Listeria monocytogenes에 의해 HL-60 cell의 세포고사 유도 효과 규명 Extract of Listeria monocytogenes Induces the Apoptosis on the Human Promyelocytic Leukemia Cells, HL-60 Cells원문보기
급성 전골수구성 백혈병(acute promyelocytic leukemia, APL)은 치료제가 한정적이고 그 또한 다양한 부작용을 초래한다. 최근 암세포 형성 억제에 세균 추출물을 사용하는 경우가 증가하는데 이를 이용하여 기존의 약제보다 효과적이면서 부작용이 적은 치료제 개발이 필요하다. 본 연구에서는 L. monocytogenes에서 분비되는 물질(LmSup)과 세균 자체가 함유하고 있는 물질(LmE)을 추출하여 HL-60 세포에 처리한 다음 세포증식 억제 효과를 보고자 하였다. 세포 생존율 및 세포고사를 확인하여 세포를 죽음으로 유도하는 지 파악한 다음 작용기전을 규명하고자 세포주기의 변화 및 ROS 생성을 관찰하였다. 그 결과, LmSup와 LmE가 급성 전골수구성 백혈병(APL) 세포인 HL-60의 세포고사를 유도하고, sub G0/G1기 증가로 세포주기를 비정상적으로 차단함으로써 세포고사를 유도함을 확인하였다. 이때, ROS가 관여함을 관찰하였다. 이를 통해, LmSup 또는 LmE의 구체적인 항암효과 및 기전 분석을 통해 난치병인 APL의 치료 방법 및 치료제 개발에 기여하고자 한다.
급성 전골수구성 백혈병(acute promyelocytic leukemia, APL)은 치료제가 한정적이고 그 또한 다양한 부작용을 초래한다. 최근 암세포 형성 억제에 세균 추출물을 사용하는 경우가 증가하는데 이를 이용하여 기존의 약제보다 효과적이면서 부작용이 적은 치료제 개발이 필요하다. 본 연구에서는 L. monocytogenes에서 분비되는 물질(LmSup)과 세균 자체가 함유하고 있는 물질(LmE)을 추출하여 HL-60 세포에 처리한 다음 세포증식 억제 효과를 보고자 하였다. 세포 생존율 및 세포고사를 확인하여 세포를 죽음으로 유도하는 지 파악한 다음 작용기전을 규명하고자 세포주기의 변화 및 ROS 생성을 관찰하였다. 그 결과, LmSup와 LmE가 급성 전골수구성 백혈병(APL) 세포인 HL-60의 세포고사를 유도하고, sub G0/G1기 증가로 세포주기를 비정상적으로 차단함으로써 세포고사를 유도함을 확인하였다. 이때, ROS가 관여함을 관찰하였다. 이를 통해, LmSup 또는 LmE의 구체적인 항암효과 및 기전 분석을 통해 난치병인 APL의 치료 방법 및 치료제 개발에 기여하고자 한다.
Acute promyelocytic leukemia (APL) is a cancer of the blood and bone marrow. Although all-trans retionic acid (ATRA) is the agents for ALP therapy, there are various side effects. For overcome this problem, we need the development of new therapeutic agents for APL. A number of bacteria produce vario...
Acute promyelocytic leukemia (APL) is a cancer of the blood and bone marrow. Although all-trans retionic acid (ATRA) is the agents for ALP therapy, there are various side effects. For overcome this problem, we need the development of new therapeutic agents for APL. A number of bacteria produce various virulence factors with cytotoxic effects on human cancer cells. To understand the anti-cancer effect of Listeria monocytogenes on APL, we examined alteration of the cell viability, apoptosis and cell cycle arrest of the human promyelocytic leukemia cell line, HL-60 cells. The cell supernatant (LmSup) and the extract of L. monocytogenes (LmE) inhibited the cell viability and induced apoptosis of HL-60 cells. These cytotoxic effect of LmSup and LmE mediated by modulation of cell cycle and ROS production. These results indicate that released or included bacterial molecules from L. monocytogenes have a cytotoxicity in HL-60 cells. Therefore, LmSup and LmE may be used as the potential target for the treatment of cancer induced by HL-60 cells.
Acute promyelocytic leukemia (APL) is a cancer of the blood and bone marrow. Although all-trans retionic acid (ATRA) is the agents for ALP therapy, there are various side effects. For overcome this problem, we need the development of new therapeutic agents for APL. A number of bacteria produce various virulence factors with cytotoxic effects on human cancer cells. To understand the anti-cancer effect of Listeria monocytogenes on APL, we examined alteration of the cell viability, apoptosis and cell cycle arrest of the human promyelocytic leukemia cell line, HL-60 cells. The cell supernatant (LmSup) and the extract of L. monocytogenes (LmE) inhibited the cell viability and induced apoptosis of HL-60 cells. These cytotoxic effect of LmSup and LmE mediated by modulation of cell cycle and ROS production. These results indicate that released or included bacterial molecules from L. monocytogenes have a cytotoxicity in HL-60 cells. Therefore, LmSup and LmE may be used as the potential target for the treatment of cancer induced by HL-60 cells.
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문제 정의
monocytogenes가 분비하는 물질의 세포독성효과를 관찰하여 항암작용을 하는지 파악하고자 하였다. 또한 세포 내에도 세포의 생존 및 적응에 필요한 다양한 물질들이 존재하므로 L. monocytogenes 의 세포내 물질의 세포독성효과를 보고자하였다. 특히, L.
본 연구에서는 L. monocytogenes가 분비하는 물질과 세균의 세포 내에 존재하는 물질을 백혈병세포인 HL-60세포에 처리하여 세포증식 억제 및 세포독성 효과를 보고자 하였다. 세포억제 효과는 L.
monocytogenes가 감염된 동물은 암세포가 많이 발생되어 있어도 말초 혈액 내 림프구의 세포 독성 효과를 증가시켜서 항암효과를 보인다는 내용이다[19]. 본 연구에서는 LmSup와 LmE가 HL-60 세포의 세포고사를 유도하여 암세포를 제거하는 효과를 보였다[그림 1-5]. HL-60 세포와 마찬가지로 neuroblastoma 세포주인 Neuro-2a 세포에 L.
monocytogenes이 가지고 있는 이러한 작용기전을 이용하여 암세포에서의 치료 효과 및 기전에 대해 확인하는 연구가 부족한 실정이다. 이를 이용하여 본 연구에서는 L. monocytogenes가 분비하는 물질의 세포독성효과를 관찰하여 항암작용을 하는지 파악하고자 하였다. 또한 세포 내에도 세포의 생존 및 적응에 필요한 다양한 물질들이 존재하므로 L.
그런 ATRA를 이용한 치료는 일부 호흡 곤란, 발열, 저혈압 등을 동반하는 retinoic acid syndrome (RAS)를 유발한다[7]. 이에 본 연구에서도 human promyelocytic leukemia cell line인 HL-60 세포를 이용하여 부작용이 적은 새로운 치료제의 개발에 중점을 두고자 하였다.
제안 방법
각각의 배양시간이 지난 후, 세포를 모아 PBS에 세포를 부유시킨 다음, 세포부유액에 annexin V-FITC와 propidium iodide (PI) (BD bioscience, San Diego, CA) 를 첨가하여 실온에서 15 분간 방치한 후 염색된 세포는 CellQuest software를 이용하여 유세포 분석기(BD bioscience)를 통해 측정하였다. Annexin V-FITC가 염색된 모든 세포를 세포고사가 일어난 세포로 정의하고 각 샘플 당 총 10,000개의 세포를 분석하였다.
Cytospin이 끝나고 공기건조 시킨 후 Wright's stain 을 통해 세포 형태를 관찰하여 세포 생존율을 측정하기 위해 세포죽음이 일어난 세포수를 측정하였다.
HL-60 세포가 LmSup 및 LmE에 의해 세포고사가 유도됨을 확인하여 세포주기에도 영향을 미치는 지 확인하였다. M, G1, S, G2기로 구성된 세포주기 중 subG0/G1기가 증가하면 cell cycle arrest가 진행된 것으로 보여지는데 [그림 3]에서 보이는 것과 같이 LmSup와 LmE를 처리하였을 때, subG0/G1기가 급격히 증가함을 관찰하였다.
HL-60 세포에 LmSup 및 LmE를 각각 24 시간, 48시간 동안 처리하고 morphology test, trypan blue exclusion test로 세포 생존율을 측정하였다. 세포죽음을 세포의 형태 변화로 관찰한 결과에서 HL-60 세포의 생존율이 LmE에 의해 유의하게 감소하는 것을 보였다.
Hl-60 세포가 LmSup와 LmE에 의한 죽음이 세포고사인지를 파악하기 위해 앞의 방법과 동일하게 HL-60 세포에 LmSup와 LmE를 각각 24 시간, 48시간 동안 처리하고 annexin-V와 PI 염색을 시행하였다. Annexin-V는 phosphatidyl serin (PS)에 결합하는 물질로 PS는 세포 고사 초기에 세포막에 발현되는 단백질이다.
LmSup와 LmE에 의해 유도되는 HL-60 세포의 세포고사가 ROS 발생과 관계가 있는지 파악하고자 세포에 각각의 물질을 처리한 다음 DCFDA stain을 실시하여 유세포 분석기로 측정하였다. 그 결과, LmSup와 LmE에 의해 HL-60 세포 내 ROS 생산이 급격히 증가함을 보였다[그림 4].
형광 세기는 유세포분석기(BD Biosciences)를 이용하여 측정하였다. ROS 생성량의 비교 및 통계처리를 위해 LmSup 또는 LmE를 처리하지 않은 대조군(Con)의 형광세기를 1로 설정하고 각 실험군의 결과는 대조군의 형광세기에 비해 증가하는 형광세기를 나타내기 위해 실험군의 형광 세기/대조군의 형광세기 비로 표현하였다.
그 후 유세포 분석기를 통해 측정하였다. sub G0/G1기의 세포 수를 측정하여 세포주기를 파악하였다. Sub G0/G1기의 세포를 세포고사가 진행된 것으로 정의하고 각 샘플 당 총 10,000개의 세포를 분석하였다.
각각의 배양 시간이 지난 다음, MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra zolium bromide) solution을 10 μl 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간을 배양하고 100 μl의 solubilization solution을 추가로 첨가하였다.
각각의 배양시간이 지난 다음 세포를 모아 5 × 104 cells/200μl의 농도 PBS에 부유시켜 cytospin을 시행하였다.
대조군으로는 아무처리도 하지 않고 HL-60 세포를 각각 24시간, 48시간 배양하였다. 각각의 배양시간이 지난 후, 세포를 모아 PBS에 세포를 부유시킨 다음, 세포부유액에 annexin V-FITC와 propidium iodide (PI) (BD bioscience, San Diego, CA) 를 첨가하여 실온에서 15 분간 방치한 후 염색된 세포는 CellQuest software를 이용하여 유세포 분석기(BD bioscience)를 통해 측정하였다. Annexin V-FITC가 염색된 모든 세포를 세포고사가 일어난 세포로 정의하고 각 샘플 당 총 10,000개의 세포를 분석하였다.
세척한 세포는 다시 DPBS 에 부유시켜 PI를 처리하여 15분간 염색하였다. 그 후 유세포 분석기를 통해 측정하였다. sub G0/G1기의 세포 수를 측정하여 세포주기를 파악하였다.
[그림1B]는 trypan blue exclusion test를 이용하여 세포 생존율을 측정한 것으로 LmSup와 LmE에서 모두 유의성 있게 HL-60 세포의 생존율이 감소함을 보였고, 처리 시간이 길어짐에 따라 세포생존율도 더 많이 감소하였다. 그다음 MTT assay를 이용하여 HL-60 세포의 생존율을 측정한 다음 LmSup 및 LmE 각각의 세포독성 효과를 관찰하였다[그림 1C]. [그림 1A][그림 1B]와 마찬가지로 LmSup와 LmE 물질 처리 후에는 세포 독성효과가 현저히 증가함을 관찰하였다.
monocytogenes 추출물(LmE)을 각각 5 μg/ml로 처리하여 24시간, 48시간 배양하였다. 대조군으로는 아무처리도 하지 않고 HL-60 세포를 각각 24시간, 48시간 배양하였다. 각각의 배양시간이 지난 다음 세포를 모아 5 × 104 cells/200μl의 농도 PBS에 부유시켜 cytospin을 시행하였다.
monocytogenes의 세포 외내 물질을 각각 시간별로 처리하여 세포 생존율 및 세포고사를 확인하였고 동시에 세포주기의 변화를 관찰하였다. 또한 ROS 생성여부를 확인하였다.
또한 세균이 함유하고 있는 물질들을 얻기 위해 배양된 세균을 모은 다음 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)에 부유시킨 다음 50~60%의 진폭을 설정하여 30초간 sonication한 다음 1분 동안 얼음에서 방치하고, 이 과정을 5번 반복하였다.
물질 처리에 따른 세포 형태변화를 관찰하기위해 1 ×106 cells/ml의 농도의 세포에 L. monocytogenes 배양상층액(LmSup)과 L. monocytogenes 추출물(LmE)을 각각 5 μg/ml로 처리하여 24시간, 48시간 배양하였다.
대조군으로는 아무처리도 하지 않고 HL-60 세포를 각각 24시간, 48시간 배양하였다. 배양 후 세포를 모아 세포 부유액을 만들고, 세포부유액과 trypan blue 염색액과 동량으로 희석하여 hemocytometer를 이용하여 세포수를 계측하였다. 살아 있는 세포는 세포질이 투명하게 보일 것이고, 반면, 죽은 세포는 trypan blue 염색약이 흡수되어 파란색으로 보일 것이다.
세포 독성을 확인하기 위해 MTT assay kit (Roche, Penzberg, Germany)를 이용하여 HL-60 세포의 생존율을 측정하였다. 세포는 1 × 105 cells/50 μl의 농도로 부유하여 96 well plate에 분주하여 LmSup, LmE를 5 μg/ml로 첨가하여 24 시간, 48 시간 동안 처리하였다.
세포고사를 파악하기 위해 1 × 106 cells/ml의 농도의 세포에 LmSup과 LmE을 각각 5 μg/ml로 처리하여 24시간, 48시간 배양하였다.
세포는 1 × 105 cells/100 μl의 농도로 배양액에 부유한 하여 96 well plate에 분주한 다음 LmSup과 LmE를 각각 5 μg/ml의 농도로 첨가하여 24시간, 48시간 동안 처리하였다.
세포는 1 × 105 cells/50 μl의 농도로 부유하여 96 well plate에 분주하여 LmSup, LmE를 5 μg/ml로 첨가하여 24 시간, 48 시간 동안 처리하였다.
monocytogenes가 분비하는 물질과 세균의 세포 내에 존재하는 물질을 백혈병세포인 HL-60세포에 처리하여 세포증식 억제 및 세포독성 효과를 보고자 하였다. 세포억제 효과는 L. monocytogenes의 세포 외내 물질을 각각 시간별로 처리하여 세포 생존율 및 세포고사를 확인하였고 동시에 세포주기의 변화를 관찰하였다. 또한 ROS 생성여부를 확인하였다.
세포주기의 변화를 관찰하기 위해 1 × 106 c ells/ml의 농도의 세포에 LmSup과 LmE을 각각 5 μg/ml로 처리하여 24시간, 48시간 배양하였다.
Annexin-V 가 염색된 모든 세포는 세포고사가 진행된 세포로 정의한다. 염색된 세포는 유세포 분석기를 통해 측정하였다. [그림 2]에 나타난 바와 같이 LmSup와 LmE에 의한 HL-60 세포의 죽음은 세포고사에 의한 것으로 확인되었고 세포고사의 초기 및 후기단계에서 모두 영향을 주었다.
세포고사가 진행된 세포는 cell membrane blebbing과 염색체 응축 및 apoptotic body를 관찰할 수 있다. 전체 세포 수에서 세포고사의 특징을 보이는 세포수의 비율을 세포 생존율로 표현하였다.
DCF-DA(dichlorofluorescein diacetate)가 세포내로 들어가게 되면 가수분해반응에 의해 2′,7′-dihydrodichlorofluorescein (DCF-H)로 전환이 되고, 이 물질은 ROS가 발생하는 곳에서 형광빛을 발하는 DCF (dichlorofluorescein)로 산화반응이 일어난다. 형광 세기는 유세포분석기(BD Biosciences)를 이용하여 측정하였다. ROS 생성량의 비교 및 통계처리를 위해 LmSup 또는 LmE를 처리하지 않은 대조군(Con)의 형광세기를 1로 설정하고 각 실험군의 결과는 대조군의 형광세기에 비해 증가하는 형광세기를 나타내기 위해 실험군의 형광 세기/대조군의 형광세기 비로 표현하였다.
대상 데이터
sub G0/G1기의 세포 수를 측정하여 세포주기를 파악하였다. Sub G0/G1기의 세포를 세포고사가 진행된 것으로 정의하고 각 샘플 당 총 10,000개의 세포를 분석하였다.
각 대조 군과 실험군 사이의 통계학적의 유의성은 SPSS statistical software package (Version 10.0, Chicago, IL) 을 이용하여 student’s t-test로 분석하였고 p value가 0.05 이하면 통계학적인 유의성이 있다고 판단하였다.
이론/모형
그 다음 3000 rpm, 10 min 동안 원삼분리하여 상층액을 모아 실험에 사용하기 전까지 4℃에 보관하였다. 상층액 및 추출물은 Lowry assay를 통해 단백질을 정량하였다.
세포 생존율은 측정하기 위해 trypan blue exclusion test를 실시하였다. 세포는 1 × 105 cells/100 μl의 농도로 배양액에 부유한 하여 96 well plate에 분주한 다음 LmSup과 LmE를 각각 5 μg/ml의 농도로 첨가하여 24시간, 48시간 동안 처리하였다.
성능/효과
[그림 2]에 나타난 바와 같이 LmSup와 LmE에 의한 HL-60 세포의 죽음은 세포고사에 의한 것으로 확인되었고 세포고사의 초기 및 후기단계에서 모두 영향을 주었다. LmE 처리 시에 24 시간, 48 시간 처리한 결과가 모두 유의성 있게 나타난 반면 LmSup 처리 시에는 48시간까지 방치해야 세포고사의 유도가 유의성 있게 증가함을 관찰할 수 있었다. 본 결과를 통해 LmE의 세포고사 유도 효과가 LmSup보다 증가함을 알 수 있었다.
HL-60 세포가 LmSup 및 LmE에 의해 세포고사가 유도됨을 확인하여 세포주기에도 영향을 미치는 지 확인하였다. M, G1, S, G2기로 구성된 세포주기 중 subG0/G1기가 증가하면 cell cycle arrest가 진행된 것으로 보여지는데 [그림 3]에서 보이는 것과 같이 LmSup와 LmE를 처리하였을 때, subG0/G1기가 급격히 증가함을 관찰하였다.
LmSup와 LmE에 의해 유도되는 HL-60 세포의 세포고사가 ROS 발생과 관계가 있는지 파악하고자 세포에 각각의 물질을 처리한 다음 DCFDA stain을 실시하여 유세포 분석기로 측정하였다. 그 결과, LmSup와 LmE에 의해 HL-60 세포 내 ROS 생산이 급격히 증가함을 보였다[그림 4].
본 결과들은 종합하면, L. monocytogenes의 분비물 및 추출물이 ROS를 발생시켜 HL-60 세포의 세포주기를 억제하고 세포고사를 유도하여 암세포 제거 효과를 관찰하였다. 그러나 HL-60 세포에서 보여주는 L.
LmE 처리 시에 24 시간, 48 시간 처리한 결과가 모두 유의성 있게 나타난 반면 LmSup 처리 시에는 48시간까지 방치해야 세포고사의 유도가 유의성 있게 증가함을 관찰할 수 있었다. 본 결과를 통해 LmE의 세포고사 유도 효과가 LmSup보다 증가함을 알 수 있었다.
본 연구에서, LmSup와 LmE가 급성 전골수구성 백혈병(APL) 세포인 HL-60 세포의 세포고사를 유도하고[그림 1][그림 2], 세포주기를 비정상적으로 차단함을 확인하였다[그림 3]. 이때, ROS가 관여함을 관찰하였다[그림 4].
HL-60 세포에 LmSup 및 LmE를 각각 24 시간, 48시간 동안 처리하고 morphology test, trypan blue exclusion test로 세포 생존율을 측정하였다. 세포죽음을 세포의 형태 변화로 관찰한 결과에서 HL-60 세포의 생존율이 LmE에 의해 유의하게 감소하는 것을 보였다. 이때, LmSup에 의한 세포 생존을은 미약하게 감소하는 경향은 보이나 유의성은 보이지 않았다[그림 1A].
후속연구
monocytogenes의 물질들의 세포고사 기전을 완전히 밝혀 내지는 못했다. 앞으로 LmSup 또는 LmE의 구체적인 항암효과 및 기전 분석을 통해 난치병인 APL의 치료 방법 및 치료제 개발에 기여하고자 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
암세포에 대한 항암효과를 보고자 한다면 어떻게 하는가?
암세포에 대한 항암효과를 보고자 한다면 우선 치료후보물질을 처리한 다음 세포 죽음이 유발되는지 관찰하면 암세포에 대한 특이적인 세포독성이 있음을 알 수 있다[8-10]. 세포는 수명이 다하면 세포고사를 거쳐 제거되는데, 이 때 다양한 세포내 신호전달 단백질이 관여한다.
급성 전골수구성 백혈병의 치료시 단점은 무엇인가?
급성 전골수구성 백혈병(acute promyelocytic leukemia, APL)은 치료제가 한정적이고 그 또한 다양한 부작용을 초래한다. 최근 암세포 형성 억제에 세균 추출물을 사용하는 경우가 증가하는데 이를 이용하여 기존의 약제보다 효과적이면서 부작용이 적은 치료제 개발이 필요하다.
새로운 치료제 개발에 세균을 사용하는 경우의 특징은?
그러나 다양한 부작용으로 인해 새로운 치료제 개발에 세균을 사용하는 경우가 증가하고 있다. 다만, 다양한 세균의 종류에 따라, 암세포의 종류에 따라 항암효과를 보이거나 오히려 사람에게 독성을 보이는 경우가 있다. 이렇게 세균 사용에 따른 부작용을 없애고 세균들이 가지고 있거나 외부로 분비하는 물질 중에 항암효과를 보이는 물질을 개발하는 연구에 많은 관심이 집중되고 있다[2].
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