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문제 정의
- 이에 저자는 형개연교탕이 알레르기 비염 치료에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 생쥐 비강 점막에 OVA 항원자극을 통해 인위적으로 알레르기비염을 유발시킨 후 형개연교탕 추출물을 투여하여 알레르기 비염의 대표적인 지표인 산호성 백혈구의 변화와 비강 점막 손상에 관련하여 동통 및 소양증을 일으켜 itching과 sneezing 행동을 유도하는 신경전달물질인 substance P와 혈관신생성을 촉진하는 MIP-2, 그리고 전사인자 NF-κB 활성억제를 통한 항염증효과(iNOS 발현) 등의 변화를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- B. The inhibition of eosinophil distribution. The infiltration of eosinophil(arrow) in SAM noticeably decreased than CON(Congo red stain, ×1000).
제안 방법
- 0.05% 3,3'-diaminobenzidine(Sigma)과 0.01% HCl이 포함된 0.05M tris-HCl 완충용액(pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하였다.
- 머리 분리 후 비강 주변 구조물을 제거한 다음 10% NBF에 실온에서 24시간동안 고정한 후 탈회액(decalcification solution, BBC, UK)에 8시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다. 만들어진 연속절편은 Hematoxylin과 Eosin으로 염색하여 표본을 제작하였다.
- 알레르기 비염 유발 7일 후 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액(neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 머리 분리 후 비강 주변 구조물을 제거한 다음 10% NBF에 실온에서 24시간동안 고정한 후 탈회액(decalcification solution, BBC, UK)에 8시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다. 만들어진 연속절편은 Hematoxylin과 Eosin으로 염색하여 표본을 제작하였다.
- 면역조직화학 결과의 수치화를 위해 Image pro Plus(Media Cybernetic, USA)를 이용한 영상분석을 실시하였다. 유의성은 ANOVA test(SPSS17, SPSS.
- 알레르기 비염 유발 7일 후 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액(neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 머리 분리 후 비강 주변 구조물을 제거한 다음 10% NBF에 실온에서 24시간동안 고정한 후 탈회액(decalcification solution, BBC, UK)에 8시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다.
- 알레르기 비염 유발시 itching과 sneezing에 관여하는 신경전달물질인 substance P 분포 변화 관찰을 위한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편을 proteinase K(20 ㎍/㎖)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 nonspecific background stain의 blocking 위해 5% normal goat serum(DAKO, Denmark)에서 2시간 동안 반응시켰다.
- 알레르기 비염의 대표적 지표인 산호성백혈구의 혈액내 빈도 변화를 조사하기 위해 우선 심장천자로 채혈한 후, Hinkelmann 용액에 희석한 다음 Neubauer 계산반(Superior, Germany)으로 계수하였다. 한편 점막내 산호성백혈구의 분포는 Congo Red stain 후 관찰하였다.
- 염증유발유전자들을 조절하는 전사인자 nuclear factor(NF)-κB와 phosphorylated(p)-IκB protein의 분포 변화를 조사하기 위해 mouse anti mouse nuclear factor(NF)-κB p65(1:500, Santa Cruz Biotec)와 mouse anti mouse p-IKB(1:500, Santa Cruz Biotec)를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
- 알레르기 비염 유발시 itching과 sneezing에 관여하는 신경전달물질인 substance P 분포 변화 관찰을 위한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편을 proteinase K(20 ㎍/㎖)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 nonspecific background stain의 blocking 위해 5% normal goat serum(DAKO, Denmark)에서 2시간 동안 반응시켰다. 그리고 1차 항체인 mouse anti mouse substance P(1:250, Santa Cruz Biotec, USA)에 4℃ humidified chamber에서 72시간 동안 반응시켰다.
- 알레르기 비염 유발을 위해 ovalbumin(OVA : chicken egg albumine, grade V, Sigma)를 항원으로 사용하였다. 인산완충용액(PBS : phosphate buffered saline)과 수산화알루미늄겔(Al(OH)3 gel, Sigma)을 1:1로 하여 OVA 1 ㎎을 PBS와 수산화알루미늄겔용액에 혼합하여 1 ㎖를 만들어 0.1 % OVA용액이 되도록 하였다. 정상군, 대조군 그리고 실험군에게 알레르기 비염 유발 시작 21, 14, 7일전에 0.
- 대한실험동물센타에서 분양 받은 태령 6주된 BALB/c계 암컷 생쥐를 무균사육장치 내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 정상군(NOR), 알레르기 비염을 유발한 대조군(CON) 그리고 알레르기 비염 유발 후 형개연교탕 추출물 투여한 실험군(SAM)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다.
- 최종 감작 7일경과 후 7일 동안 매일 형개연교탕 추출액 2.5 ㎖/㎏/day을 실험군에 구강 투여하였다.
- 염증유발유전자들을 조절하는 전사인자 nuclear factor(NF)-κB와 phosphorylated(p)-IκB protein의 분포 변화를 조사하기 위해 mouse anti mouse nuclear factor(NF)-κB p65(1:500, Santa Cruz Biotec)와 mouse anti mouse p-IKB(1:500, Santa Cruz Biotec)를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 한편 염증 효소인 iNOS의 조직내 분포를 조사하기 위해 mouse anti-mouse iNOS(1:250, Santa Cruz Biotec)를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
- 알레르기 비염의 대표적 지표인 산호성백혈구의 혈액내 빈도 변화를 조사하기 위해 우선 심장천자로 채혈한 후, Hinkelmann 용액에 희석한 다음 Neubauer 계산반(Superior, Germany)으로 계수하였다. 한편 점막내 산호성백혈구의 분포는 Congo Red stain 후 관찰하였다.
- 한편 혈관신생성에 관여하는 IL-8 유사 Angiogenic chemokine인 macrophage inflammatory protein(MIP)-2 분포 변화를 rabbit anti-mouse MIP-2(1:250, Santa Cruz Biotec)을 이용한 면역조직화학적 염색 후 관찰하였다.
- 형개연교탕의 iNOS 생성 억제을 통한 항염증효과가 알레르기 비염 치료에 미치는 영향을 조사하기 위해 행해진 본 연구는 생쥐 비강 점막에 OVA 항원자극을 통해 인위적으로 알레르기 비염을 유발시킨 후 형개연교탕 추출물을 투여한 다음 산호성백혈구 변화, 비강 점막 손상 완화, 전사인자 NF-κB 활성억제를 통한 항염증효과(iNOS 발현) 등의 변화를 관찰하였다.
대상 데이터
- 대한실험동물센타에서 분양 받은 태령 6주된 BALB/c계 암컷 생쥐를 무균사육장치 내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 정상군(NOR), 알레르기 비염을 유발한 대조군(CON) 그리고 알레르기 비염 유발 후 형개연교탕 추출물 투여한 실험군(SAM)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다.
- 알레르기 비염 유발을 위해 ovalbumin(OVA : chicken egg albumine, grade V, Sigma)를 항원으로 사용하였다. 인산완충용액(PBS : phosphate buffered saline)과 수산화알루미늄겔(Al(OH)3 gel, Sigma)을 1:1로 하여 OVA 1 ㎎을 PBS와 수산화알루미늄겔용액에 혼합하여 1 ㎖를 만들어 0.
데이터처리
- 유의성은 ANOVA test(SPSS17, SPSS. USA)를 통해 확인하였고, p < 0.05의 경우 유의성을 인정하였다.
성능/효과
- 1. 알레르기 비염 유발 생쥐에서 알레르기 비염의 지표인 혈액과 조직내 산호성백혈구 수는 감소하였다.
- 2. substance P와 MIP-2 양성반응이 감소하여 비강 점막손상을 완화시켰다.
- 3. 염증반응의 주도적 전사인자 NF-κB의 활성 억제를 일으켰고 전염증효소인 iNOS 생성이 억제되었다.
- NF-κB p65 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비해 1795% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비해 61% 감소한 것으로 관찰되었다(Fig. 3-A).
- 알레르기 비염 유발시 itching과 sneezing에 관여하는 신경전달물질인 substance P의 양성반응은 손상된 술잔세포주변의 점막고유층에서 관찰되었고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. Substance P 양성반응은 정상군에 비해 대조군과 실험군에서 증가하였지만, 대조군에서 유의한 증가를 보였다. Substance P 양성반응의 영상분석 결과 대조군(1882±67)은 정상군(135±10)에 비해 1294% 증가하였고, 실험군(665±22)은 대조군에 비해 65% 감소한 것으로 관찰되었다(Fig.
- Substance P 양성반응의 영상분석 결과 대조군(1882±67)은 정상군(135±10)에 비해 1294% 증가하였고, 실험군(665±22)은 대조군에 비해 65% 감소한 것으로 관찰되었다(Fig. 2-B).
- 이러한 iNOS 양성반응은 정상군에 비해 대조군과 실험군에서 증가하였지만, 대조군에서 유의한 증가를 보였다. iNOS 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비해 2373% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비해 74% 감소한 것으로 관찰되었다(Fig. 3-C).
- 또한 본 교실의 저자들 역시 2011년 RAW cell을 이용한 실험연구27)를 통해 형개연교탕이 iNOS mRNA의 발현을 억제하고, NF-κB 활성조절을 통해 iNOS 생성억제로 항염증작용을 일으켜 점막 손상을 완화시킨다는 연구결과를 보고하였으며, 본 실험을 통해 생쥐에 직접 알레르기 비염을 유발시켜 RAW cell에서 관찰했던 결과를 재확인할 수 있었다.
- 알레르기 비염 유발시 itching과 sneezing에 관여하는 신경전달물질인 substance P의 양성반응은 손상된 술잔세포주변의 점막고유층에서 관찰되었고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. Substance P 양성반응은 정상군에 비해 대조군과 실험군에서 증가하였지만, 대조군에서 유의한 증가를 보였다.
- 염증유발유전자들을 조절하는 전사인자 NF-κB p65 양성반응은 손상된 술잔세포주변 점막고유층에서 관찰되었고, 핵과 핵막주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다.
- 우수한 항산화능이 있는 형개연교탕의 투여는 점막손상을 완화시켰는데, 산호성백혈구 수 감소, Substance P 생성 감소 그리고 MIP-2 생성 감소 등이 관찰되었다. 또한 산화스트레스에 의한 NFκB p65, p-IKB 그리고 iNOS 증가도 감소되었다.
- 이러한 NF-κB p65 양성반응은 정상군에 비해 대조군과 실험군에서 증가하였지만, 대조군에서 유의한 증가를 보였다.
- 염증효소인 iNOS 양성반응은 손상된 술잔세포 주변 점막고유층에서 관찰되었고, 핵막주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. 이러한 iNOS 양성반응은 정상군에 비해 대조군과 실험군에서 증가하였지만, 대조군에서 유의한 증가를 보였다. iNOS 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비해 2373% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비해 74% 감소한 것으로 관찰되었다(Fig.
- 이와 같이 본 실험은 알레르기 비염 유발 생쥐의 점막에서 산화스트레스에 의한 NF-κB p65, p-IKB 그리고 iNOS 양성반응의 증가를 확인 할 수 있었다. 이러한 과도한 염증반응에 의한 조직 손상의 결과로 산호성 백혈구의 이주 증가, Substance P 생성 증가, MIp-2 증가 등이 관찰되었다. 특히 동통 및 소양증의 신경전달물질인 substance P는 증가되어, 혈관내피의존성 혈관확장, 비만세포 탈과립의 유도, 염증세포이주 및 증식에 관여하며28), itching과 sneezing 행동을 유도하고29), 혈관 신생성 chemokine인 MIP-2 발현은 염증관여세포의 이주증가에 기여한다30).
- 이상의 결과로 형개연교탕은 과도한 산화스트레스 조절을 통해 전사인자 NF-κB 활성 억제를 통한 항염증작용으로 점막의 손상을 완화시키는 것으로 생각된다.
- 이에 반해 실험군에서의 MIP-2 양성반응(1015±31)은 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 보였는데, 영상분석 결과 83% 감소한 것으로 나타났다(Fig. 2-C).
- 이와 같이 본 실험은 알레르기 비염 유발 생쥐의 점막에서 산화스트레스에 의한 NF-κB p65, p-IKB 그리고 iNOS 양성반응의 증가를 확인 할 수 있었다.
- 한편 비강 점막내로 이주한 산호성백혈구의 수도 혈액 분석 결과와 일치하였다. 즉, 이주한 산호성백혈구의 수는 대조군은 정상군에 비해 증가한 반면, 실험군은 대조군에 비해 감소하였으며, 이러한 변화는 점막고유층에서 잘 관찰되었다(Fig. 1-B).
- 1 % OVA용액을 복강주사하여 감작시켰다. 최종 감작 7일경과 후 7일 동안 격일로 4회 0.1 % OVA용액을 대조군과 실험군의 생쥐 비강에 점적하여 알레르기 비염을 유발하였다. 유발은 콧물과 코 긁기 행동으로 확인하였다.
- 코 점막 손상이 제일 심한 지역은 코 중격에 근접한 위코선반 주변의 점막이었고, 섬모 손상, 점액이 분비된 상태의 점액분비세포의 증가, 점막고 유층내 염증관련세포의 이주 증가 등이 관찰되었다. 대조군에서 심한 손상이 대부분의 점막에서 관찰되었으나, 실험군에서는 일부 지역에서만 점막 손상이 관찰되었다(Fig.
- 한편 Angiogenic chemokine인 MIP-2 양성반응은 모세혈관주변 세포에서 관찰되었으며, 대조군(5984±148)은 정상군(214±10)에 비해 2696% 증가한 것으로 측정되었다.
- 한편 인산화된 IκB protein의 양성반응도 NFκB p65와 같은 양상으로 관찰되어 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비해 2904% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비해 63% 감소한 것으로 관찰되어 통계적으로 유의하였다(Fig. 3-B).
- 혈액내 산호성백혈구 수를 조사한 결과, 정상군에 비해 대조군에서는 그 수가 증가한 반면, 실험군에서는 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 보였다. 640 ± 57개/㎕인 정상군에 비해 대조군은 313% 증가한 2646 ± 225개/㎕로 측정되었다.
후속연구
- 본 연구를 통해 알레르기 비염을 유발한 생쥐에게 형개연교탕을 투여하여 항산화 및 항염증 효과를 살펴보아 알레르기 비염에 양호한 효과를 보임을 알 수 있었으며, 이러한 형개연교탕은 알레르기 비염의 치료 뿐만 아니라, 알레르기 비염으로 인해 유발될 수 있는 급성이나 만성 부비동염의 치료에도 응용할 수 있으리라 사료된다. 향후 이 처방이 알레르기 비염을 유발하는 면역기전에 미치는 영향에 대한 연구가 추가적으로 필요할 것으로 판단되고, 특히 알레르기 면역반응 유도의 상당부분을 담당하고 있는 Th2 cell 분화 조절에 미치는 영향에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
- 이상의 결과로 형개연교탕은 알레르기 비염의 점막손상을 완화시키고, 염증효소의 생성을 억제하여 알레르기 비염의 치료에 효과적인 약제로 판단되며, 알레르기 비염으로 유발되는 급성 및 만성 부비동염의 치료에도 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구를 통해 알레르기 비염을 유발한 생쥐에게 형개연교탕을 투여하여 항산화 및 항염증 효과를 살펴보아 알레르기 비염에 양호한 효과를 보임을 알 수 있었으며, 이러한 형개연교탕은 알레르기 비염의 치료 뿐만 아니라, 알레르기 비염으로 인해 유발될 수 있는 급성이나 만성 부비동염의 치료에도 응용할 수 있으리라 사료된다. 향후 이 처방이 알레르기 비염을 유발하는 면역기전에 미치는 영향에 대한 연구가 추가적으로 필요할 것으로 판단되고, 특히 알레르기 면역반응 유도의 상당부분을 담당하고 있는 Th2 cell 분화 조절에 미치는 영향에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
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