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문제 정의
- 본 연구는 이처럼 친환경적이며 여러 분야에 다양한 용도로 사용될 수 있는 생물 계면활성제를 산업적으로 활용하기 위한 연구의 일환으로, 자연계에서 분리하여 생물 계면활성제 생성이 우수한 것으로 확인된 Pseudomonas sp. G314가 생산하는 계면활성제를 정제하고 이에 대한 특성을 파악하여 추후 이를 상업적으로 활용하고자 하였다.
제안 방법
- 채취한 시료는 원심분리기(supra22K, Hanil Science, Korea)로 원심분리(13,000× g, 10분)하여 균체를 제거한 후, Surface Tensiometer(CBVP-A3, FACE, Japan)를 사용하여 plate 방법[3]으로 25℃에서 3회 반복하여 표면장력을 측정하였다.
- 생물 계면활성제의 성분을 조사하기 위해, 용매추출을 통하여 얻어진 부분 정제된 시료를 소량의 methylene chloride:methanol:acetic acid (7:1:1% (v/v))의 혼합용매에 용해시킨 후 동일 용매로 평형화 된 silica gel 60 (Merck Co., mesh 230-400) column (2.5 cm × 30 cm)에 흡착시켜 용출시켰다.
- LB 영양배지에서 OD600=1.0까지 전 배양한 균주 5 ml을 500 ml LB 배지에 접종한 후 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하며 배양시간에 따라 시료를 일정량 채취하였다. 채취한 시료는 원심분리기(supra22K, Hanil Science, Korea)로 원심분리(13,000× g, 10분)하여 균체를 제거한 후, Surface Tensiometer(CBVP-A3, FACE, Japan)를 사용하여 plate 방법[3]으로 25℃에서 3회 반복하여 표면장력을 측정하였다.
- 선별 균주가 생산하는 생물학적 계면활성제를 추후 대량으로 확보할 수 있는지를 확인하기 위한 예비실험으로 5 l의 발효기(KF-5L, 한국발효기, Korea)에 2 l의 배지를 첨가하여 배양하였다. 이때 배지는 LB broth를 이용하였으며 30℃, 400 rpm, 1:1 vvm (2 NV/min)의 조건에서 실험하였다.
- pH를 조정한 상등액을 동량의 chloroform:methanol (2:1)을 가하여 저어주면서 4℃에서 하룻밤 방치하여 추출하였다. 그 후 분액깔대기를 통하여 유기 용매층 만을 회수하여 Rotary Vacuum Evaporator (N-N series, Eyela, Japan)로 농축하고, 이를 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0)에 용해시킨 후 동결건조기(Freezone 4.5, Labconco, USA)를 이용하여 분말 상태로 만들었다. 이와 같이 부분 정제된 생물 계면활성제는 냉장 보관하며 다음 실험에 사용하였다.
- 또 TLC상에서 발견된 spot의 생화학 반응은 당의 발색시약으로는 Bial’s reagent (orcinol-ferric chloride), 아미노산의 발색시약으로 ninhydrin, 단백질 발색시약으로 pyridine, 그리고 지질의 발색시약으로 rhodamin 6G를 이용하여 분석하였다.
- 그리고 용출된 분획 중 표면장력 활성이 가장 우수한 분획을 silica gel G F254 plate (Merck, Germany, 20 cm × 20 cm)를 이용하여 thin layer chromatography (TLC) 전개 실험을 실시하였다. 이때 전개 용매로는 methylene chloride:methanol:acetic acid (7:1:1%), methylene chloride:methanol:ammonia water (100:10:1), chloroform:methanol:H2O(65:25:4), chloroform:methanol:acetic acid (65:25:4), chloroform:methanol:5 M NH4OH (65:30:5), hexane:isopropyl alcohol:methanol (70:35:15), chloroform:aceton:methanol:acetic acid:H2O (7:8:2:2:1) 등 다양한 용매 조합으로 전개를 실시한 후, 분리 상태가 가장 우수하게 나타난 methylene chloride:methanol:acetic acid (7:1:1% (v/v))의 조건으로 모든 실험을 실시하였다. 그리고 TLC plate 상에서 전개된 spot은 UV lamp (VL-6, vilber, EEC)로 254 nm와 365 nm의 파장으로 확인하였다.
- Shim과 Park [23]은 유류로 오염된 토양에서 생물 계면활성제 생산능력이 우수한 균주인 Psudomonas sp. G314를 분리하고 이 균주의 특성을 조사하였다. Shim과 Park [23]이 분리한 Pseudomonas sp.
- G314가 생산하는 생물 계면활성제의 정확한 성분을 파악하기 위해 용매로 추출한 갈색 분말상태의 생물 계면활성제를 methylene chloride:methanol:acetic acid(7:1:1%)로 용해시켜 동일 용매로 평형화 된 silica gel column(2.5 cm × 30 cm)에 흡착시킨 후 동일 용매로 1 ml/min의 속도로 용출하며 각각 40 ml씩의 분획을 획득하였다(Fig. 4).
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자동 발효기를 이용한 계면활성제 생산
생물 계면활성제의 대량 생산가능성을 타진하기 위해 5 l 발효조에 2 l 배양액을 첨가하여 배양하며 시간에 따라 변화하는 표면장력 값을 조사하였다(Fig. 2). 이때 발효조는 30℃, 400 rpm, 1:1 vvm (2 NV/min)으로 조건을 설정하여 배지 내 용존산소가 충분하도록 하였다.
- 그리고 Shim과 Park [23] 논문에서 Pseudomonas sp. G314가 생산하는 생물 계면활성제는 acetone과 methanol 등에서 잘 용해되고 benzene과 toluene에서는 소량 용해되며 hexane 등에서는 전혀 용해되지 않아, 지금까지 알려진 glycolipid와는 달리 surfactin과 rhamnolipid와 비슷한 양상을 나타내는 새로운 종류의 glycolipid 인 것으로 추정하였다.
- 또 silica gel G F254 plate (Merck, Germany)로 TLC를 전개하여 부분 정제된 갈색분말 형태의 생물 계면활성제와 silica gel로 용출한 시료의 각 단계별 시료의 성분을 분석하였다. 이때 전개용매는 예비실험을 통해 가장 전개능력이 우수한 것으로 확인된 methylene chloride:methanol:acetic acid(7:1:1% (v/v))의 조건으로 실험을 진행하고, 254 nm와 365 nm의 두 종류 파장에서 전개된 spot을 확인하고 Rf 값을 계산하였다.
- 또 silica gel G F254 plate (Merck, Germany)로 TLC를 전개하여 부분 정제된 갈색분말 형태의 생물 계면활성제와 silica gel로 용출한 시료의 각 단계별 시료의 성분을 분석하였다. 이때 전개용매는 예비실험을 통해 가장 전개능력이 우수한 것으로 확인된 methylene chloride:methanol:acetic acid(7:1:1% (v/v))의 조건으로 실험을 진행하고, 254 nm와 365 nm의 두 종류 파장에서 전개된 spot을 확인하고 Rf 값을 계산하였다. 그 결과 부분 정제된 갈색의 분말은 365 nm에서는 spot이 총 6개로 각각의 Rf 값이 각각 0.
- 그리고 용출된 분획 중 표면장력 활성이 가장 우수한 분획을 silica gel G F254 plate (Merck, Germany, 20 cm × 20 cm)를 이용하여 thin layer chromatography (TLC) 전개 실험을 실시하였다.
대상 데이터
- Shim과 Park [23]의 논문에서 보고된 대전일원의 유류오염 지역의 토양에서 분리한 생물 계면활성제 생성이 우수한 Pseudomonas sp. G314균주를 균주 배양에 가장 많이 이용되는 Luria-Bertani (LB)배지(tryptone 10 g/l, yeast extract 5 g/l, sodium chloride 5 g/l, pH 7.0)에서 배양하며 본 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 그리고 표면장력이 최대일 때 균체를 제거한 배양액의 계면활성제 활성 유지 정도를 확인하기 위해 일정량씩 분주해, 하나는 상온보관하고 다른 하나는 4℃에서 보관하면서 일정 시간 간격으로 계면활성제의 표면장력 측정한 결과(Fig. 2), 상온과 냉장 보관한 시료 모두 3일 동안 25 dyne/cm를 유지하였고, 4일 이후에도 비슷한 표면장력을 유지하여 10일 경과 후 상온 보관은 26.2±0.2 dyne/cm, 냉장 보관은 25.8 dyne/cm의 표면장력을 나타내 상온보관과 냉장보관의 차이가 거의 없는 것으로 확인되었다.
- Shim과 Park [23]이 분리한 Pseudomonas sp. G314가 생성하는 생물 계면활성제의 표면장력은 Pseudomonas fluorescens [6]와 Bacillus licheniformis [13], Bacillus subtilis [18]가 생산하는 27 dyne/cm, Pseudomonas aeruginosa [11]가 생산하는 25-30 dyne/cm, Ustilago maydis[5]와 Corynebacterium lepus [4]이 생산하는 30 dyne/cm 보다 우수하고, critical micelle concentration (CMC) 값도 20 mg/l를 나타내, 지금까지 연구된 다른 생물 계면활성제에 비해 표면 장력 활성이 매우 우수한 것으로 확인되었다(Table 1). 또 온도에 대한 안정성, pH에 의한 생육 안정성 등 여러 가지 특성도 뛰어나 오염된 토양이나, 담수 그리고 해수에 적용시켜 환경정화에 사용하기에 적합한 균주 임을 확인되었다.
- G314가 생성하는 생물 계면활성제의 표면장력은 Pseudomonas fluorescens [6]와 Bacillus licheniformis [13], Bacillus subtilis [18]가 생산하는 27 dyne/cm, Pseudomonas aeruginosa [11]가 생산하는 25-30 dyne/cm, Ustilago maydis[5]와 Corynebacterium lepus [4]이 생산하는 30 dyne/cm 보다 우수하고, critical micelle concentration (CMC) 값도 20 mg/l를 나타내, 지금까지 연구된 다른 생물 계면활성제에 비해 표면 장력 활성이 매우 우수한 것으로 확인되었다(Table 1). 또 온도에 대한 안정성, pH에 의한 생육 안정성 등 여러 가지 특성도 뛰어나 오염된 토양이나, 담수 그리고 해수에 적용시켜 환경정화에 사용하기에 적합한 균주 임을 확인되었다. 뿐만 아니라 추후 본 실험에 사용된 LB배지 대신 계면활성제 생성을 증가할 수 있는 적합한 배지를 개발한다면 더욱 많은 량의 계면활성제를 생성할 수 있을 것으로 생각된다.
- 이때 발효조는 30℃, 400 rpm, 1:1 vvm (2 NV/min)으로 조건을 설정하여 배지 내 용존산소가 충분하도록 하였다. 그 결과 회분배양으로 배양했을 경우 배양 3시간 후에 25 dyne/cm의 표면장력 활성을 나타냈으나[23], 5 l를 발효조에서 배양했을 때는 배양 6시간 후에 30 dyne/cm의 표면장력 활성이 나타났고 그 후 27 dyne/cm까지 표면장력이 감소하여 회분배양 보다 표면장력활성이 약간 감소함을 확인하였다. 그러나 최대감소 표면장력 값에 도달한 후에는 회분 배양과 같이 그 값이 계속 유지되어 Pseudomonas sp.
- 4). 용출된 분획은 각각 감압 농축하여 0.2 M phosphate buffer(pH 7.0)로 용해시켜 각 분획에 대한 표면장력을 측정한 결과, 분획시료 2, 3, 4번에 표면장력 활성이 있는 것으로 나타났으며, 특히 3번 분획시료의 표면장력이 28 dyne/cm을 나타내 분획시료 중 가장 표면장력활성이 우수한 분획임을 확인하였다.
- 이때 전개용매는 예비실험을 통해 가장 전개능력이 우수한 것으로 확인된 methylene chloride:methanol:acetic acid(7:1:1% (v/v))의 조건으로 실험을 진행하고, 254 nm와 365 nm의 두 종류 파장에서 전개된 spot을 확인하고 Rf 값을 계산하였다. 그 결과 부분 정제된 갈색의 분말은 365 nm에서는 spot이 총 6개로 각각의 Rf 값이 각각 0.4, 0.48, 0.57, 0.84, 0.89로 나타났고(Fig. 5A), 254 nm에서는 spot이 5개로 Rf 값은 각각 0.4, 0.52, 0.58, 0.68, 0.76로 나타났다(Fig. 5B). 그리고 silica gel column chromatography를 통해 얻은 분획시료 중 최대감소 표면장력을 나타낸 2번, 3번, 4번 분획을 각각 TLC plate를 이용하여 전개한 결과(Fig.
- 5B). 그리고 silica gel column chromatography를 통해 얻은 분획시료 중 최대감소 표면장력을 나타낸 2번, 3번, 4번 분획을 각각 TLC plate를 이용하여 전개한 결과(Fig. 6), 표면장력 활성이 있는 3개의 분획시료 모두에서 공통적인 spot이 확인되었고, 그 Rf 값은 0.58로 나타났다. 그러나 최대감소 표면장력이 나타났던 3번째 분획시료도 TLC로 전개해 본 결과 단일 spot이 아닌, 3 종류의 spot을 가지고 있는 것으로 확인되어 순수하게 정제되지 않았음을 알 수 있었다.
- 58로 나타났다. 그러나 최대감소 표면장력이 나타났던 3번째 분획시료도 TLC로 전개해 본 결과 단일 spot이 아닌, 3 종류의 spot을 가지고 있는 것으로 확인되어 순수하게 정제되지 않았음을 알 수 있었다.
- 그리고 TLC 상에서 전개한 얻어진 부분 정제된 시료들을 탄수화물, 지질, 단백질을 검출할 수 있는 여러 종류의 coupling reagent를 이용하여 발색반응을 실시한 결과, 탄수화물의 발색을 나타내는 Bial's reagent와 지질을 발색하는 rhodamine 6G에서 양성 반응을 나타내어 Pseudomonas sp. G314가 생산하는 생물 계면활성제는 당과 지질이 함유된 glycolipid계의 물질임을 확인하였다(Table 2). 더구나 Bial's reagent는 탄수화물을 노란색으로 발색하는데 그 Rf 값이 0.
- 따라서 silica gel column chromatography를 통해 정제된 물질이 순수하게 정제된 물질이 아니지만, 주된 spot의 Rf 값과 발색시약 결과로 볼 때 Pseudomonas sp. G314가 생산하는 생물 계면활성제는 glycolipid 종류임을 확인하였다.
- 이상의 결과 Pseudomonas sp. G314가 생산하는 생물 계면활성제는 지금까지 연구된 생물 계면활성제에 비해 표면장력 활성이 매우 우수하고, 온도와 pH 안정성 등 여러 특성이 뛰어나 화학합성계면활성제의 대체 물질로서 사용하기에 적절하다고 사료된다.
후속연구
- 또 온도에 대한 안정성, pH에 의한 생육 안정성 등 여러 가지 특성도 뛰어나 오염된 토양이나, 담수 그리고 해수에 적용시켜 환경정화에 사용하기에 적합한 균주 임을 확인되었다. 뿐만 아니라 추후 본 실험에 사용된 LB배지 대신 계면활성제 생성을 증가할 수 있는 적합한 배지를 개발한다면 더욱 많은 량의 계면활성제를 생성할 수 있을 것으로 생각된다.
- G314가 생산하는 생물 계면활성제는 지금까지 연구된 생물 계면활성제에 비해 표면장력 활성이 매우 우수하고, 온도와 pH 안정성 등 여러 특성이 뛰어나 화학합성계면활성제의 대체 물질로서 사용하기에 적절하다고 사료된다. 그러나 대량 생산 및 상품화 하기 위해서는 친수성인 당의 종류와 소수성인 지방의 결합양상, 전체 분자량의 측정 등 세부적인 연구가 추후 진행되어야 할 것이다.
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