[논문]삭시톡신 분석을 위한 항체의 제조 및 항-삭시톡신 항혈청의 민감도 분석

장만; 이건섭; 모상현; 신경순; 오정균; 이택견

doi:10.5762/kais.2012.13.12.6208

삭시톡신 분석을 위한 항체의 제조 및 항-삭시톡신 항혈청의 민감도 분석
Production of antibodies for saxitoxin analysis and sensitivity analysis of anti-saxitoxin antiserum 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.13 no.12, 2012년, pp.6208 - 6214

장만 (한국해양과학기술원) , 이건섭 (한국해양과학기술원) , 모상현 (바이오에프디엔씨 항노화연구소) , 신경순 (한국해양과학기술원) , 오정균 (목포대학교 생명과학과) , 이택견 (한국해양과학기술원)

초록
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해양미세조류 유래 독성물질에 대한 이해와 활용에 있어서 가장 중요하지만 간과되고 있는 부분은 독성물질을 검출할 수 있는 빠르고, 쉽고 경제적인 검출기술을 개발하는 것이다. 이 논문에서 우리는 삭시톡신(STX)에 대한 항체를 생산하였다. 헤모시아닌(mariculture keyhole limpet hemocyanin, mcKLH)과 오브알부민(ovalbumin, OVA)을 운반단백질로 사용하였다. 면역반응을 위해서 mcKLH-STX 결합체를 BALB/c 쥐에 복강주사하였다. 채혈 후 항-STX 항혈청을 분리하였다. 항혈청의 역가분석을 위하여 유리 STX와 OVA-STX로 코팅된 microtiter plate를 이용하여 간접 ELISA 실시하였다. 발색반응을 위한 이차항체로는 goat anti-mouse IgG-phosphatase conjugate가 사용되었다. 항-STX 항혈청은 OVA-STX와 유리 STX에 특이적으로 반응하였다. 항-STX 항혈청의 민감도는 매우 높았으며, STX를 위한 검출한계는 약 64.9 ng/kg이었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The most essential but missing components to understand and use toxic substances from marine microalgae are developing the fast, easy and economical determining technology for detecting it. In this paper we produced the antibodies against saxitoxin (STX). Mariculture keyhole limpet hemocyanin (mcKLH) and ovalbumin (OVA) were used as carrier proteins. mcKLH-STX conjugates were injected into the peritonial cavity of BALB/c mouse for immunization. After bleeding from mouse, anti-STX antiserum was isolated. Indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) was performed to determine antiserum titer using the microtiter plate coated with free STX and OVA-STX. A goat anti-mouse IgG-phosphatase conjugate was used as secondary antibody to enable chromogenic reaction. Reactions of anti-STX antiserum were very specific on the OVA-STX and free STX. Sensitivity of anti-STX antiserum on STX was very high and STX detection limit was to be 64.9 ng/kg for indirect ELISA.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이에 따라 우리는 PSP 독소 중 STX에 대한 다양한 면역학적 및 세포학적 연구의 기반을 구축하고자 STX에 특이한 항체를 생산하였다. 시험된 여러 가지 시도 중에 우리는 keyhole limpet hemocyanin(KLH)에 결합된 STX를 쥐에 주사하여 혈청으로부터 항체를 생산하고, 생산된 항체는 간접 enzyme-linked immunosorbent assays (Indirect-ELISA)를 개발하기 위해 사용되었다. 항체와 STX의 반응에 의해 발색되는 정도를 측정함으로써 독성물질을 검출하도록 하는 항체 생산 과정 및 검출한계를 분석하였다.
이에 따라 우리는 PSP 독소 중 STX에 대한 다양한 면역학적 및 세포학적 연구의 기반을 구축하고자 STX에 특이한 항체를 생산하였다. 시험된 여러 가지 시도 중에 우리는 keyhole limpet hemocyanin(KLH)에 결합된 STX를 쥐에 주사하여 혈청으로부터 항체를 생산하고, 생산된 항체는 간접 enzyme-linked immunosorbent assays (Indirect-ELISA)를 개발하기 위해 사용되었다.

제안 방법

Free STX가 코팅된 microtiter plate의 경우는 BSA(0.5 g/well)만 코팅되어 있는 well을, OVA-STX 가 코팅된 경우는 OVA(1 μg/well)를 코팅시킨 well을 대조구로 사용하였다.
반응이 끝난 후에 접합이 되지 않은 STX와 운반단백질 용액에 남아 있는 EDTA는 탈염컬럼(D-SaltTM desalting column)을 사용하여 제거하였다. STX-운반단백질 접합체는 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 단백질 복합체는 Bradford assay 용액을 이용하여 정량 후, 적정량을 분주하여 20℃에 보관하였다.
mcKLH-STX로 면역반응시킨 쥐로부터 획득한 항혈청의 titer를 알아보기 위하여, OVA-STX 및 OVA를 코팅시킨 micrititer plate를 이용하여 indirect ELISA를 실시하였다. 항-STX 항혈청은 OVA-STX와 특이적으로 반응을 하며, OVA에는 반응하지 않았다(Fig.
2%(w/v) BSA/PBST를 이용하여 1/1000부터 1/64000까지 1/2씩 serial dilution하여 100 μL씩 분주한 후, 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 각 항원에 대하여 두 번 반복하여 실시하였으며, 항혈청을 넣지 않는 well을 (-)대조구로 사용하였다. 반응이 끝난 후, PBST 로 3회 세척하였으며, 이차항체로는 goat anti-mouse IgG-phosphatase conjugate (Sigma)를 0.
순차적으로 희석된 free STX를 고정화시킨 microtitier plate에 anti-mcKLH-STX antiserum을 0.2%(w/v) BSA/PBST로 5000 배 희석하여 100 μL 씩 분주하고 동일한 조건에서 실험을 진행하였다.
일차항체 결합을 위하여 mcKLH-STX로 면역반응시킨 mouse에서 채취한 항혈청(antiserum)을 0.2%(w/v) BSA/PBST를 이용하여 1/1000부터 1/64000까지 1/2씩 serial dilution하여 100 μL씩 분주한 후, 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다.
정제된 STX은 Imject® Immunogen EDC conjugation kit(Pierce)를 사용하여 운반단백질에 접합되었으며, STX운반단백질 접합체는 Fig. 2과 같이 SDS-PAGE를 통하여 접합 여부를 확인하였다.
다클론 항혈청의 제조를 위하여 BALB/c 쥐(4 주령)를 면역반응(immunization) 유도를 위한 시험동물로 사용하였다. 첫번째 면역반응에는 complete Freunds adjuvant를사용하였으며, 두번째 면역반응부터는 incomplete Freunds adjuvant를 사용하였다. 각 면역반응에는 쥐 한마리당 50 g의 mcKLH-STX 접합체가 되도록 멸균된 phosphate buffered saline(PBS) 용액에 희석하여 사용하였으며, 복강주사하였다.
면역반응은 10 일에 한 번씩 실시하였다. 총 4 회의 면역반응 후에 항체 titer를 측정하기 위하여 채혈을 하였으며, 혈전을 원심분리에 의하여 제거한 후, 상층의 혈청만을 사용하였다.
항-STX 항혈청에 대한 free STX의 반응을 분석하기 위하여, free-STX를 도말한 micrititer plate를 이용하여 indirect ELISA를 실시하였다. Fig.
시험된 여러 가지 시도 중에 우리는 keyhole limpet hemocyanin(KLH)에 결합된 STX를 쥐에 주사하여 혈청으로부터 항체를 생산하고, 생산된 항체는 간접 enzyme-linked immunosorbent assays (Indirect-ELISA)를 개발하기 위해 사용되었다. 항체와 STX의 반응에 의해 발색되는 정도를 측정함으로써 독성물질을 검출하도록 하는 항체 생산 과정 및 검출한계를 분석하였다.
항혈청 민감도의 측정을 위해서는 0-50 μM 범위에서 serial dilution을 하여 동일한 방법으로 microtitier plate에 분주하였다.

대상 데이터

다클론 항혈청의 제조를 위하여 BALB/c 쥐(4 주령)를 면역반응(immunization) 유도를 위한 시험동물로 사용하였다. 첫번째 면역반응에는 complete Freunds adjuvant를사용하였으며, 두번째 면역반응부터는 incomplete Freunds adjuvant를 사용하였다.
정제된 STX는 NRC-CNRC(Canada)에서 구입하였으며, 단백질과의 접합(conjugation)은 Imject® Immunogen EDC conjugation kit(Pierce, IL, USA)를 사용하였다.

이론/모형

2%(w/v) BSA/PBST로 5000 배 희석하여 100 μL 씩 분주하고 동일한 조건에서 실험을 진행하였다. STX의 검출한도는 non-linear four-parameter logistic calibration plots법에 의해 계산되었다[17].

성능/효과

특히 생산된 항-STX 항혈청을 현장 적용하였을 경우, 반응을 보이는 값인 OD405=1 이상인 값은 이론적으로 11,530배 희석하였을 때 얻을 수 있으며, 초기 free-STX 농도가 2.5 μM이었으므로 2.5 μM을 11,530으로 희석한 값 즉 0.217 nM 즉 64.9 ng/kg의 STX까지 효과적으로 감지할 수 있을 것으로 판단된다(Table 1).

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	우리나라 양식산업은 어업생산의 얼마를 차지하는가?	우리나라 남해안에서 주로 발생하는 유해조류의 이상 증식현상(적조)은 대체로 유독성 편모조류에 의한 것으로, 우리나라 총 어업생산의 30 %를 차지하는 양식산업에 막대한 피해를 주고 있는 실정이다. 이에 따라 국내 연구소 뿐만 아니라 대학 등에서도 적조방제를 위한 다각적인 노력을 기울이고 있다[1,2].
	삭시톡신이란?	1)에 의해 일어난다. STX는 가장 치명적인(LD50 9 μg/kg) 비단백질성 독소 중의 하나이며[4], 여러 해양 와편모조류나 담수 조류에 의해 생성되는 마비성패독 중의 하나이다. PSP 독소 검출 시험법 중 EU의 기준시험법인 mouse bioassay(MBA)가 전통적으로 활용되어 왔으며[5], 여러가지 알려진 단점을 보완하고자 대체시험법으로 HPLC-FLD[6]를 이용하는 방법이 제시된 바 있다[7].
	유해조류의 이상 증식현상의 주된 원인은?	우리나라 남해안에서 주로 발생하는 유해조류의 이상 증식현상(적조)은 대체로 유독성 편모조류에 의한 것으로, 우리나라 총 어업생산의 30 %를 차지하는 양식산업에 막대한 피해를 주고 있는 실정이다. 이에 따라 국내 연구소 뿐만 아니라 대학 등에서도 적조방제를 위한 다각적인 노력을 기울이고 있다[1,2].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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