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문제 정의
- 따라서 돼지 회장염을 조기에 발견하여 해당 돼지의 처리 및 전염 예방를 위하여 분뇨를 이용한 신속 간이 검진의 개발이 필요한 실정이다. 본 연구는 첫 번째 논문으로서 돼지 분변에서 로소니아균을 검출하기 위한 항체, 항원 준비 및 PCR을 이용한 분변 시료 준비에 대하여 보고하고자 하며, 다음 논문에서는 신속 검진장치를 이용한 회장염 간이검진을 실시하고 그 결과를 살펴보았다.
- 돼지 회장염을 조기에 발견하여 해당 돼지의 처리 및 전염 예방를 위하여 분뇨를 이용한 신속 간이 검진의 개발이 필요한 실정이다. 본 연구에서는 회장염 간이검진을 위한 바이오센서를 개발을 위한 항체와 항원을 준비하고 PCR 테스트를 실시하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
- 본 실험을 토대로 경남 도내 도축장 및 양돈장에서 채취한 분변 200점에 대한 PCR 검사결과 50점에서 양성반응으로 약 25%의 감염이 확인되었으며, 150점에서 음성으로 판명되어 약 75%의 비감염으로 확인되었다. 이렇게 양성 및 음성으로 확인된 분변은 간이검진장치의 항원으로 사용되었고, 이에 대한 결과는 두 번째 논문에서 보고하기로 한다.
제안 방법
- (1) 돼지 회장염의 원인균인 로소니아균을 포획하기 위해서는 항체가 필요하며, 이를 위하여 경상대학교 수의과대학에 의뢰하여 항체를 제작하였다. 항체는 Watarai 등 (2004)의 보고에 기초하여 LsaA synthetic peptide를 국내 Y(사)에 의뢰하여 작제하고, 합성된 peptide를 토끼에 반복 접종하여 rabbit-anti LsaA synthetic peptide polyclonal antibody를 얻었다.
- (2) 합성된 항원이 제조된 항체와 잘 결합함을 확인하기 위하여 임피던스형 측정시스템을 구성하여 검출 시험을 실시하였다. 시험결과, 항원 농도가 높아짐에 따라 임피던스의 값이 증가하여 센서 검출부의 항체가 항원을 잘 포획함을 확인하였다.
- (4) 또한, 시험에 사용될 회장염 양성이 확인된 장유제액과, 역시 양성과 음성이 판정된 분변 시료를 확보하기 위하여, PCR 시험을 실시하였다. 경남 도내 도축장 및 양돈장에서 채취한 분변 200점에 대한 PCR 검사결과 50점에서 양성반응으로 약 25%의 감염이 확인되었으며, 이를 이용하여 간이검진장치의 시험에 이용하였다.
- 표준버퍼 내에 로소니아 균체를 희석하여 로소니아 농도 변화에 따른 임피던스 신호 변화를 측정 및 분석하였다. PBS 버퍼에 로소니아균(약 109 cfu/mL 추정)을 10, 100, 1000배로 희석한 후 실험에 이용하였으며, 임피던스 바이오센서에 3분간 반응시켜 측정하고, PBS 버퍼로 3회 세척한 다음 재측정하였다. 또한, 입력 주파수를 10~500 Hz까지 변화하면서 시험을 실시한 결과, 입력 주파수별 임피던스 값의 변화가 아래의 Table 3과 같이 나타났다.
- PCR mixture의 조건은 5 µL template DNA와 10 µL의 PCR premixture(Intron, Korea), 1 µL 의 각 primer(100 pM), DW 3 µL를 첨가하여 최종 volume가 20 µL 가 되도록 하여 반응 하였다.
- 간이검진 장치를 이용한 시험을 위하여, PCR 방법으로 회장염 양성 및 음성 분변 및 장유제액을 제작하였다. 우선, 분변 내로소니아균 정제를 위하여, 분변 약 1 g에 5 mL의 멸균 PBS를 넣고 30초간 강하게 vortex 한 후, 100 x g, 5분간 원심분리를 수행한다.
- 균체의 신속검진을 위한 기술로서는 임피던스 바이오센서, ELISA test kit, Rapid Lateral flow immunoassay(Rapid kit) 등이 있을 수 있으며 살모넬라 검출 등에 이용되어지고 있다(김기영, 2011). 그러나, 임피던스형의 바이오센서나 ELISA test kit 등은 실험실에서의 측정과정을 거쳐야 하므로 농가 현장에 사용하기에는 부담이 있으며, 이에 따라 다음 논문에서는 로소니아 단클론 항체 및 다클론 항체를 이용한 rapid kit을 이용한 회장염 간이검진을 실시하였다. 또한 분변 잠혈 진단키트를 이용하여 분변 내의 출혈을 검출하여 회장염과의 연관성을 관찰하고 그 결과를 살펴보았다.
- 그러나, 임피던스형의 바이오센서나 ELISA test kit 등은 실험실에서의 측정과정을 거쳐야 하므로 농가 현장에 사용하기에는 부담이 있으며, 이에 따라 다음 논문에서는 로소니아 단클론 항체 및 다클론 항체를 이용한 rapid kit을 이용한 회장염 간이검진을 실시하였다. 또한 분변 잠혈 진단키트를 이용하여 분변 내의 출혈을 검출하여 회장염과의 연관성을 관찰하고 그 결과를 살펴보았다.
- , 2003)를 이용하여 IFAT 방법으로 로소니아균을 확인하였다. 또한 회장염 의심돼지의 분변을 정제하여 동일한 방법으로 로소니아 균의 감염 여부를 확인하였다.
- 제조된 항체가 로소니아 균에 반응하는지를 확인하기 위하여, 항체를 이용하여 분변 및 장관 조직 내의 로소니아 균을 관찰하였으며, 그 과정을 요약하면 다음과 같다. 먼저 장유제액 준비를 위하여 출혈성 증식성회장염(Proliferative hemorrhagic enteropathy, PHE)에 감염된 비육돈을 부검을 통하여 감염돈의 소장 말단 3분의 1 부위와 맹장, 결장 상부 등을 채취하여 시험에 사용하였다. 감염부위가 돼지증식성회장염(Porcine proliferative enteropathy, PPE)으로 인한 병변 부위임을 확증하기 위해 간접형광항체법(indirect immunofluorescence antibody test, IFAT)으로 L.
- 본 연구에서는 로소니아 균의 검출을 위하여 경상대학교 수의과대학과 공동으로 로소니아균에 대한 항체를 제조하였는데, 로소니아균의 표면 단백 (Lawsonia intracelularis surface antigen A; LsaA) 에 대한 합성항원을 작제하여, 토끼에 반복 접종한 후 polyclonal antibody를 제조하였다. 토끼 2마리를 이용하였으며 제조 방법 및 항체에 의한 균체 확인 내용은 다음과 같다.
- 제작된 항체의 농도를 조사하였으며 결과는 아래의 Table 2에 나타내었다. 아울러 동일한 방법으로 일본에서 제조하여 수입된 항체의 농도도 함께 조사하였다. 제작된 항체의 농도조사는 spectrophotomer(Biochrom, Libra S32PC)를 이용하여 측정하였다.
- 위와 같이 제조된 항체가 로소니아균과 반응하는가를 확인하기 위하여 바이오센서를 이용하여 검출 시험을 실시하였다. 측정시스템은 임피던스형 전극 센서의 표면에 로소니아균을 검출할 수 있는 항체가 고정된 임피던스형 검출부, 신호 계측 시스템으로 이루어져 있으며 상세 내용은 다음과 같다(Fig.
- 이어서, 일본에서 수입된 LsaA-JP polyclonal 항체와 유럽산인 Bio X(사)의 Bio 323 monoclonal 항체를 이용하여 ELISA 테스트를 실시하였으며, Table 5에 결과를 나타내었다. Table 에서 나타난 바와 같이 LsaA-JP를 Detector로 하고 Bio 323을 Capture로 한 경우 항원항체 반응 있는 것으로 나타나, 서로 pair가 될 수 있는 것으로 판단되었다.
- 앞서 언급한 바와 같이 본 연구에서는 여러 가지 항체를 종류별로 준비하였다. 이에 따라, 간이검진장치 제작에 앞서 항체 조합별로 sandwich 결합성을 알아보기 위하여 ELISA pair 테스트를 실시하였다. 사용된 항원은 전처리된 회장염 감염 돼지의 양성 장유제액을 사용하였으며, 항원-항체 결합 방법은 sandwich 방식으로 하였다.
- 전극폭은 10 ㎛, 간극은 5 ㎛로 하였다. 임피던스 전극 센서의 표면에 로소니아균을 검출할 수 있는 분자식별부를 형성하기 위하여 제조된 항체를 사용하여 분자식별부 제작하였으며, Figure 3과 같이 로소니아 항체를 임피던스 금 전극의 표면에 화학적 공유결합을 이용하여 고정화 시켰다.
- 아울러 동일한 방법으로 일본에서 제조하여 수입된 항체의 농도도 함께 조사하였다. 제작된 항체의 농도조사는 spectrophotomer(Biochrom, Libra S32PC)를 이용하여 측정하였다.
- 제조된 항체가 로소니아 균에 반응하는지를 확인하기 위하여, 항체를 이용하여 분변 및 장관 조직 내의 로소니아 균을 관찰하였으며, 그 과정을 요약하면 다음과 같다. 먼저 장유제액 준비를 위하여 출혈성 증식성회장염(Proliferative hemorrhagic enteropathy, PHE)에 감염된 비육돈을 부검을 통하여 감염돈의 소장 말단 3분의 1 부위와 맹장, 결장 상부 등을 채취하여 시험에 사용하였다.
- 표준버퍼 내에 로소니아 균체를 희석하여 로소니아 농도 변화에 따른 임피던스 신호 변화를 측정 및 분석하였다. PBS 버퍼에 로소니아균(약 109 cfu/mL 추정)을 10, 100, 1000배로 희석한 후 실험에 이용하였으며, 임피던스 바이오센서에 3분간 반응시켜 측정하고, PBS 버퍼로 3회 세척한 다음 재측정하였다.
- (1) 돼지 회장염의 원인균인 로소니아균을 포획하기 위해서는 항체가 필요하며, 이를 위하여 경상대학교 수의과대학에 의뢰하여 항체를 제작하였다. 항체는 Watarai 등 (2004)의 보고에 기초하여 LsaA synthetic peptide를 국내 Y(사)에 의뢰하여 작제하고, 합성된 peptide를 토끼에 반복 접종하여 rabbit-anti LsaA synthetic peptide polyclonal antibody를 얻었다. 이를 이용하여 형광항체법을 이용하여 전처리된 장유제액 및 분변에서 회장염 검출이 가능하여 회장염 확진판정에 사용가능함을 확인하였다.
- 또한, 장관조직으로부터의 회장염 진단을 위한 PCR 수행 전처리 과정은 다음과 같다. 회장염 의심 돼지의 부검을 통해 얻어진 장관 조직(Figure 6)을 scrap 하여 tissue grinder을 이용해 균질화 하였다. 균질액은 Suh 등(2000)의 방법을 사용하여 DNA 정제를 수행하였으며, 방법은 상기한 분변으로부터 DNA 정제한 동일한 방법을 이용하였다.
대상 데이터
- 3). 검출부는 균 검출을 위한 항체를 신규로 도포하기 위하여 유리기판 위에 65쌍의 맞물린 전극가지로 구성된 금 전극을 형성하였다. 전극폭은 10 ㎛, 간극은 5 ㎛로 하였다.
- (4) 또한, 시험에 사용될 회장염 양성이 확인된 장유제액과, 역시 양성과 음성이 판정된 분변 시료를 확보하기 위하여, PCR 시험을 실시하였다. 경남 도내 도축장 및 양돈장에서 채취한 분변 200점에 대한 PCR 검사결과 50점에서 양성반응으로 약 25%의 감염이 확인되었으며, 이를 이용하여 간이검진장치의 시험에 이용하였다.
- 항체 생산을 위하여 합성된 peptide는 토끼에 반복 접종하여 rabbit-anti LsaA synthetic peptide polyclonal antibody를 얻었다. 또한, 일본 오비히로 대학의 Watarai 교수팀으로부터 받은 Lawsonia intracellularis 감염 토끼로부터 얻어진 polyclonal항체(Wataria et al., 2005)를 준비하였다.
- 본 연구에서는 로소니아 균의 검출을 위하여 경상대학교 수의과대학과 공동으로 로소니아균에 대한 항체를 제조하였는데, 로소니아균의 표면 단백 (Lawsonia intracelularis surface antigen A; LsaA) 에 대한 합성항원을 작제하여, 토끼에 반복 접종한 후 polyclonal antibody를 제조하였다. 토끼 2마리를 이용하였으며 제조 방법 및 항체에 의한 균체 확인 내용은 다음과 같다.
이론/모형
- LsaA synthetic peptide를 이용한 PPE 진단을 수행하기 위하여 Watarai 등(2004)의 보고에 기초하여 LsaA synthetic peptide를 국내 Y(사)에 의뢰 제작하여 항원 및 항체 생산에 사용하였다(Fig. 2). 항체 생산을 위하여 합성된 peptide는 토끼에 반복 접종하여 rabbit-anti LsaA synthetic peptide polyclonal antibody를 얻었다.
- PCR 증폭을 수행하기 위하여 2 sets의 primer을 작제 하였는데 이는 Suh 등(2000)과 Suto 등(2003)의 방법을 참조하여 바이오니아 사에 의뢰하여 작제하였다. 작제된 primer는 LI-1F, LI-1R(예상 size 210 bp), LI-2F, LI2-R (예상 size 319 bp)로 명명하였다.
- 먼저 장유제액 준비를 위하여 출혈성 증식성회장염(Proliferative hemorrhagic enteropathy, PHE)에 감염된 비육돈을 부검을 통하여 감염돈의 소장 말단 3분의 1 부위와 맹장, 결장 상부 등을 채취하여 시험에 사용하였다. 감염부위가 돼지증식성회장염(Porcine proliferative enteropathy, PPE)으로 인한 병변 부위임을 확증하기 위해 간접형광항체법(indirect immunofluorescence antibody test, IFAT)으로 L. intracellularis 균의 감염 여부를 확인 하였다. 이를 확인하기 위하여, 확보된 장유제액에 대해 일본 오비히로 대학의 Watarai 교수팀으로부터 받은 Lawsonia intracellularis감염 토끼로부터 얻어진 polyclonal항체(Wataria et al.
- 걸러진 상층액으로부터 L. intracellularis 균의 DNA를 정제하기 위하여 Suh 등(2001)의 방법을 사용하였다. 간단히 설명하면, 얻어진 분변 0.
- 회장염 의심 돼지의 부검을 통해 얻어진 장관 조직(Figure 6)을 scrap 하여 tissue grinder을 이용해 균질화 하였다. 균질액은 Suh 등(2000)의 방법을 사용하여 DNA 정제를 수행하였으며, 방법은 상기한 분변으로부터 DNA 정제한 동일한 방법을 이용하였다.
- 이에 따라, 간이검진장치 제작에 앞서 항체 조합별로 sandwich 결합성을 알아보기 위하여 ELISA pair 테스트를 실시하였다. 사용된 항원은 전처리된 회장염 감염 돼지의 양성 장유제액을 사용하였으며, 항원-항체 결합 방법은 sandwich 방식으로 하였다. 시험방법은 sandwich ELISA test protocol (Young In Frontier Co.
- 사용된 항원은 전처리된 회장염 감염 돼지의 양성 장유제액을 사용하였으며, 항원-항체 결합 방법은 sandwich 방식으로 하였다. 시험방법은 sandwich ELISA test protocol (Young In Frontier Co., ltd) 을 사용하였으며 Figure 4에 시험 원리와 과정을 나타내었다. 항원과 항체의 샌드위치 반응이 있으면, TMB를 첨가 후 색상의 변화를 일으키며 이를 spectrophometer를 이용하여 OD(optical density)를 측정하여 반응의 정도를 파악하게 된다.
- intracellularis 균의 감염 여부를 확인 하였다. 이를 확인하기 위하여, 확보된 장유제액에 대해 일본 오비히로 대학의 Watarai 교수팀으로부터 받은 Lawsonia intracellularis감염 토끼로부터 얻어진 polyclonal항체(Wataria et al., 2005)와 브라질 UFMG 수의과 대학의 Roberto 교수팀으로부터 받은 polyclonal 항체(Guedes et al., 2003)를 이용하여 IFAT 방법으로 로소니아균을 확인하였다. 또한 회장염 의심돼지의 분변을 정제하여 동일한 방법으로 로소니아 균의 감염 여부를 확인하였다.
성능/효과
- (3) 자체 제작한 polyclonal 로소니아 항체(LsaA-R1, LsaA -R2)와 수입된 polyclonal(LsaA-JP) 및 monoclonal(Bio 323) 항체 간의 sandwich 결합성을 살펴보기 위하여 ELISA테스트를 실시한 결과 capture로 Bio323 monoclonal 항체를, detector로서 LsaA-JP를 이용했을 경우에 항체 반응이 있는 것으로 나타났다. 그러나, 이 경우에도 background 반응이 높아 진단키트로 이용하기에는 어려움이 있는 것으로 판단되었다.
- 경남 도내 도축장 및 양돈장 방문하여 채취한 분변 200점에 대한 PCR을 수행하여 돼지증식성회장염 감염을 조사해본 결과 양성의 경우 210 및 319 bp에서 증폭된 산물이 확인 되었으며(Figure 12), 결과적으로 200개의 분변 샘플 중 50개의 분변에서 PCR반응에 양성으로 나타났다 (Table 6).
- Table 에서 나타난 바와 같이 LsaA-JP를 Detector로 하고 Bio 323을 Capture로 한 경우 항원항체 반응 있는 것으로 나타나, 서로 pair가 될 수 있는 것으로 판단되었다. 그러나 항원항체 반응을 보인 Bio323-LsaA-JP 조합의 경우 항원을 투입하지 않은 상태인 background OD 값이 지나치게 높아서 ELIZA 방식의 로소니아균 검출을 실용화하는 데에는 어려움이 있는 것으로 판단하였다.
- , 2008). 또한, 경상남도 축산진흥연구소 중부지소에서는 2006~2007년도에 임상적으로 회장염 의심이 되었던 농가에서 분변을 채취하여 45농가 420건을 PCR법으로 검사한 결과 농가별 양성농가는 26농가가 감염되어 57.8%의 감염률을 보였으며, 검사 건수별로는 420건 중 113건이 양성으로 판정되어 26.9%의 감염률을 보였다. 그리고 도축장에 출하되는 돼지의 회장 말단 부분의 점막 부분을 스크래핑한 시료를 검사한 결과 188농가의 1,075건 중 109건이 양성으로 판정되어 10.
- 본 실험을 토대로 경남 도내 도축장 및 양돈장에서 채취한 분변 200점에 대한 PCR 검사결과 50점에서 양성반응으로 약 25%의 감염이 확인되었으며, 150점에서 음성으로 판명되어 약 75%의 비감염으로 확인되었다. 이렇게 양성 및 음성으로 확인된 분변은 간이검진장치의 항원으로 사용되었고, 이에 대한 결과는 두 번째 논문에서 보고하기로 한다.
- (2) 합성된 항원이 제조된 항체와 잘 결합함을 확인하기 위하여 임피던스형 측정시스템을 구성하여 검출 시험을 실시하였다. 시험결과, 항원 농도가 높아짐에 따라 임피던스의 값이 증가하여 센서 검출부의 항체가 항원을 잘 포획함을 확인하였다. 그러나, 본 시스템은 고가의 장비가 필요하므로 현장에서의 간이진단에는 이용에는 어려움이 있다.
- 항체는 Watarai 등 (2004)의 보고에 기초하여 LsaA synthetic peptide를 국내 Y(사)에 의뢰하여 작제하고, 합성된 peptide를 토끼에 반복 접종하여 rabbit-anti LsaA synthetic peptide polyclonal antibody를 얻었다. 이를 이용하여 형광항체법을 이용하여 전처리된 장유제액 및 분변에서 회장염 검출이 가능하여 회장염 확진판정에 사용가능함을 확인하였다.
- 이상에서의 시험결과를 분석하면, 입력 주파수 200 Hz에서 시료내의 세균 농도가 높아짐에 따라 약 108 CFU/mL의 농도에서부터 임피던스의 값이 증가하였으며, 임피던스 신호는 세균 농도 증가에 따라 높아져서 109 CFU/mL의 농도에서 그 크기가 급격하게 증가하였고, 따라서, 임피던스 바이오센서 검출부의 항체가 로소니아균을 잘 포획함을 확인함에 따라서 간이진단의 가능성이 있는 것으로 판단하였다. 그러나, 본 시스템은 고가의 장비가 필요하므로 현장에서의 간이진단에는 이용에는 어려움이 있다.
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