[논문]삼출건비탕의 추출용매에 따른 성분 함량 및 효능 비교 연구

진성은; 서창섭; 하혜경; 임혜선; 김예지; 전우영; 유새롬; 김정훈; 신인식; 김성실; 신나라; 이미영; 정수진; 김온순; 신현규

삼출건비탕의 추출용매에 따른 성분 함량 및 효능 비교 연구
Comparative Study on Biological Activities and Ingredient Contents of Different Solvent Extracts of Samchulkunbi-tang 원문보기

생약학회지, v.43 no.4 = no.171, 2012년, pp.328 - 337

Abstract ▼ AI-Helper

In order to investigate anti-inflammatory, anti-allergic and anti-obesity activities of Samchulkunbi-tang (SCT; Shen zhu jian pi-tang) water and 70% ethanol (EtOH) extracts, in vitro inhibitory activities against nitric oxide (NO), prostaglandin $E_2$ $PGE_2$), interleukin (IL)-6 and tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$ production in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells, and macrophage-derived chemokine (MDC/CCL22) and regulated on activation of normal T-cell-expressed and -secreted (RANTES/CCL5) production in TNF-${\alpha}$/interferon-${\gamma}$-stimulated HaCaT and BEAS-2B cells as well as glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) activity and leptin production in 3T3-L1 cells were determined. A HPLC was used for quantification of the seven marker components (albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, naringin, hesperidin, poncirin and glycyrrhizin) of SCT water and 70% EtOH extracts. SCT showed inhibitory effects against MDC and RANTES production in HaCaT cells, as well as RANTES production in BEAS-2B cells. In addition, SCT reduced not only NO, $PGE_2$, IL-6 and TNF-${\alpha}$ production in RAW 264.7 cells, but also GPDH activity and leptin production in 3T3-L1 cells. Furthermore, the biological activities and the contents of six compounds (except paeoniflorin) were higher in 70% EtOH extract than water extract. These results suggest that SCT has anti-inflammatory, anti-allergic and anti-obesity activities. These efficacies of 70% EtOH extract are relatively higher than that of water extract.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

²³⁾ Th2-type chemokine에 속하는 MDC/CCL22와 Th1-type chemokine 인 RANTES/CCL5는 아토피 피부염과 같은 염증성 알러지 질환에 관여하며, HaCaT 세포에서 TNF-α와 IFN-γ로 자극했을 때 분비량이 증가한다.^24-27) 이에 본 연구에서는 HaCaT 세포를 이용하여 MDC와 RANTES의 생성에 대한 삼출건 비탕의 억제효과를 조사함으로써 항아토피 효능을 평가하였다. TNF-α/IFN-γ 처리로 인해 증가한 MDC 및 RANTES 분비가 물 추출물에 의해 유의적으로 억제되었지만, 70% EtOH 추출물이 물 추출물보다 더 낮은 농도에서 높은 억제율을 나타내었다.
이에 본 연구에서는 다양한 성분을 함유한 삼출건비탕의 추출 용매에 따른 이화학적 성분 및 약리학적 효능을 비교 평가하기 위하여 삼출건비탕을 물 또는 70% EtOH로 추출한 추출물을 대상으로 high performance liquid chromatography(HPLC)법을 이용한 주요성분 동시분석과 염증, 알러지, 비만에 대한 in vitro 약리활성 평가를 실시하였다.

제안 방법

18시간 배양 후 serum-free DMEM으로 교체하고, 삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물과 TNF-α (10 ng/mL)를 동시에 처리하여 24시간 동안 배양하고 상등액을 수집하였다.
18시간 배양후 serum-free DMEM으로 배지를 교체하고, 삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물과 TNF-α 및 IFN-γ (각각 10 ng/mL)를 동시에 처리하여 24시간 동안 배양하고 상등액을 수집하였다.
28) 따라서 본 연구에서 TNF-α로 자극시킨 BEAS-2B 세포에서 RANTES 분비에 대한 삼출건비탕의 억제 활성을 측정하여 항천식 효능을 평가하였다.
3T3-L1 preadipocytes는 96 well plate에 5×104 cells씩 분주한 후, 삼출건비탕 물 추출물과 70% EtOH 추출물을 농도별로 처리하여 상기 방법으로 8 일간 분화를 유도하였다.
3T3-L1 세포에서의 Leptin 분비량 및 GPDH 활성 측정 −3T3-L1 preadipocytes를 48 well plate에 1×105 cells/well씩 분주한 후, 삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물을 농도별로 처리하고 상기 방법으로 8일간 분화를 유도하였다.
BEAS-2B 및 RAW 264.7 세포는 각각 10% 및 5.5% FBS와 penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 μg/mL)이 포함된 DMEM을 사용하고, 3T3-L1 preadipocytes는 10% NCS가 포함된 DMEM을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
cells/well씩 분주한 후, 삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물을 농도별로 처리하고 상기 방법으로 8일간 분화를 유도하였다. ELISA kit를 이용하여 제조사의 방법에 따라 배양 상등액 내에 존재하는 leptin의 분비량을 측정하였으며, GPDH 활성을 측정하기 위해 세포를 수집하여 PBS로 세척한 후 enzyme extract buffer를 첨가하여 원심분리 하였다. 상등액을 수거하여 β-mercaptoethanol이 포함된 dilution buffer로 희석하고 30℃에서 기질과 반응시키는 20분 동안 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
5×10⁵ cells/well씩 분주하여 18 시간 배양한 후 삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물을 농도별로 처리하고 동시에 LPS (1 μg/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. Griess reagent를 이용하여 제조사의 방법에 따라 배양 상등액 내에 존재하는 nitrite의 분비량을 측정하였으며, 양성 대조군으로 nitric oxide synthase (NOS) inhibitor 인 N^G-methyl-L-arginine (L-NMMA)을 사용하였다. 상등액 내의 PGE₂, IL-6 및 TNF-α 분비량을 측정하기 위해 ELISA kit를 사용하여 각 제조사의 방법에 따라 측정하였으며, PGE₂ 억제에 대한 양성 대조군으로 indomethacin을 사용하였다.
HaCaT 세포에서의 항아토피 효능 −삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물의 항아토피 효능을 비교 평가하기 위하여 각 추출물과 TNF-α/IFN-γ (각 10 ng/mL, TI)를 동시 처리한 HaCaT 세포에서 아토피성 피부염과 관련된 chemokine인 MDC 및 RANTES 분비억제효과를 검색하였다.
18시간 배양후 serum-free DMEM으로 배지를 교체하고, 삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물과 TNF-α 및 IFN-γ (각각 10 ng/mL)를 동시에 처리하여 24시간 동안 배양하고 상등액을 수집하였다. Human-MDC/CCL22 및 human-RANTES/ CCL5 ELISA kit를 이용하여 제조사의 방법에 따라 상등액 내에 존재하는 MDC 및 RANTES의 분비량을 측정하였다.
18시간 배양 후 serum-free DMEM으로 교체하고, 삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물과 TNF-α (10 ng/mL)를 동시에 처리하여 24시간 동안 배양하고 상등액을 수집하였다. Human-RANTES/CCL5 ELISA kit를 이용하여 제조사의 방법에 따라 상등액 내에 존재하는 RANTES의 분비량을 측정하였다.
0% acetic acid가 함유된 acetonitrile을 기울기 용매 조건으로 하여 35분 이내에 분리하였다. PDA 검출 파장은 230 nm에서 albiflorin과 paoniflorin, 254 nm에서 glycyrrhizin 및 280 nm에서 naringin, hesperidin, poncirin 및 liquititin을 각각 검출하였다. 검액에서의 peak는 주요 성분 peak의 retention time과 UV 흡수 파장을 비교하여 확인하였으며, 7종의 성분은 8.
RAW 264.7 세포에서의 Nitric oxide (NO) 및 PGE2, IL-6, TNF-α 분비량 측정 − RAW 264.7 세포를 48 well plate에 2.5×105 cells/well씩 분주하여 18 시간 배양한 후 삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물을 농도별로 처리하고 동시에 LPS (1 μg/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
RAW 264.7 세포에서의 항염증 효능 −삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물의 항염증 효능을 비교 평가하기 위하여 각 추출물과 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리한 RAW 264.7 세포에서 NO, PGE2, IL-6 및 TNF-α 생성억제 효과를 검색하였다.
2 (Maidstone, Kent, UK) 여과지를 이용하여 여과한 후 감압 농축하였다. 감압 농축된 물 추출물의 잔여 용매를 완전히 제거하기 위하여 동결건조 하여 물 추출물 11.2 g (수율 25.75%)을 얻었다. 또한 감압 농축된 70% EtOH 추출물에 물 100 mL을 첨가한 후 동결건조 하여 70% EtOH 추출물 9.
기기−함량분석을 위한 HPLC는 LC-20A 시스템(Shimadzu Co., Kyoto, Japan)을 사용하였고, 시스템은 pump (LC-20AT), on-line degasser (DGU-20A3), column oven (CTO-20A), autosampler (SIL-20AC) 및 PDA detector (SPDM20A) 로 구성되어 있다.
이와 같이 삼출건비탕과 이를 구성하는 약재들의 주요 성분에 대한 생리 활성은 알려져 있지만, 삼출건비탕 처방의 추출 용매에 따른 성분 및 활성 차이 등에 대한 연구 결과는 발표된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 삼출건비탕을 물과 70% EtOH를 이용하여 추출한 추출물을 대상으로 구성약재의 주요 성분인 albiflorin, paeoniflorin, hesperidin, naringin, poncirin, liquiritin 및 glycyrrhizin에 대하여 동시분석을 실시하였다. 또한 모든 질병에서 기본적으로 발생하는 염증반응에 대한 삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물의 효능을 비교하기 위해서 in vitro assay를 통해 항염증, 항알러지 및 항비만 효능을 평가하였다.
따라서 본 연구에서는 삼출건비탕을 물과 70% EtOH를 이용하여 추출한 추출물을 대상으로 구성약재의 주요 성분인 albiflorin, paeoniflorin, hesperidin, naringin, poncirin, liquiritin 및 glycyrrhizin에 대하여 동시분석을 실시하였다. 또한 모든 질병에서 기본적으로 발생하는 염증반응에 대한 삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물의 효능을 비교하기 위해서 in vitro assay를 통해 항염증, 항알러지 및 항비만 효능을 평가하였다. 분석결과 물 추출물보다 70% EtOH 추출물에서 paeoniflorin을 제외한 모든 성분들의 함량이 높게 추출되어 나오는 것을 확인하였으며, 생리 활성 역시 유기용매 추출물에서 더 높게 나타나는 것을 확인하였다.
7 세포를 96 well plate에 각각 1×10³, 6×10³ 및 3×10³ cells/well씩 분주하여 18 시간 배양한 후, 삼출건비탕물 추출물 및 70% EtOH 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 물 추출물과 70% EtOH 추출물의 수율이 다르므로 모든 실험은 추출 전 건조 약재의 양으로 맞추어 진행하였다. 3T3-L1 preadipocytes는 96 well plate에 5×10⁴ cells씩 분주한 후, 삼출건비탕 물 추출물과 70% EtOH 추출물을 농도별로 처리하여 상기 방법으로 8 일간 분화를 유도하였다.
분석조건의 확립 −삼출건비탕의 구성 약재 중 작약의 주요성분인 albiflorin과 paeoniflorin, 진피의 주요성분인 hesperidin, 지실의 주요성분인 naringin과 poncirin 및 감초의 주요성분인 liquiritin과 glycyrrhizin을 분석 대상으로 1.0% acetic acid가 함유된 water와 1.0% acetic acid가 함유된 acetonitrile을 기울기 용매 조건으로 하여 35분 이내에 분리하였다.
삼출건비탕 추출물 및 검액의 조제 −삼출건비탕의 구성 한약재를 Table I과 같이 무게 비율로 배합하여 물과 70% EtOH를 시료의 10배(각각 435 mL)로 각각 첨가하여 2시간 전탕 한 후 Whatman No. 2 (Maidstone, Kent, UK) 여과지를 이용하여 여과한 후 감압 농축하였다.
상등액 내의 PGE2, IL-6 및 TNF-α 분비량을 측정하기 위해 ELISA kit를 사용하여 각 제조사의 방법에 따라 측정하였으며, PGE2 억제에 대한 양성 대조군으로 indomethacin을 사용하였다.
세포독성 평가 −삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물의 각 세포 독성을 알아보기 위해 HaCaT, BEAS-2B 및 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 각각 1×103, 6×103 및 3×103 cells/well씩 분주하여 18 시간 배양한 후, 삼출건비탕물 추출물 및 70% EtOH 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
1% 이내로 양호한 재현성을 나타내었다. 이상과 같이 확립된 삼출건비탕의 물 추출물과 70% EtOH 추출물을 HPLC-PDA를 이용하여 동시분석을 실시하고 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, naringin, hesperidin, poncirin 및 glycyrrhizin 등 7종 성분에 대한 함량을 분석하였다. 함량 분석 결과 paeoniflorin을 제외한 6종 성분 모두물 추출물보다 70% EtOH 추출물에서 높은 함량을 나타냈으며 특히 glycyrrhizin은 7.
이어서 2일 동안 10% FBS와 1 μg/mL insulin을 포함한 DMEM을 사용하고, 분화 유도 4 일째부터 10% FBS가 포함된 DMEM을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
지방세포의 분화 − 3T3-L1 preadipocytes는 3T3-L1 differentiation medium에 분화 유도물질인 5 μg/mL insulin, 1 μM dexamethasone 및 0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)을 2일 동안 처리하여 지방세포로 분화를 유도하였다.
MN, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 대조군과 비교하여 상대적인 세포생존율(% of control)을 계산하였으며, 이후의 실험은 세포 독성이 나타나지 않는 최고 농도를 기준으로 진행하였다.

대상 데이터

(NY, USA), β- mercaptoethanol, lipopolysaccharide (LPS) 및 indomethacin은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
Tumor necrosis factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ, human macrophage-derived chemokine (MDC/CCL22), human regulated on activation of normal T-cell-expressed and -secreted (RANTES/CCL5) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit 및 mouse leptin immunoassay kit는 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하여 사용하였다. Griess reagent와 prostaglandin E₂ (PGE₂) ELISA kit는 각각 Promega Corporation (Madison, WI, USA)과 Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, USA)로부터 구입하였다. Interleukin (IL)-6 및 TNF-α ELISA kit는 Invitrogen Co.
조건에서 배양하였다. Human bronchial epithelial cell line인 BEAS-2B, mouse macrophage cell line인 RAW 264.7 및 mouse preadipocyte cell line인 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다. BEAS-2B 및 RAW 264.
Interleukin (IL)-6 및 TNF-α ELISA kit는 Invitrogen Co. (Camarillo, CA, USA)로부터 구입하였으며, 3T3-L1 (mouse embryonic fibroblast) differentiation medium과 glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) activity assay kit는 각각 Zen-Bio Inc. (durham, NC, USA)와 Takara(Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하였다. T-STIM^TM with ConA culture supplement (rat)와 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)는 각각 BD Bioscience (NJ, USA)와 Dojindo (Kumamoto, Japan) 제품을 사용하였다. Tumor necrosis factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ, human macrophage-derived chemokine (MDC/CCL22), human regulated on activation of normal T-cell-expressed and -secreted (RANTES/CCL5) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit 및 mouse leptin immunoassay kit는 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하여 사용하였다.
Tumor necrosis factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ, human macrophage-derived chemokine (MDC/CCL22), human regulated on activation of normal T-cell-expressed and -secreted (RANTES/CCL5) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit 및 mouse leptin immunoassay kit는 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하여 사용하였다.
실험재료 −본 실험에 사용된 삼출건비탕의 구성 한약재(Table I)는 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 각각 구입하였다. 구입한 한약재는 이제현 교수(Dongguk University, Gyeongju, Korea)와 서영배 교수(Daejeon University, Daejeon, Korea) 2인의 전문가 감별 후 사용하였으며, 각각의 구성 한약재들의 표본 (2012-KE06-1~2012-KE06-14)은 한국한의학연구원 한약기초연구그룹에 보관하였다.
분석에 사용 된 칼럼은 Gminin C18 (5 μm, 4.6×150mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) 칼럼을 사용하였고, 칼럼온도는 40℃로 유지하였다.
세포 배양 − Human keratinocyte cell line인 HaCaT 세포는 세종대학교 이나경 교수(Seoul, Korea)로부터 분양 받아 사용하였으며 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 penicillin (100 U/mL)과 streptomycin (100 μg/mL)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
0% 이상이었다. 시료전처리 및 HPLC 분석을 위한 methanol, acetonitrile, ethanol 및 water는 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, acetic acid는 Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 제품을 사용하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), new born calf serum (NCS), penicillin-streptomycin 및 phosphatebuffered saline (PBS)은 Gibco BRL.
시약 −표준물질인 paeoniflorin, liquiritin, naringin, glycyrrhizin 및 hesperidin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan), albiflorin과 poncirin은 ChromaDex (Irvine, CA, USA)로부터 구입하였다.
실험재료 −본 실험에 사용된 삼출건비탕의 구성 한약재(Table I)는 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 각각 구입하였다.

데이터처리

실험결과에 대한 통계학적 유의성 검정은 ANOVA검정을 적용하였으며, Dunnet’s multiple comparison test를 이용하여 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.

이론/모형

HPLC 분석조건−삼출건비탕 내 주요성분인 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, naringin, hesperidin, poncirin 및 glycyrrhizin의 함량을 분석하기 위하여 Shimadzu사의 LC-20A 시스템을 사용하여 측정하였다.

성능/효과

2) 건강(乾薑)의 추출용매별 수율 비교 결과 추출 수율은 물 추출물이 높다고 발표하였으나 표준 물질인 6-gingerol의 함량 비교는 없었고,3) 석창포의 용매별 추출물의 성분 함량 비교 결과 물 추출물과 비교하여 50% MeOH 추출물의 α- 및 β-asarone 함량이 높다고 보고된 바 있다.
22) 본 연구에서 삼출건비탕의 항염증 효능을 확인하기 위하여 RAW 264.7 대식세포에서 LPS 로 유도된 NO, PGE2, IL-6 및 TNF-α 생성에 대한 억제 활성을 평가한 결과, 물 추출물은 NO, IL-6 및 TNF-α 생성을 억제하는 것으로 나타났으나 농도의존적인 효과는 없었으며 PGE2 생성은 미미한 수준으로 억제하는 것으로 나타났다.
23) Th2-type chemokine에 속하는 MDC/CCL22와 Th1-type chemokine 인 RANTES/CCL5는 아토피 피부염과 같은 염증성 알러지 질환에 관여하며, HaCaT 세포에서 TNF-α와 IFN-γ로 자극했을 때 분비량이 증가한다.
^29-30) Leptin은 지방세포에서 분비되는 유사 cytokine hormone으로 중추신경계를 통해 식욕과 체중조절을 유도하는 것으로 알려져 있으며^,31) adipogenesis는 GPDH에 의해 glycerol에서 triacylglycerol로의 전환을 통해 유도된다.³²⁾ 이에 본 연구에서 3T3- L1 preadipocytes에서 adipocytes로 분화되는 과정에서 그 발현량이 증가하는 GPDH 및 leptin에 대한 삼출건비탕의 억제 활성을 측정한 결과, 물 추출물에 비해 70% EtOH 추출물의 활성이 더 높은 것으로 나타났다. 따라서 70% EtOH 추출물에 항비만 활성을 지닌 성분이 다량 추출되었음을 유추할 수 있다.
3T3-L1 세포에서의 항비만 효능 − 3T3-L1 preadipocytes의 분화 억제에 대한 삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물의 효과를 검색한 결과, adipocytes로의 분화 시 증가된 GPDH 활성은 삼출건비탕 추출물에 의해 유의적으로 억제되었으며(P<0.01), 특히 70% EtOH 추출물은 1000 μg/mL 에서 GPDH 활성을 매우 강하게 억제(93.45%, P<0.01)하는 것으로 나타났다(Fig. 5A).
²⁾ 건강(乾薑)의 추출용매별 수율 비교 결과 추출 수율은 물 추출물이 높다고 발표하였으나 표준 물질인 6-gingerol의 함량 비교는 없었고,³⁾ 석창포의 용매별 추출물의 성분 함량 비교 결과 물 추출물과 비교하여 50% MeOH 추출물의 α- 및 β-asarone 함량이 높다고 보고된 바 있다.⁴⁾ 한약 처방으로는 전도산(顚倒散)의 추출용매별 효능 비교 결과 항염증 효능은 물 추출물, 항산화 작용은 에탄올 추출물이 우수하다고 발표하였으나 이들의 성분 함량 비교는 없었다.⁵⁾ 이처럼 한약재 또는 한약처방에 대해 추출 용매에 따른 성분 함량과 효능의 동시 비교 연구는 거의 없는 실정이다.
3). 70% EtOH 추출물은 MDC 분비를 농도의존적으로 억제하지는 않지만, 물 추출물에 비해 MDC 및 RANTES 분비에 대한 억제 효과가 높은 것으로 나타났다.
65 μg/mL로 각각 나타났다(Table II). 7종 성분의 피크 면적과 머무름 시간에 대한 재현성은 모두 상대표준편차가 1.5%와 0.1% 이내로 양호한 재현성을 나타내었다. 이상과 같이 확립된 삼출건비탕의 물 추출물과 70% EtOH 추출물을 HPLC-PDA를 이용하여 동시분석을 실시하고 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, naringin, hesperidin, poncirin 및 glycyrrhizin 등 7종 성분에 대한 함량을 분석하였다.
BEAS-2B 세포에서의 항천식 효능 −삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물의 항천식 효능을 비교 평가하기 위하여 각 추출물과 TNF-α (10 ng/mL)를 동시 처리한 BEAS-2B 세포에서 RANTES 분비억제효과를 검색한 결과 TNF-α 처리군은 대조군과 비교하여 RANTES 분비가 유의적으로 증가하였다(P<0.01, Fig. 4).
PGE2생성 역시 LPS 처리로 인해 유의적으로 증가하였으며(P<0.01), 양성 대조군으로 사용한 indomethacin은 LPS 처리군과 비교하여 PGE2 생성을 유의적으로 억제하였다(P<0.01, Fig. 2B).
TNF-α 생성에 대해서는 물 추출물이 농도의존적이지는 않지만 유의적인 억제 활성을 나타내었으며(P<0.01), 70% EtOH 추출물은 500 μg/mL까지는 유의적인 차이를 보이지 않았으나 1000 μg/mL에서 현저히 억제(53.02% , P<0.01)하는 것으로 나타났다.
TNF-α/IFN-γ 처리로 인해 증가한 MDC 및 RANTES 분비가 물 추출물에 의해 유의적으로 억제되었지만, 70% EtOH 추출물이 물 추출물보다 더 낮은 농도에서 높은 억제율을 나타내었다.
(Osaka, Japan), albiflorin과 poncirin은 ChromaDex (Irvine, CA, USA)로부터 구입하였다. 각 표준물질의 순도는 hesperidin (92.0%)을 제외한 6종 모두 98.0% 이상이었다. 시료전처리 및 HPLC 분석을 위한 methanol, acetonitrile, ethanol 및 water는 J.
PDA 검출 파장은 230 nm에서 albiflorin과 paoniflorin, 254 nm에서 glycyrrhizin 및 280 nm에서 naringin, hesperidin, poncirin 및 liquititin을 각각 검출하였다. 검액에서의 peak는 주요 성분 peak의 retention time과 UV 흡수 파장을 비교하여 확인하였으며, 7종의 성분은 8.774, 9.657, 11.495, 13.465, 13.977, 19.127 및 30.295분에 각각 검출되었다(Fig. 1).
²⁸⁾ 따라서 본 연구에서 TNF-α로 자극시킨 BEAS-2B 세포에서 RANTES 분비에 대한 삼출건비탕의 억제 활성을 측정하여 항천식 효능을 평가하였다. 그 결과 물 추출물과 70% EtOH 추출물 모두 RANTES 분비를 농도의존적으로 억제하는 것으로 나타났지만, 70% EtOH 추출물이 물 추출물에 비해 상대적으로 높은 활성을 가짐으로써 기관지 천식 완화에 효과적인 성분이 유기용매에 의해 다량 추출된 것으로 판단되었다.
대조군과 비교하여 LPS 처리군은 NO 생성이 유의적으로 증가되었고(P<0.01) 양성 대조군으로 사용한 L-NMMA 처리시 농도의존적으로 LPS에 의한 NO 생성을 억제하는 것으로 나타났다(P<0.01).
대조군과 비교하여 TI 처리군은 MDC 및 RANTES 분비가 유의적으로 증가한 반면(P<0.01), 양성 대조군으로 사용한 silymarin은 TI 처리군과 비교하여 MDC 및 RANTES 분비를 농도의존적으로 억제하였다(P<0.01, Fig. 3).
TNF-α/IFN-γ 처리로 인해 증가한 MDC 및 RANTES 분비가 물 추출물에 의해 유의적으로 억제되었지만, 70% EtOH 추출물이 물 추출물보다 더 낮은 농도에서 높은 억제율을 나타내었다. 따라서 삼출건비탕을 물보다 70% EtOH로 추출할 경우 아토피 피부염의 예방 및 치료에 더 효과적인 성분이 다량 추출되는 것으로 사료된다. 한편, 여러 연구에 의하면 호흡기 상피세포는 바이러스 감염, TNF-α, IFN-γ 등과 같은 여러 자극에 의하여 IL-6, IL-8, RANTES 등의 cytokine 및 chemokine을 분비해 기도 염증반응에 관여하는 것으로 알려져 있다.
또한 7종 성분의 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 0.05-0.20 μg/mL 과 0.15-0.65 μg/mL로 각각 나타났다(Table II).
반면, 70% EtOH 추출물은 NO, PGE2, IL-6 및 TNF-α 모두 유의적으로 억제하며 물 추출물에 비해 억제율이 높은 것으로 나타났다.
또한 모든 질병에서 기본적으로 발생하는 염증반응에 대한 삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물의 효능을 비교하기 위해서 in vitro assay를 통해 항염증, 항알러지 및 항비만 효능을 평가하였다. 분석결과 물 추출물보다 70% EtOH 추출물에서 paeoniflorin을 제외한 모든 성분들의 함량이 높게 추출되어 나오는 것을 확인하였으며, 생리 활성 역시 유기용매 추출물에서 더 높게 나타나는 것을 확인하였다.
삼출건비탕 물 추출물 및 70% EtOH 추출물은 각 세포독성이 나타나지 않는 최고농도인 500 및 100 μg/mL에서 MDC 분비를 67.13 및 74.78%, RANTES 분비를 51.99 및 78.56% 억제하는 것으로 나타났다(P<0.01, Fig. 3).
삼출건비탕 물 추출물은 NO 생성을 억제하는 것으로 나타났으나 농도의존적인 효과는 없었으며, 70% EtOH 추출물은 농도가 증가함에 따라 NO 생성을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다(P<0.01).
삼출건비탕 물 추출물은 PGE2 생성을 억제하는 것으로 나타났으나 농도의존적인 효과는 없는 반면, 70% EtOH 추출물은 62.5 μg/mL 이상에서 PGE2 생성을 현저히 억제(78.46%, P<0.01)하여 물 추출물에 비해 높은 PGE2 억제 활성을 나타내었다.
삼출건비탕을 물과 70% EtOH를 이용하여 추출한 추출물을 대상으로 albiflorin, paeoniflorin, hesperidin, naringin, poncirin, liquiritin 및 glycyrrhizin에 대하여 동시분석을 실시한 결과 물 추출물보다 70% EtOH 추출물에서 paeoniflorin을 제외한 모든 성분들의 함량이 높게 추출되어 나옴을 알 수 있다. 또한 삼출건비탕 물 추출물에 비해 70% EtOH 추출물의 항염증, 항알러지 및 항비만 효능이 상대적으로 높은 것은 유기용매에 의해 다량 추출된 성분들에서 기인한 것으로 판단된다.
삼출건비탕이 배양액 내 leptin 함량에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비해 물 추출물 및 70% EtOH 추출물은 농도의존적으로 leptin 분비를 억제하는 것으로 나타났다(P<0.05).
이에 반해 물 추출물 및 70% EtOH 추출물은 농도의존적으로 RANTES 분비를 억제하는 것으로 나타났다 (P<0.05).
증가된 IL-6 생성은 물 추출물에 의해 억제되었으나(P<0.01) 농도의존적이지 않은 것에 반해 70% EtOH 추출물은 농도가 증가함에 따라 IL-6의 생성을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다(P<0.01).
이상과 같이 확립된 삼출건비탕의 물 추출물과 70% EtOH 추출물을 HPLC-PDA를 이용하여 동시분석을 실시하고 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, naringin, hesperidin, poncirin 및 glycyrrhizin 등 7종 성분에 대한 함량을 분석하였다. 함량 분석 결과 paeoniflorin을 제외한 6종 성분 모두물 추출물보다 70% EtOH 추출물에서 높은 함량을 나타냈으며 특히 glycyrrhizin은 7.6배 이상 높은 함량을 나타냈다(Table III).

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	삼출건비탕은 무엇으로 구성되었는가?	삼출건비탕은 인삼, 백출, 백복령, 후박, 진피, 산사육, 지실, 백작약, 축사, 신곡, 맥아, 감초, 생강 및 대조의 14가지 한약으로 구성되었으며, 만성 위염, 위궤양, 위하수, 소화불량, 설사, 구토 등을 치료하기 위해 사용된다.1)
	HPLC 분석조건을 활용해 삼출건비탕 내 주요성분을 분석할 때, 칼럼은 어떤 것을 사용하였는가?	HPLC 분석조건−삼출건비탕 내 주요성분인 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, naringin, hesperidin, poncirin 및 glycyrrhizin의 함량을 분석하기 위하여 Shimadzu사의 LC-20A 시스템을 사용하여 측정하였다. 분석에 사용 된 칼럼은 Gminin C18 (5 μm, 4.6×150mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) 칼럼을 사용하였고, 칼럼온도는 40oC로 유지하였다. 유속은 1.
	세포막을 파괴하여 세포 안의 성분을 추출하는 데 가장 유용한 것은 무엇인가?	한약재 및 한약 처방의 경우 임상적으로는 주로 물에 끓여서 추출하는 전탕액의 형태로 복용하는데 반해 천연물 신약 개발의 용도로는 메탄올 (MeOH), 에탄올 (EtOH) 등의 저급 알코올 또는 이의 수용액 추출물을 이용하여 연구가 진행되는 것이 대부분이다. 특히 세포막을 파괴하여 세포 안의 성분을 추출하기 위해서는 70% EtOH가 가장 유용하다.2) 건강(乾薑)의 추출용매별 수율 비교 결과 추출 수율은 물 추출물이 높다고 발표하였으나 표준 물질인 6-gingerol 의 함량 비교는 없었고,3) 석창포의 용매별 추출물의 성분 함량 비교 결과 물 추출물과 비교하여 50% MeOH 추출물의 α- 및 β-asarone 함량이 높다고 보고된 바 있다.

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표제어: PCR

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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