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문제 정의
- 본 연구에서는 genistein에 의한 마우스 전지방 3T3-L1세포주의 성장과 지방세포형성에 미치는 영향을 연구하였다. 또한, genistein에 의한 세포생존 및 지방세포형성의 억제기전을 유전자 발현변화를 통해 이해하고자 oligo DNA microarray 실험을 수행하였다.
- 또한, genistein에 의한 세포생존 및 지방세포형성의 억제기전을 유전자 발현변화를 통해 이해하고자 oligo DNA microarray 실험을 수행하였다. 최종적으로 sirtuin-1 유전자의 발현과 genistein에 의한 adipogenesis과정 저해와의 직접적인 관련성을 규명하였다. 이러한 연구결과는 genistein의 항 비만 활성의 새로운 기전을 이해하는데 도움을 줄 것으로 기대된다.
제안 방법
- 본 연구에서는 genistein에 의한 마우스 전지방 3T3-L1세포주의 성장과 지방세포형성에 미치는 영향을 연구하였다. 또한, genistein에 의한 세포생존 및 지방세포형성의 억제기전을 유전자 발현변화를 통해 이해하고자 oligo DNA microarray 실험을 수행하였다. 최종적으로 sirtuin-1 유전자의 발현과 genistein에 의한 adipogenesis과정 저해와의 직접적인 관련성을 규명하였다.
- 즉, 96 well plate에 well당 3×103개의 세포를 접종하고 24시간 동안 배양한 후, 파이토케미칼을 24시간 처리 후, MTS용액(Promega, USA)을 각 well당 20 μl씩 첨가하고 배양기에서 4시간 동안 반응하였다.
- RT-PCR은 PrimeScript™ RT-PCR Kit (TaKaRa, Japan)을 이용하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
- 최종적으로 정제된 total RNA는 NanoQuant Plate™ 를 이용하여 정량한 후, oligo DNA 마이크로어레이 실험과 RT-PCR, real-time PCR에 사용하였다.
- 그 후 2일 후에 Insulin 1 μl/ml를 첨가한 배지와 genistein 50 μM과 DMSO를 각각 처리하여 배지를 교환하였고, 분화유도 4일 후에 genistein 50 μM과 DMSO만을 각각 처리한 배지로 배양액을 교환해주어 4일간 더 배양하였다.
- 분화도중 genistein이 미치는 영향을 확인하기 위하여 배지에 50 μM genistein을 분화유도 시약과 함께 처리하였다.
- 세포가 confluence상태가 되었을 때 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-BRL, USA), 1% penicillin 및 streptomycin (WelGene, Korea)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco-BRL, USA) 배지에 분화유도 물질인 Methylisobutylmethylxanthine(IBMX, Cayman, USA), Dexamethasone (Dex, Cayman, USA) 그리고 Insulin(Ins, Cayman, USA)을 1 μl/ml로 처리한 후, 2일간 분화를 유도하였다.
- 마우스 전지방 3T3-L1세포주에 파이토케미칼을 조건에 따라 24시간 처리한 후 cell viability assay를 수행하였다. Cell viability assay의 방법과 절차는 기 발표된 논문에 따라 진행 하였다[8].
- 마우스 전지방 3T3-L1세포주가 90% confluent 상태가 될 때까지 배양한 후, 분화를 유도하였다. 세포가 confluence상태가 되었을 때 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-BRL, USA), 1% penicillin 및 streptomycin (WelGene, Korea)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco-BRL, USA) 배지에 분화유도 물질인 Methylisobutylmethylxanthine(IBMX, Cayman, USA), Dexamethasone (Dex, Cayman, USA) 그리고 Insulin(Ins, Cayman, USA)을 1 μl/ml로 처리한 후, 2일간 분화를 유도하였다.
- 지방세포 형성여부를 확인하기 위하여 Oil red O 염색을 수행하였다. 즉, 분화가 유도된 세포를 PBS로 세척한 후, 4% formaldehyde로 20분 상온에 고정 시킨 뒤 isopropanol 을 5분간 처리하였다.
- 지방세포 형성여부를 확인하기 위하여 Oil red O 염색을 수행하였다. 즉, 분화가 유도된 세포를 PBS로 세척한 후, 4% formaldehyde로 20분 상온에 고정 시킨 뒤 isopropanol 을 5분간 처리하였다. 그 후, Oil red O staining 용액(Sigma, USA)을 첨가하여 지방세포를 염색시킨 후, 역상 현미경(DFC-295, Leica, Germany)을 이용하여 100배의 배율 하에서 세포의 형태적 변화를 비교 관찰하였고, 현미경에 설치된 카메라를 이용하여 well 단위로 세포 형태를 관찰 하였다.
- 즉, 분화가 유도된 세포를 PBS로 세척한 후, 4% formaldehyde로 20분 상온에 고정 시킨 뒤 isopropanol 을 5분간 처리하였다. 그 후, Oil red O staining 용액(Sigma, USA)을 첨가하여 지방세포를 염색시킨 후, 역상 현미경(DFC-295, Leica, Germany)을 이용하여 100배의 배율 하에서 세포의 형태적 변화를 비교 관찰하였고, 현미경에 설치된 카메라를 이용하여 well 단위로 세포 형태를 관찰 하였다.
- 수확한 마우스 전지방 세포주로부터 Trizol reagent (Invitrogen, USA)를 이용하여 Total RNA를 추출하였다. 그 후 과정은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
- 그 후 과정은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. Total RNA 추출 후 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)을 이용하여 RNA cleanup을 수행하였다. 최종적으로 정제된 total RNA는 NanoQuant Plate™ 를 이용하여 정량한 후, oligo DNA 마이크로어레이 실험과 RT-PCR, real-time PCR에 사용하였다.
- 합성된 cDNA를 주형으로 하여 유전자 특이적인 oligo primer를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction) 과정을 수행하였다. PCR에 사용된 primer의 종류와 서열은 Table 1과 같다.
- RT-PCR은 PrimeScript™ RT-PCR Kit (TaKaRa, Japan)을 이용하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 정량적인 real-time PCR은 ABI Prism 7500 cycler (Applied Biosystem, USA)를 이용하여 수행하였다. Primer는 Table 1과 같고, 각각의 Tm 값은 Primer express 1.
- 주형으로 사용하는 cDNA는 RT-PCR시 수행한 과정과 같은 방법으로 합성하고, 합성된 cDNA에 RNase-free water 60 μl를 첨가하여 희석한 후 사용하였다. 반응 조건은 첫 번째 단계로 50℃에서 2분, 95℃에서 10분간 반응시키고, 두 번째 단계로 95℃에서 15초, 54℃에서 30초, 72℃에서 33초의 cycle을 40번 반복하여 수행하였다. 결과는 ABI Prism 7500 SDS software program (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 분석, 정량 하였으며 분석법으로는 comparative Ct (threshold cycle) method를 이용하였다[12].
- 전지방 세포를 분화하기 전에 Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, USA)을 이용하여 sirtuin-1 siRNA 혹은 negative control siRNA construct을 transfection 하였다.
- Genistein에 의한 3T3-L1 세포주의 세포생존율 저해 및 지방세포형성 억제 효과를 유전자 발현 수준에서 이해하고자, 3T3-L1 세포주에 50 μM genistein을 처리한 후, oligo DNA microarray 실험을 수행하였다.
- 마우스 전지방 세포 3T3-L1의 지방세포 형성과정중에 genistein이 미치는 영향을 확인하기 위하여 지방세포형성을 유도 하면서 50 μM genistein과 대조군으로는 DMSO를 각각 처리하였다.
- 이 중, genistein을 다양한 농도별(10, 25, 50, 100 μM)로 처리한후, cell viability asasy를 수행하였다.
- Genistein을 포함한 4종류의 파이토케미칼에 의한 마우스 전지방세포주 3T3-L1 세포 성장에 미치는 영향을 연구하기 위하여, 마우스 3T3-L1세포주에 genistein (Gen), resveratrol (RES), capsaicin (CPS), 그리고 daidzein (DAID)을 각각 50 μM씩 24시간 동안 처리한 후, cell viability assay를 수행하였다.
- Transfection과정은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였으며, 24시간 동안 transfection시킨 후 DMSO 혹은 50 μM의 genistein을 처리하여 다시 24시간 동안 배양시킨 후 분화를 유도하거나, total RNA를 추출하였다.
- DNA microarray 실험 결과에서 genistein처리에 의해 발현이 증가된 유전자 중 sirtuin-1 유전자의 발현을 확인하였다. 즉, 마우스 전지방세포주 3T3-L1 세포주에 4종류의 파이토케미칼을 처리 한 후, sirtuin-1 유전자의 발현을 RT-PCR과 real-time PCR 방법으로 확인하였다. 그 결과, Fig.
- Genistein에 의한 지방세포형성 억제과정 중에 sirtuin-1 유전자의 관련성을 증명하기 위하여, sirtuin-1 siRNA 를 이용한 실험을 수행하였다. 먼저, sirtuin-1 siRNA가 효과적으로 sirtuin-1 유전자의 발현을 감소 시킬 수 있는지에 대해 확인하였다.
- Genistein에 의한 지방세포형성 억제과정 중에 sirtuin-1 유전자의 관련성을 증명하기 위하여, sirtuin-1 siRNA 를 이용한 실험을 수행하였다. 먼저, sirtuin-1 siRNA가 효과적으로 sirtuin-1 유전자의 발현을 감소 시킬 수 있는지에 대해 확인하였다. 그 결과, sirtuin-1 siRNA의 transfection에 의해 sirtuin-1의 유전자의 발현이 급격하게 감소됨을 확인하였다(Fig.
- 4A). 활성이 확인된 sirtuin-1 siRNA와 대조구로서 negative control-siRNA를 transfection시킨 세포에 genistein과 DMSO를 처리한 후, 7일 동안 지방세포형성과정을 유도하였다. 그 후, 지방형성정도를 확인하기 위하여 Oil red O 염색을 수행하였다.
- 활성이 확인된 sirtuin-1 siRNA와 대조구로서 negative control-siRNA를 transfection시킨 세포에 genistein과 DMSO를 처리한 후, 7일 동안 지방세포형성과정을 유도하였다. 그 후, 지방형성정도를 확인하기 위하여 Oil red O 염색을 수행하였다. 그 결과, Fig.
대상 데이터
- 세포주 배양은 10% BS (Bovine Serum, Gibco, USA), 1% penicillin 및 streptomycin (WelGene, Korea)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA)을 사용하였으며, 배양은 37℃, 5% CO2조건 하에서 배양하였다.
- 마우스 전지방 세포주인 3T3-L1은 한국식품연구원으로부터 분양 받았다. 세포주 배양은 10% BS (Bovine Serum, Gibco, USA), 1% penicillin 및 streptomycin (WelGene, Korea)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA)을 사용하였으며, 배양은 37℃, 5% CO2조건 하에서 배양하였다.
- 세포주 배양은 10% BS (Bovine Serum, Gibco, USA), 1% penicillin 및 streptomycin (WelGene, Korea)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA)을 사용하였으며, 배양은 37℃, 5% CO2조건 하에서 배양하였다. 파이토케미칼인 genistein, resveratrol, capsaicin, daidzein과 대조구로 사용된 DMSO (Dimethyl Sulfoxide)는 Sigma사(USA)로부터 구입하였다.
- Oligo DNA 마이크로어레이 실험과 데이터 분석은 지노믹 트리사(Daejeon, Korea)에 위탁하여 수행하였고, 마이크로어 레이 chip은 미국 Microarrays사의 Agilent Mouse whole genome 4 X 44K arrays (Agilent Techonlogies, Palo Alto, USA)를 사용하였다.
- 추후 모든 실험조건은 50 μM genistein으로 선정하여 실험을 진행하였다.
- Sirtuin-1 small interfering RNA (siRNA) construct은 Bioneer사(Daejeon, Korea)에서 제공해주는 프로그램으로 디자인 한 것을 구입하였다. 전지방 세포를 분화하기 전에 Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, USA)을 이용하여 sirtuin-1 siRNA 혹은 negative control siRNA construct을 transfection 하였다.
데이터처리
- 결과 수치는 4개의 독립적인 well에서 수행한 값을 Microsoft EXCEL program을 이용하여 분석한 후 mean±SD 값으로 나타내었다.
이론/모형
- 마우스 전지방 3T3-L1세포주에 파이토케미칼을 조건에 따라 24시간 처리한 후 cell viability assay를 수행하였다. Cell viability assay의 방법과 절차는 기 발표된 논문에 따라 진행 하였다[8]. 즉, 96 well plate에 well당 3×103개의 세포를 접종하고 24시간 동안 배양한 후, 파이토케미칼을 24시간 처리 후, MTS용액(Promega, USA)을 각 well당 20 μl씩 첨가하고 배양기에서 4시간 동안 반응하였다.
- 반응 조건은 첫 번째 단계로 50℃에서 2분, 95℃에서 10분간 반응시키고, 두 번째 단계로 95℃에서 15초, 54℃에서 30초, 72℃에서 33초의 cycle을 40번 반복하여 수행하였다. 결과는 ABI Prism 7500 SDS software program (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 분석, 정량 하였으며 분석법으로는 comparative Ct (threshold cycle) method를 이용하였다[12]. Relative quantification (RQ) 값은 control에 대한 sample의 상대적 유전자 발현 값으로 나타내었다.
성능/효과
- 그 결과, DMSO를 처리한 세포는 지방세포 형성이 정상적으로 일어난 반면 50 μM genistein 을 처리한 세포에서는 지방세포형성이 저해되는 것을 확인하였다(Fig. 2).
- 즉, 10, 25 μM genistein을 처리한 경우 대조군에 비해 90.4%, 81%의 생존율을 보여 주었으며, 50, 100 μM genistein 을 처리한 경우는 각각 약 70%의 세포생존율을 보여주었다.
- Genistein을 포함한 4종류의 파이토케미칼에 의한 마우스 전지방세포주 3T3-L1 세포 성장에 미치는 영향을 연구하기 위하여, 마우스 3T3-L1세포주에 genistein (Gen), resveratrol (RES), capsaicin (CPS), 그리고 daidzein (DAID)을 각각 50 μM씩 24시간 동안 처리한 후, cell viability assay를 수행하였다. 그 결과, capsaicin을 처리한 경우와 genistein을 처리한 경우, 각각 가장 낮은 세포생존율을 보여 주었다(Fig. 1A). 이 중, genistein을 다양한 농도별(10, 25, 50, 100 μM)로 처리한후, cell viability asasy를 수행하였다.
- 이 중, genistein을 다양한 농도별(10, 25, 50, 100 μM)로 처리한후, cell viability asasy를 수행하였다. 그 결과, 처리한 genistein에 농도의존적으로 세포생존율이 감소됨을 확인하였다 (Fig. 1B). 즉, 10, 25 μM genistein을 처리한 경우 대조군에 비해 90.
- 2). 특히, Oil red O 염색을 수행한 후 세포를 관찰한 결과, 대조군의 경우 빨간색으로 염색됨을 확인하였지만, genistein을 처리한 경우 지방세포가 거의 관찰되지 않았다. 이러한 연구결과는 genistein이 전지방 세포의 지방세포형성과정을 저해하는 효능이 있다는 것을 시사한다.
- DNA microarray 실험 결과에서 genistein처리에 의해 발현이 증가된 유전자 중 sirtuin-1 유전자의 발현을 확인하였다. 즉, 마우스 전지방세포주 3T3-L1 세포주에 4종류의 파이토케미칼을 처리 한 후, sirtuin-1 유전자의 발현을 RT-PCR과 real-time PCR 방법으로 확인하였다.
- 먼저, sirtuin-1 siRNA가 효과적으로 sirtuin-1 유전자의 발현을 감소 시킬 수 있는지에 대해 확인하였다. 그 결과, sirtuin-1 siRNA의 transfection에 의해 sirtuin-1의 유전자의 발현이 급격하게 감소됨을 확인하였다(Fig. 4A). 활성이 확인된 sirtuin-1 siRNA와 대조구로서 negative control-siRNA를 transfection시킨 세포에 genistein과 DMSO를 처리한 후, 7일 동안 지방세포형성과정을 유도하였다.
- 그 후, 지방형성정도를 확인하기 위하여 Oil red O 염색을 수행하였다. 그 결과, Fig. 4B에서 보는 바와 같이 negative control siRNA가 transfection된 세포와 보통세포에서는 genistein에 의해 지방세포가 거의 형성되지 않은 반면 sirtuin-1이 knock-down된 세포에서는 다른 세포에 비해 지방세포형성 과정이 복구됨을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 genistein이 지방세포형성 과정을 억제하며, sirtuin-1유전자의 발현이 지방세포 형성의 저해과정과 밀접한 관련이 있음을 시사한다.
- 그 결과, Fig. 3에서 보는 바와 같이 sirtuin-1 유전자의 발현이 50 μM genistein의 처리에 의해 가장 높게 증가됨을 확인하였다.
- Genistein에 의한 3T3-L1 세포주의 세포생존율 저해 및 지방세포형성 억제 효과를 유전자 발현 수준에서 이해하고자, 3T3-L1 세포주에 50 μM genistein을 처리한 후, oligo DNA microarray 실험을 수행하였다. 발현을 분석한 결과, 1.5 배이상 발현 차이를 보여주는 유전자 중 obesity와 관련된 유전자만을 선별한 결과, 1.5배 이상 발현이 증가되는 유전자는 105개, 1.5배 이상 발현이 감소되는 유전자는 133개로 선별되었다. 발현이 증가되는 유전자 중 일부를 Table 2에 나타내었다.
후속연구
- 최종적으로 sirtuin-1 유전자의 발현과 genistein에 의한 adipogenesis과정 저해와의 직접적인 관련성을 규명하였다. 이러한 연구결과는 genistein의 항 비만 활성의 새로운 기전을 이해하는데 도움을 줄 것으로 기대된다.
- 이러한 연구 결과는 genistein이 지방세포형성 과정을 억제하며, sirtuin-1유전자의 발현이 지방세포 형성의 저해과정과 밀접한 관련이 있음을 시사한다. 따라서, 본 연구결과는 파이토케미칼 genistein에 의한 유전체 수준에서의 유전자 발현변화를 분석하고 기능을 연구함으로써, genistein에 의한 항비만 활성의 새로운 분자생물학적 기전을 이해하는데 도움을 줄 것으로 기대된다.
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