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문제 정의
- Renoux (1980)는 레바미졸을 어류에 처리하였을 시 표적세포가 면역세포 중 원충류, 암세포 및 바이러스에 감염된 세포에 대한 저항성을 나타내는 살해세포라는 사실을 제안하였다. 그러나 레바미졸의 활성에 대한 자세한 정보가 미흡한 실정이므로 본 연구에서는 어류모델로 틸라피아를 선정하여 두신 백혈구 내에 존재하는 자연살해세포 (natural cytotoxic cell, NCC)의 활성에 미치는 레바미졸의 효과에 대해 조사하였다.
- 어류의 대식세포활성에 미치는 레바미졸의 영향에 관련된 제한된 정보가 있기는 하지만 어류의 세포살해활성에 관한 유일한 연구는 주표적세포로서 T 림프구와 자연살해세포가 대상이 될 수 있다는 내용에 국한된다(Renoux, 1980). 어류의 NCC 활성과 원생생물, 종양세포 및 바이러스에 감염된 세포에 대항하는 생체방어 메커니즘에 관련된 연구정보가 미진하여 본 연구를 수행하게 되었다.
제안 방법
- 분석 중 DiO가 표지 된 표적세포에 일치되는 FL1영역만을 선택하여 수행하였다. 각 세포독성분석 과정에 DiO가 표지된 또는 두신 백혈구의 표준샘플을 포함시켜 진행하였다. Green과 red 형광색으로 발현되는 사멸된 표적세포의 생존율은 틸라피아 백혈구의 세포살해활성과 연관되었다.
- , 1999)를 기초로 한 f low cytometry를 이용하여 분석하였다. 각 세포살해 활성 분석은 duplicate로 수행하였다. 즉, 두신백혈구들을 5 mL tube (Falcon, Becton Dickinson)에 넣은 후 50 의 DiO가 표지된 표적세포룰 106/mL의 수로 분주하여 최종 50:1의 effector:target 비율이 되게 조정하였다.
- 사료는 연속되는 12일 동안 지속적으로 하루에 틸라피아 생 체중 1 kg 대비 1% 되는 양으로 급이하였다. 그 이후 레바미졸이 없는 일반사료로 대체했으며 시료채취는 레바미졸 사료를 투여한 후 0부터 8주까지 매주에 각각 채취하였다.
- 샘플들을 500 g에서 2분간 원심분리 하였으며 24℃에서 3시간 동안 배양하였다. 대조군으로서 최초의 표적세포 생존율을 결정하기 위해 0시간 째 샘플분석을 하였다. 배양배지로 24℃에서 배양된 표적세포의 생존율을 3시간 동안 분석하였다.
- 두신 백혈구 내의 NCC에 미치는 레바미졸의in vitro 영향을 알아보기 위해 48-well plate (Corning) well 당 3×106 의 세포수와 함께 레바미졸을 음성대조군에는 0, 실험군에는 10-4 부터 104 ng/mL 범위의 농도로 분주한 후 NCC의 활성을 측정하기 전 5시간, 20시간 또는 40시간 동안 22℃에서 배양하였다.
- 레바미졸의 in vivo효과를 알아보고자 140미를 무작위로 4그룹으로 나누고 각 그룹은 레비미졸이 첨가되지 않은 시판되는 펠릿사료를 나머지 3 그룹은 사료 kg 당 50, 100 또는 500 mg의 레바미졸을 각각 첨가한 사료를 급이 하였다. 사료는 연속되는 12일 동안 지속적으로 하루에 틸라피아 생 체중 1 kg 대비 1% 되는 양으로 급이하였다.
- 대조군으로서 최초의 표적세포 생존율을 결정하기 위해 0시간 째 샘플분석을 하였다. 배양배지로 24℃에서 배양된 표적세포의 생존율을 3시간 동안 분석하였다. 배양시간이 종료된 후 FACScan (Becton Dickinson)을 수행하기 전 30 μL의 propidium iodide (400 μg/mL, Sigma)를 각 샘플에 넣어 가볍게 흔들어 섞어 주었다.
- 레바미졸의 in vivo효과를 알아보고자 140미를 무작위로 4그룹으로 나누고 각 그룹은 레비미졸이 첨가되지 않은 시판되는 펠릿사료를 나머지 3 그룹은 사료 kg 당 50, 100 또는 500 mg의 레바미졸을 각각 첨가한 사료를 급이 하였다. 사료는 연속되는 12일 동안 지속적으로 하루에 틸라피아 생 체중 1 kg 대비 1% 되는 양으로 급이하였다. 그 이후 레바미졸이 없는 일반사료로 대체했으며 시료채취는 레바미졸 사료를 투여한 후 0부터 8주까지 매주에 각각 채취하였다.
- ng/mL 범위의 농도로 분주한 후 NCC의 활성을 측정하기 전 5시간, 20시간 또는 40시간 동안 22℃에서 배양하였다. 세포를 배양한 후 백혈구의 생존율은 f low cytometry로 관찰하였다.
- 우선 첫 번째로 어류모델로서 틸라피아를 선정하여 틸라피아의 두신 백혈구에 존재하는 NCC활성에 미치는 레바미졸의 invitro효과를 조사하였다. 그 결과 레바미졸을 101에서103 ng/mL의 농도로 20시간 배양했을 시 살해세포의 활성이 유의성 있게 증가되었다(Fig.
- 틸라피아의 두신백혈구의 자연살해활성을 in vitro 또는 레바미졸이 첨가된 사료를 급이한 후 이중 형광표지(Cuesta et al., 1999)를 기초로 한 f low cytometry를 이용하여 분석하였다. 각 세포살해 활성 분석은 duplicate로 수행하였다.
- 세포를 표지 하기 위해 빛이 차단된 환경에서 3시간 동안 10 μg/ml의 3,3-dioctadecylozacarbocyanine perchlorate(DiO, Sigma)이 첨가된 배양배지에서 배양하였다. 표지 후 잉여의 DiO는 PBS로 세척하였으며 세포의 표지 정도는 flow cytometry로 최종 확인 하였다.
- 실험에 사용된 틸라피아는 100 mg/L 농도의 MS222 (Sigma)를 이용하여 마취시켰다. 혈액을 미부에서 채취하고 두신백혈구는 50% Percoll density gradient (Pharmacia)를 이용하여 분리하였으며 세척과정을 거친 후 마지막으로 5%의 fetal bovine serum (FBS) (Gibco)이 첨가된 MEM (Gibco) 배양배지에 현탁하여 실험에 사용하였다. 세포의 생존율은 98%이상으로 확인되었다.
대상 데이터
- 배양시간이 종료된 후 FACScan (Becton Dickinson)을 수행하기 전 30 μL의 propidium iodide (400 μg/mL, Sigma)를 각 샘플에 넣어 가볍게 흔들어 섞어 주었다. 분석 중 DiO가 표지 된 표적세포에 일치되는 FL1영역만을 선택하여 수행하였다. 각 세포독성분석 과정에 DiO가 표지된 또는 두신 백혈구의 표준샘플을 포함시켜 진행하였다.
- 살해세포활성 분석방법에 마우스 lymphoma 세포주 (L-1210, ATCC CCL-219)를 표적세포로 사용하였다. 표적세포는 10%의 FBS, 100 IU/ml의 penicillin, 100 μg/ml의 streptomycin (Gibco)과 2 mM glutamine (Gibco)이 첨가된 RPMI 1640 배양배지를 이용하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 실험에 사용된 틸라피아는 100 mg/L 농도의 MS222 (Sigma)를 이용하여 마취시켰다. 혈액을 미부에서 채취하고 두신백혈구는 50% Percoll density gradient (Pharmacia)를 이용하여 분리하였으며 세척과정을 거친 후 마지막으로 5%의 fetal bovine serum (FBS) (Gibco)이 첨가된 MEM (Gibco) 배양배지에 현탁하여 실험에 사용하였다.
- 약 90±8 g 크기의 Nile tilapia (Oreochromis niloticus) 140미를 군산대학교 해양과학대학 양어장에서 분양 받아 450 liter의 대형 수조에 넣고 지하수를 공급하여 약 25℃를 유지하였다 사료 급이는 일 일당 어 체중의 1%의 비율로 시판되는 펠릿사료(CJ 제일제당)를 먹였다.
- 표적세포는 10%의 FBS, 100 IU/ml의 penicillin, 100 μg/ml의 streptomycin (Gibco)과 2 mM glutamine (Gibco)이 첨가된 RPMI 1640 배양배지를 이용하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
데이터처리
- ANOVA 테스트 결과 그룹 간 통계적 유의성(P<0.05)을 나타냈을 때 평균치의 비교를 적용하였다.
- 제시된 결과들은 means±S.E.형태로 표시되었으며 ANOVA(one way analysis of variance)로 분석하였다.
이론/모형
- Flow cytometry 결과에 대한 정량분석은 Lysis Software Package (Becton Dickinson)의 통계적 option을 사용하였다. 제시된 결과들은 means±S.
성능/효과
- 결론적으로 요약하자면 틸라피아의 두신 백혈구의 NCC활성은 in vitro 또는 레바미졸의 사료를 통한 투여에 의해 증가되었다. In vitro의 경우 레바미졸과의 배양시간이 NCC활성에 미치는 매우 중요한 조건으로 나타났다.
- 우선 첫 번째로 어류모델로서 틸라피아를 선정하여 틸라피아의 두신 백혈구에 존재하는 NCC활성에 미치는 레바미졸의 invitro효과를 조사하였다. 그 결과 레바미졸을 101에서103 ng/mL의 농도로 20시간 배양했을 시 살해세포의 활성이 유의성 있게 증가되었다(Fig. 1). 반면에 레바미졸을 고농도(104 ng/mL)로 처리한 실험군과 전혀 처리하지 않은 대조군의 어떠한 그룹도 NCC의 활성을 증가시키지는 못하였다.
- 그러나 상대적으로 높은 레바미졸의 농도(25 또는 50 μg/mL)는 면역반응을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다
- 레바미졸을 12일 동안 급이한 후 바로 샘플링 한 그룹에서도 사료 kg 당 100 또는 300 mg의 레바미졸을 투여한 경우에 있어서 통계적으로 유의성 있는 NCC의 활성이 관찰되었다. 더욱이 레바미졸의 투여를 끝낸 후 8주까지의 실험기간까지도 그러한 높은 활성이 유지되었다. 최고치의 NCC활성은 사료 kg 당 300 mg의 레바미졸을 급이한 후 일주일 만에 관찰되었으며 대조군의 활성보다 약 3배까지 상승하는 것으로 관찰되었다.
- 본 연구의 in vivo 실험에서 틸라피아에 레바미졸이 첨가된 사료를 급이 시킨 후 NCC의 활성이 급격히 증가되는 것이 관찰되었다(Fig. 2). 레바미졸을 12일 동안 급이한 후 바로 샘플링 한 그룹에서도 사료 kg 당 100 또는 300 mg의 레바미졸을 투여한 경우에 있어서 통계적으로 유의성 있는 NCC의 활성이 관찰되었다.
- In vivo의 경우 레바미졸을 급이한 틸라피아의 NCC활성이 실험초기부터 증가하기 시작하여 8주 후까지도 유지되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 레바미졸이 일정한 시간 동안만 유지되었다 소멸되는 다른 면역증강물질의 효과와는 상당한 차이가 있음을 알 수 있다.
- 더욱이 레바미졸의 투여를 끝낸 후 8주까지의 실험기간까지도 그러한 높은 활성이 유지되었다. 최고치의 NCC활성은 사료 kg 당 300 mg의 레바미졸을 급이한 후 일주일 만에 관찰되었으며 대조군의 활성보다 약 3배까지 상승하는 것으로 관찰되었다. Kajita et al.
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