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문제 정의
- 본 연구는 UROC1 유전자와 자폐스펙트럼장애와의 연관성에 대한 최초의 연구로서 중요한 실험적 보고자료가 될 것이다. UROC1 유전자의 exon 영역의 변이가 자폐스펙트럼장애와 연관성을 가지는지 본 연구에서는 진행되지 않았다.
- 이에 본 연구자들은 자폐스펙트럼장애의 발병의 원인을 유전적 요인에 초점을 맞춰 연구를 진행하였다. 본 연구는 다단계분석방법을 이용한 전장유전체 연구로서, 자폐스펙트럼장애와 UROC1 유전자 간의 연관성 연구를 수행하였다.
- 이에 본 연구자들은 자폐스펙트럼장애의 발병의 원인을 유전적 요인에 초점을 맞춰 연구를 진행하였다. 본 연구는 다단계분석방법을 이용한 전장유전체 연구로서, 자폐스펙트럼장애와 UROC1 유전자 간의 연관성 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 게놈 DNA를 준비하기 위해서 연구대상자로부터 혈액을 채취하였다. G-DEXTM blood gDNA purification kits(Intron Biotechnology Inc., Seongnam, Korea)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 준비된 게놈 DNA는 GoldenGate assay를 수행하기 위해서 Quant-iTTM PicogreenⓇ dsDNA assay kit(Invitrogen, Eugene, OR, USA)를 사용하여 농도를 측정하고 50ng/uL로 농도를 조절하였다.
- 유전형의 경우, 유전모형별 유의성 검사를 위해 유전모형별로 유전형 빈도를 재구성하였다. 각 유전모형은 우성(dominant, AA vs. AB+ BB), 열성(recessive, AA+AB vs. BB), 공우성(additive, AA vs. AB vs. BB)으로 나누었다. 각각의 유전모형은 로지스틱 회귀분석을 통해서 상대적 위험도(odds ratio, OR)와 95%신뢰구간 및 유의수준을 산출하였다.
- 본 연구는 전장유전체 분석방법을 이용한 환자-대조군 연관성 분석 연구로, 대립인자 분석과 유전형 분석, 반수체형 분석 모두에서 UROC1 유전자의 단일염기다형성과 자폐스펙트럼장애와의 유의한 연관성을 발견하지 못하였다.
- gov/projects/SNP/)에 등록되어 있는 UROC1 유전자의 단일염기다형성을 추가하여 3단계 실험에 사용할 단일염기다형성으로 선정하였다. 선정된 단일염기다형성들은 Golden-Gate 96plex Genotyping assay for VeraCode(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 표준 프로토콜에 따라서 유전형 검사를 진행하였다. 얻어진 형광값들은 Genome Studio Software(V2010.
- , San Diego, CA, USA)를 사용하여 표준 프로토콜에 따라서 유전형 검사를 진행하였다. 얻어진 형광값들은 Genome Studio Software(V2010., Genotyping version 1.8.4, Illumina Inc., San Diego, CA, USA)로 군집화(clustering)를 하여 유전형을 결정하였다.
- 자폐스펙트럼장애와 UROC1 유전자의 연관성을 확인하기 위해서, 유전자 내의 단일염기다형성에 대해서 유전형 검사를 실시하였다. 13개의 단일염기다형성 중 1개의 단일염기다형성이 군집화(clustering)가 불가능하여 유전자형을 알 수 없었다.
- , Seongnam, Korea)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 준비된 게놈 DNA는 GoldenGate assay를 수행하기 위해서 Quant-iTTM PicogreenⓇ dsDNA assay kit(Invitrogen, Eugene, OR, USA)를 사용하여 농도를 측정하고 50ng/uL로 농도를 조절하였다.
대상 데이터
- 12) 1단계로 Infinium 100K chip(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)으로 대조군 35명과 자폐스펙트럼장애 24명을 대상으로 연구를 수행하였다.
- , San Diego, CA, USA)으로 대조군 188명과 자폐스펙트럼장애 44명을 대상으로 2단계 연구를 수행하였다. 1단계와 2단계에서 유의하게 나온 UROC1 유전자의 단일염기다형성에 미국 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)에 등록되어 있는 UROC1 유전자의 단일염기다형성을 추가하여 3단계 실험에 사용할 단일염기다형성으로 선정하였다. 선정된 단일염기다형성들은 Golden-Gate 96plex Genotyping assay for VeraCode(Illumina Inc.
- , San Diego, CA, USA)으로 대조군 35명과 자폐스펙트럼장애 24명을 대상으로 연구를 수행하였다. 2단계는 Infinium II HumanExon510S-Duo chip(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)으로 대조군 188명과 자폐스펙트럼장애 44명을 대상으로 2단계 연구를 수행하였다. 1단계와 2단계에서 유의하게 나온 UROC1 유전자의 단일염기다형성에 미국 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 dbSNP(http://www.
- 게놈 DNA를 준비하기 위해서 연구대상자로부터 혈액을 채취하였다. G-DEXTM blood gDNA purification kits(Intron Biotechnology Inc.
- 환자들은 3개 특수학교의 학생과 병원의 외래환자를 대상으로 2004-2006년까지 모집되었다. 대조군은 유전학적, 신경학적 병력이 없는 남성 236명과 여성 22명을 선정하였다. 본 연구는 자체 의학연구윤리심의위원회(Institutional Review Board, IRB)를 통과하였다,
- 연구대상군은 정신장애 진단 및 통계편람(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition)10)과 한국판 자폐 평정척도(Korean version of Childhood Autism Rating Scale, K-CARS)11) 총점 30점 이상 기준을 통해 자폐성 장애(Autistic Disorder), 비전형적인 자폐증(Atypical Autism), 아스퍼거장애(Asperger’s disorder)로 구성되는 자폐스펙트럼장애 환자 192명의 남성과 22명의 여성을 대상으로 하였다.
- 총점 30점 이상 기준을 통해 자폐성 장애(Autistic Disorder), 비전형적인 자폐증(Atypical Autism), 아스퍼거장애(Asperger’s disorder)로 구성되는 자폐스펙트럼장애 환자 192명의 남성과 22명의 여성을 대상으로 하였다. 환자들은 3개 특수학교의 학생과 병원의 외래환자를 대상으로 2004-2006년까지 모집되었다. 대조군은 유전학적, 신경학적 병력이 없는 남성 236명과 여성 22명을 선정하였다.
데이터처리
- BB)으로 나누었다. 각각의 유전모형은 로지스틱 회귀분석을 통해서 상대적 위험도(odds ratio, OR)와 95%신뢰구간 및 유의수준을 산출하였다. 연관비평형(linkage disequilibrium, LD)은 Haploview software(version 4.
- 05 이상인 단일염기다형성을 선택하였다. 유전형 질병 연관성 분석을 위해서 환자군과 대조군 간의 유의성 검사를 대립인자의 경우, 카이제곱검정을 통해 수행하였다. 유전형의 경우, 유전모형별 유의성 검사를 위해 유전모형별로 유전형 빈도를 재구성하였다.
- 연관비평형 블록은 Gabriel 등이 제시한 알고리즘13)을 사용하였다. 이로부터 얻어진 반수체형(Haplotype)은 카이제곱검정을 통해서 질병연관성 분석을 하였다.
- 통계분석은 Plink(version 1.07, http://pngu.mgh.harvard. edu/~purcell/plink/) & gPlink(version 2.050, http://pngu. mgh.harvard.edu/~purcell/plink/gplink.shtml)와 SAS(version 9.1.3 Service Pack 4)를 이용하여 수행하였다.
- 환자군과 대조군의 유전형의 분포가 Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)을 만족하는지, 유전형의 결정에 오류 유무를 확인하기 위해서 카이제곱검정을 실시하였다. 각각의 단일염기다형성은 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency)가 0.
이론/모형
- 단일염기다형성 선정은 전장유전체분석(genome wide association study)과 다단계 접근방법(multi-stage approach)으로 진행하였다.12) 1단계로 Infinium 100K chip(Illumina Inc.
- org/haploview)를 이용하여 확인하였다. 연관비평형 블록은 Gabriel 등이 제시한 알고리즘13)을 사용하였다. 이로부터 얻어진 반수체형(Haplotype)은 카이제곱검정을 통해서 질병연관성 분석을 하였다.
- 각각의 유전모형은 로지스틱 회귀분석을 통해서 상대적 위험도(odds ratio, OR)와 95%신뢰구간 및 유의수준을 산출하였다. 연관비평형(linkage disequilibrium, LD)은 Haploview software(version 4.2, http:// www.broadinstitute.org/haploview)를 이용하여 확인하였다. 연관비평형 블록은 Gabriel 등이 제시한 알고리즘13)을 사용하였다.
성능/효과
- 자폐스펙트럼장애와 UROC1 유전자의 연관성을 확인하기 위해서, 유전자 내의 단일염기다형성에 대해서 유전형 검사를 실시하였다. 13개의 단일염기다형성 중 1개의 단일염기다형성이 군집화(clustering)가 불가능하여 유전자형을 알 수 없었다. 12개의 단일염기다형성은 intron에 11개, 3’UTR에 1개가 존재한다(Fig.
- 이러한 UROC1에서의 변이가 urocanic aciduria의 원인이라는 보고가 있다.9) Glutamate formiminotransferase deficiency는 히스티딘 대사과정에서 생기는 또 다른 물질대사 결함으로서, 이 질병을 가지는 환자에서 또한 정신지체 및 신체 발달지연을 가진다.7) 이는 urocanic acid의 이화작용이 제대로 수행되지 않으면 정신지체의 유발에 영향을 미친다고 볼 수 있다.
- Haploview 프로그램을 이용하여 Gabriel의 알고리즘에 따라 단일염기다형성 간의 연관비평형 블록의 구조를 확인한결과, UROC1 유전자의 12개의 단일염기다형성이 2개의 블록으로 나누어져서 연관비형평 블록을 형성함을 확인하였다(Fig. 1). 반수체형 분석결과, 2개의 블록의 모든 반수체형에서 모두 유의성이 없었다(p-value＞.
- 05). 대립인자 분석에서 각 단일염기다형성은 환자군과 대조군 간의 유의한 차이가 없음을 확인하였다(p-value＞.05)(Table 1).
- 유전형 연관분석을 로지스틱 회귀분석을 통해 확인한 결과, 모든 유전 모델에서 유의한 결과를 나타내지 않았다(p-value ＞.05)(Table 2).
- UROC1 유전자의 exon 영역의 변이가 자폐스펙트럼장애와 연관성을 가지는지 본 연구에서는 진행되지 않았다. 하지만 urocanic aciduria의 연구를 바탕으로 사료한 결과, 본 연구자들은 UROC1 유전자의 기능에 영향을 미치는 변이가 정신지체 증상을 유발하여 자폐스펙트럼장애 발병에 영향을 미칠 것이라 추측한다. 따라서, UROC1유전자의 변이와 자폐스펙트럼장애와의 명확한 연관성을 알기 위해서는 추후 UROC1 유전자의 exon부위에 위치한 단일염기다형성 그리고 urocanic acid의 대사과정과 자폐스펙트럼장애와의 연관성 연구가 필요할 것으로 사료된다.
후속연구
- 한국인에서 자폐스펙트럼장애와 UROC1 유전자의 intron 영역 및 3’UTR영역에 존재하는 단일염기다형성 간의 유의한 상관관계를 찾지 못하였다. UROC1유전자의 변이와 자폐스펙트럼장애와의 명확한 연관성을 알기 위해서 UROC1 유전자의 exon영역에 대한 연관성 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 하지만 urocanic aciduria의 연구를 바탕으로 사료한 결과, 본 연구자들은 UROC1 유전자의 기능에 영향을 미치는 변이가 정신지체 증상을 유발하여 자폐스펙트럼장애 발병에 영향을 미칠 것이라 추측한다. 따라서, UROC1유전자의 변이와 자폐스펙트럼장애와의 명확한 연관성을 알기 위해서는 추후 UROC1 유전자의 exon부위에 위치한 단일염기다형성 그리고 urocanic acid의 대사과정과 자폐스펙트럼장애와의 연관성 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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