, J.S., and Oh, K.H. 2011. Characterization and antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from vaginas of women of childbearing age. Kor. J. Microbiol. 47, 308-315.
Antonio, M.A., Hawes, S.E., and Hillier, S.L. 1999. The identification of vaginal Lactobacillus species and the demographic and microbiologic characteristics of women colonized by these species. J. Infect. Dis. 180, 1950-1956.
Antonio, M.A., Rabe, L.K., and Hillier, S.L. 2005. Colonization of the rectum by Lactobacillus species and decreased risk of bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 192, 394-398.
Burton, J.P., Cadieux, P.A., and Reid, G. 2003. Improved understanding of the bacterial vaginal microbiota of women before and after probiotic instillation. Appl. Environ. Microbiol. 69, 97-101.
Collins, M.D., Rodrigues, U., Aguirre, A.M., Ash, C., Aguirre, M., Farrow, J.A.E., Martinez-Murcia, A., Phillips, B.A., and Williams, A.M. 1991. Phylogenetic analysis of the genus Lactobacillus and related lactic acid bacteria as determined by reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. FEMS Mcrobiol. Lett. 77, 5-12.
Dickson, E.M., Riggio, M.P., and Macpherson, L. 2005. A novel species-specific PCR assay for identifying Lactobacillus fermentum. J. Med. Microbiol. 54, 299-303.
Falsen, E., Pascual, C., Sjoden, B., Ohlen, M., and Collins, M.D. 1999. Phenotypic and phylogenetic characterization of a novel Lactobacillus species from human sources: description of Lactobacillus iners sp. nov. Int J. Syst. Bacteriol. 49, 217-221.
Park, M.Y., Park, H.M., So, J.S., and Kim, S.C. 2004. Microbiologic and molecular genetic analysis of Lactobacillus spp. isolated from vagina of Korean women and a pilot clinical study on the treatment of vaginitis using the best Lactobacillus strain KLB 46. Kor. J. Obstet. Gynecol. 47, 1154-1164.
Pavlova, S.I., Kilic, A.O., Kilic, S.S., So, J.S., Nader-Macias, M.E., and Simoes, J.A. 2002. Genetic diversity of vaginal lactobacilli from women in different countries based on16S rRNA gene sequences. J. Appl. Microbiol. 92, 451-459.
Redondo-Lopez, V., Cool, R.L., and Sobel, J.D. 1990. Emerging role of lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora. Infect. Dis. Rev. 12, 856-872.
Song, Y.L., Kato, N., Matsumiya, Y., Liu, C.X., Kato, H., and Watanabe, K. 1999. Identification of and hydrogenperoxide production by fecal and vaginal lactobacilli isolated from Japanese women and new born infants. J. Clin. Microbiol. 37, 3062-3064.
Sul, S.Y., Kim, H.J., Kim, T.W., and Kim, H.Y. 2007. Rapid identification of Lactobacillus and bifidobacterium in probiotic products using multiplex PCR. J. Microbiol. Biotechnol. 17, 490-495.
Sung, H.R., Joo, J.Y., Lee, C.K., Chung, Y.B., and Song, S.G. 2007. Simultaneous detection of cytomegalovirus, epstein-barr virus, hepatitis B virus, and parvovirus by a multiplex PCR. Kor. J. Microbiol. 43, 1-6.
Vasquez, A., Jakobsson, T., Ahrne, S., Forsum, U., and Molin, G. 2002. Vaginal Lactobacillus flora of healthy Swedish women. J. Clin. Microbiol. 40, 2746-2749.
Zozaya-Hinchliffe, M., Lillis, R., Martin, D.H., and Ferris, M.J. 2010. Quantitative PCR assessments of bacterial species in women with and without bacterial vaginosis. J. Clin. Microbiol. 48, 1812-1819.
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