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문제 정의
- 최근 누에 유래 실크 단백질은 의료용 생체소재로 활용 가능성이 점차 커지고 있으나 다양한 분야에 적용을 위한 원료 가공에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 누에 고치 대신 동결 건조한 실샘으로부터 고온, 고압 또는 유기용매 등을 사용하지 않고 상온에서 수용성 가수분해물을 제조하는 새로운 제조방법을 개발하였다. 그리고 제조된 누에 실샘 가수분해물의 특성과 세포 증식에 대한 효과를 분석하였다.
- 본 연구에서는 인체에 유해한 용매를 사용하지 않고 누에 실샘으로부터 가수분해물을 제조하는 새로운 공정을 개발하였다. 제조된 누에 실샘 가수분해물의 특성 분석을 통해 누에고치 유래 세리신 가수분해물(CSH)과 구성 성분 및 물성이 상이함을 확인하였다.
제안 방법
- 98-well plate에 인간 피부 섬유아세포와 중간엽줄기세포를 각 well 당 3 × 103 cells로 분주한 다음 24시간 동안 배양한 후 누에 실샘 및 고치 유래 가수분해물이 농도별(0.2, 0.5, 1, 2, 5 mg/ml)로 첨가된 배지를 200 μl씩 첨가 후 24시간 동안 배양하였다.
- 가수분해 조건이 서로 다른 SSGH, TSGH, 그리고 CSH의 분자량을 측정하기 위하여 SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 일반적으로 누에고치를 이용하여 제조한 가수분해물(CSH)의 경우 15 ~ 50 kDa으로 분포하며 중저분자 상태로 존재하였다.
- 1c). 가수분해된 SSGH와 TSGH의 상등액에 인산을 첨가하여 중화시킨 뒤 셀룰로오스 투석막(MWCO = 3,000, Spectrum, USA)을 이용하여 3일 동안 증류수로 투석하였다. 투석 과정 중 발생한 침전물을 제거하기 위하여 4℃에서 13,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 누에 실샘 가수분해 용액을 제조하였다.
- 따라서 본 연구에서는 누에 고치 대신 동결 건조한 실샘으로부터 고온, 고압 또는 유기용매 등을 사용하지 않고 상온에서 수용성 가수분해물을 제조하는 새로운 제조방법을 개발하였다. 그리고 제조된 누에 실샘 가수분해물의 특성과 세포 증식에 대한 효과를 분석하였다.
- 누에 실샘 가수분해물의 2차 구조를 확인하기 위하여 FT-IR 분석을 수행하였다. SSGH, TSGH, CSH의 IR-spectrum의 패턴은 1625 ~ 1655 cm-1와 3420 ~ 3440 cm-1에서 각각 피크를 나타내었다(Fig.
- 누에 실샘 가수분해물의 단백질 특성을 확인하기 위하여 SSGH, TSGH, CSH의 아미노산 조성을 분석하였다. SSGH에서는 글리신(29.
- cells로 분주한 후 24시간 배양한 다음 FBS가 포함되지 않은 배양 배지에 1 mg/ml 누에 실샘 및 고치 유래 가수분해물을 처리한 후 96시간 동안 배양하였다. 배양 동안에 24시간 간격으로 10% WST-1이 첨가된 배지를 처리하여 3시간 동안 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양 후 ELISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 분석하였다.
- 2009). 이러한 생체 적합성을 확인하기 위하여 인간 중간엽줄기세포와 피부 섬유아세포를 이용하여 SSGH, TSGH, CSH에 대한 세포독성 분석을 수행하였다. 그 결과 SSGH, TSGH, CSH원료 모두 세포 생존율에 영향을 주지 않았다(Fig.
- 누에 실샘 가수분해물 3 mg을 6 N HCl 2 ml에 넣고 질소 가스를 이용하여 1분간 탈기한 후, 100 ~ 120℃에서 24시간 동안 가수분해 후 80 ~ 90℃에서 건조시켰다. 이렇게 건조된 잔여물을 0.2 N HCl 3 ml로 용해시킨 후 닌하이드린법을 이용하여 아미노산을 정량 한 다음 양이온 교환 컬럼이 장착되어 있는 아미노산 자동분석기(Hitachi model 835, Japan)로 분석하였다.
- 인간 피부 섬유아세포와 중간엽줄기세포를 48-well plate에 각 well 당 1 × 104 cells로 분주한 후 24시간 배양한 다음 FBS가 포함되지 않은 배양 배지에 1 mg/ml 누에 실샘 및 고치 유래 가수분해물을 처리한 후 96시간 동안 배양하였다.
- 적외선 스펙트럼 파장 4000 ~ 300 cm-1에서 존재하는 쌍극자 모멘트가 변화하는 분자 골격의 진동과 회전에 대응하는 에너지 흡수 반응 작용기를 확인하기 위하여 FTIR spectrometer (Bruker, USA)를 이용하여 분석하였다(Sarovart et al. 2003, Prasong et al. 2009).
- 정량한 누에 실샘 가수분해물을 14% SDS polyacrylamide gel에 넣고 Dual Mini Slab Kit(Bio-rad, Mini-PROTEAN 3 Cell)을 이용하여 전기영동 하였다. 전기영동 후 gel은 Coomassie brilliant R 250으로 염색하였고, 표준 분자량 표지 단백질(ELPIS, Korea)을 이용하여 분자량을 분석하였다.
대상 데이터
- 5령 7일 익은 누에(백옥잠)를 동결건조하여 실샘만 분리한 후, 원심식 초미세분말 제조기를 이용하여 실샘 분말을 제조하였다(Fig. 1a). 수용성 누에 실샘 가수분해물(soluble silkworm gland hydrolysate, 이하 “SSGH”라 약칭)의 제조는 실샘 분말 24 g을 증류수 800 ml에 혼합하여 상온에서 30분 동안 교반 후 4℃에서 13,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 상등액만 회수하였다.
- 이렇게 제조된 누에 실샘 가수분해 용액을 영하 20℃에서 냉동시킨 후 동결건조하여 분말 상태로 제조하였다. 또한 대조군으로 누에고치 유래 세리신 가수분해물(cocoon-derived sericin hydrolysate, CSH)(Sigma-Aldrich, USA)를 이용하였다.
- 인간 피부 섬유아세포 배양을 위해 10% FBS(fetal bovine serum; Hyclone, USA)와 100 U streptomycin, 100 μg/ml penicillin이 함유된 DMEM (Dulbecco’ s Modified Eagle’s Medium; Hyclone, USA) 배지를 사용하였고, 탯줄 유래 중간엽줄기세포는 10% FBS, 100 U streptomycin, 100 μg/ml penicillin이 함유된 α-MEM (alpha minimum essential medium; Hyclone, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
이론/모형
- 누에 실샘 가수분해물의 정량은 Bradford 분석법을 이용하였다. 정량한 누에 실샘 가수분해물을 14% SDS polyacrylamide gel에 넣고 Dual Mini Slab Kit(Bio-rad, Mini-PROTEAN 3 Cell)을 이용하여 전기영동 하였다.
성능/효과
- FBS가 첨가되지 않은 배지에 1 mg/ml SSGH를 첨가하여 인간 중간엽줄기세포와 피부섬유아세포를 배양한 결과 10% FBS를 첨가한 대조군과 동등한 세포 증식 촉진효과를 나타내었다. 반면 TSGH와 CSH의 증식효과는 대조군 대비 70%를 나타내었다(Fig.
- 또한 1 mg/ml 수용성 누에 실샘 가수분해물(SSGH)을 첨가한 경우 10% FBS를 첨가한 대조군과 동등한 세포 증식효과가 있음을 증명하였다. 결론적으로 누에 실샘 가수분해물은 혈청을 대체할 수 있는 우수한 소재임을 확인하였다. 본 연구에서 개발한 제조방법을 통해 생산된 누에 실샘 가수분해물은 향후 화장품 및 의료용 소재로 그 응용범위를 확대할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이러한 생체 적합성을 확인하기 위하여 인간 중간엽줄기세포와 피부 섬유아세포를 이용하여 SSGH, TSGH, CSH에 대한 세포독성 분석을 수행하였다. 그 결과 SSGH, TSGH, CSH원료 모두 세포 생존율에 영향을 주지 않았다(Fig. 4).
- 2006). 따라서 SSGH, TSGH 그리고 CSH의 가수분해 제조 공정을 비교할 때 고온에서 가수분해한 TSGH와 CSH가 상온에서 가수분해된 SSGH보다 저분자 형태로 존재하였으며 이에 따른 각 원료의 물성의 차이는 제조시 처리 온도에 기인함을 알 수 있었다.
- 1995). 따라서 SSGH는 세리신과 피브로 인에 해당하는 주요 아미노산 성분이 모두 존재하는 것을 확인하였다.
- 이러한 이유로 SSGH는 무혈청 배지에서 세포증식 촉진과 세포사멸 억제에 보다 효과적인 영향을 주는 것으로 사료된다. 따라서 본 연구에서 제조한 SSGH는 세포배양을 위한 배지 첨가제 및 소혈청 대체재로 이용할 수 있음을 확인하였다.
- 본 연구에서 제조한 SSGH, TSGH 그리고 대조군 CSH 모두 세리신에서 나타나는 특이적인 피크와 동일한 패턴을 확인하였으며 실샘을 원료로 제조한 SSGH와 TSGH는 누에고치를 원료로 제조한 CSH보다 random coil과 β-sheet에 해당하는 작용기가 1~3배 낮게 확인되었다. 따라서 실샘 가수분해물과 고치 유래 세리신 가수분해물의 물성 차이는 제조시 가해지는 온도의 차이와 이로 인해 형성되는 각 가수분해물 2차구조의 변화에 기인함을 확인하였다.
- 제조된 누에 실샘 가수분해물의 특성 분석을 통해 누에고치 유래 세리신 가수분해물(CSH)과 구성 성분 및 물성이 상이함을 확인하였다. 또한 1 mg/ml 수용성 누에 실샘 가수분해물(SSGH)을 첨가한 경우 10% FBS를 첨가한 대조군과 동등한 세포 증식효과가 있음을 증명하였다. 결론적으로 누에 실샘 가수분해물은 혈청을 대체할 수 있는 우수한 소재임을 확인하였다.
- 본 연구에서 제조한 SSGH, TSGH 그리고 대조군 CSH 모두 세리신에서 나타나는 특이적인 피크와 동일한 패턴을 확인하였으며 실샘을 원료로 제조한 SSGH와 TSGH는 누에고치를 원료로 제조한 CSH보다 random coil과 β-sheet에 해당하는 작용기가 1~3배 낮게 확인되었다.
- 본 연구에서는 인체에 유해한 용매를 사용하지 않고 누에 실샘으로부터 가수분해물을 제조하는 새로운 공정을 개발하였다. 제조된 누에 실샘 가수분해물의 특성 분석을 통해 누에고치 유래 세리신 가수분해물(CSH)과 구성 성분 및 물성이 상이함을 확인하였다. 또한 1 mg/ml 수용성 누에 실샘 가수분해물(SSGH)을 첨가한 경우 10% FBS를 첨가한 대조군과 동등한 세포 증식효과가 있음을 증명하였다.
후속연구
- 결론적으로 누에 실샘 가수분해물은 혈청을 대체할 수 있는 우수한 소재임을 확인하였다. 본 연구에서 개발한 제조방법을 통해 생산된 누에 실샘 가수분해물은 향후 화장품 및 의료용 소재로 그 응용범위를 확대할 수 있을 것으로 사료된다.
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