[국내논문]저령차전자탕(豬苓車前子湯)이 βA와 LPS로 처리된 BV2 microglial cell에 미치는 영향 The Effects of Jeoreongchajeonja-tang(Zhulingjuqianzi-tang) on the βA and LPS Induced BV2 microglial cell원문보기
Objectives : This research investigates the effect of the JCT extract regarding Alzheimer's disease. Methods : The effects of the JCT extract on IL-$1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$, COX-2, NOS-II mRNA, APP mRNA, BACE mRNA, Nitric oxide(NO), and ${\beta}A$ protein pro...
Objectives : This research investigates the effect of the JCT extract regarding Alzheimer's disease. Methods : The effects of the JCT extract on IL-$1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$, COX-2, NOS-II mRNA, APP mRNA, BACE mRNA, Nitric oxide(NO), and ${\beta}A$ protein production in the BV2 microglia cell lines treated with LPS and ${\beta}A$ were investigated. Results : 1. The JCT extract suppressed the expression of IL-$1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$, COX-2, and NOS-II mRNA in BV2 microglial cell line treated with LPS and ${\beta}A$. 2. The JCT extract suppressed the expression of BACE and APP mRNA in BV2 microglial cell line treated with LPS and ${\beta}A$. 3. The JCT extract suppressed the expression of Nitric oxide(NO) in BV2 microglial cell line treated with LPS and ${\beta}A$. 4. The JCT extract suppressed the expression of ${\beta}A$ protein production in BV2 microglial cell line treated with LPS and ${\beta}A$. Conclusions : These results suggest that the JCT group may be effective for the treatment of Alzheimer's disease. Thus, JCT could be considered among the future therapeutic drugs indicated for the treatment of Alzheimer's disease.
Objectives : This research investigates the effect of the JCT extract regarding Alzheimer's disease. Methods : The effects of the JCT extract on IL-$1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$, COX-2, NOS-II mRNA, APP mRNA, BACE mRNA, Nitric oxide(NO), and ${\beta}A$ protein production in the BV2 microglia cell lines treated with LPS and ${\beta}A$ were investigated. Results : 1. The JCT extract suppressed the expression of IL-$1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$, COX-2, and NOS-II mRNA in BV2 microglial cell line treated with LPS and ${\beta}A$. 2. The JCT extract suppressed the expression of BACE and APP mRNA in BV2 microglial cell line treated with LPS and ${\beta}A$. 3. The JCT extract suppressed the expression of Nitric oxide(NO) in BV2 microglial cell line treated with LPS and ${\beta}A$. 4. The JCT extract suppressed the expression of ${\beta}A$ protein production in BV2 microglial cell line treated with LPS and ${\beta}A$. Conclusions : These results suggest that the JCT group may be effective for the treatment of Alzheimer's disease. Thus, JCT could be considered among the future therapeutic drugs indicated for the treatment of Alzheimer's disease.
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문제 정의
이 四象體質醫學에서 少陽人 亡陰證에서 나타나는 身熱, 頭痛, 泄瀉와 膀胱煢燥에 사용되는處方인 荊防瀉白散이 心熱을 瀉하고 腎臟을 補하는 효과를 가지고 있어 肝腎不足, 熱毒熾盛으로 인한 치매에 활용될 수 있을 것이라 기대되어 실행한 연구에서 βA로 유도된 치매 모델에 일정한 효과가 있음을 밝힌 바 있다. 따라서 荊防瀉白散 에 生地黃을 去하고 豬苓, 車前子를 加한 豬苓車前子湯 또한 熱毒熾盛으로 인한 치매에 활용할 수 있을 것으로 사료되어 본 연구를 진행하였다.
이에 저자는 豬苓車前子湯이 AD에 미치는 영향을 실험적으로 입증하고자, in vitro 실험으로 lipopolysacchride(LPS)와 β-amyloid(βA)를 처리한 BV-2 microglial cell line에서 염증반응 cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2, 그리고 NOS-II mRNA 유전자 발현을 관찰하였으며, AD 관련 유전자인 BACE와 APP mRNA 유전자 발현 및 βA protein 생산량 및 NO 분비량을 관찰하였고, APP 발현량을 western blot으로 관찰한 바, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
동결된 BV-2 세포를 해동하여 10% FBS-DMEM(USA) 배지에서 3일 동안 배양하고 5% FBS-DMEM 배지로 교체 후 4일 동안 배양하였다. 1% 이하의 FBS는 BV-2 세포의 활성화에 영향을 주지 않으므로, 모든 실험에서는 1% FBS-DMEM 배지에서 안정화시킨 BV-2세포를 in vitro 모델로 사용하였다19).
24시간 후 DMEM 배양액으로 각 well을 세척한 후 새로운 배양액과 豬苓車前子湯(100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖)을 처리하고 40시간 동안 CO2 조직배양기에서 배양한 후 세포성 lysate를 얻어 β-APP activity를 측정하였고, 세포성 lysate를 얻기 위하여 50 n㎕의 lysis 완충용액{Tris-HCl(200 mM; pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 0.1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 0.1 mM DTT, 10 ㎍/㎖ leupetin}을 혼합한 후 얼음에서 30분간 배양하고 5분간 원심분리하여 세포성 lysate를 얻어 Bradford 염색법24)으로 단백질을 정량하여 50 ㎍으로 조정하였다.
豬苓車前子湯 3첩 분량(156 g)에 증류수 2,000㎖를 가하여 열탕 추출기에서 3 시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류장치(rotary vaccum evaporator)로 농축하여, 이를 다시 동결건조기(freeze dryer)를 이용하여 완전 건조한 豬苓車前子湯 추출물 19.0 g을 냉동 보관(-84℃) 하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.
豬苓車前子湯(100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖)을 처리하고 1시간 후 LPS(10 μM)와 βA(25-35) 25 μM, 그리고 양성대조군으로 calpain protease inhibitor MDL 28170(35 μM, MDL 28170)을 처리한다.
豬苓車前子湯(100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖)을 처리하고 1시간 후 LPS(10 ㎍/㎖)와 βA 25 μM, 그리고 양성대조군으로 calpain protease inhibitor MDL 28170(35 μM, MDL28170)을 처리한다.
豬苓車前子湯을 처리하기 전 BV-2세포를 24시간 동안 serum-free DMEM으로 배양한 후 10㎍/㎖ lipopolysaccharide(LPS; Sigma)와 25 μM synthetic βA fragment, residues 25-35(USA), LPS 와 βA 25 μM에 양성대조군으로 calpain protease inhibitor MDL 28170(35 μM, MDL 28170)을 처리하고, 6시간을 배양하였다20).
豬苓車前子湯이 AD에 미치는 영향을 실험적으로 규명하고자, LPS와 βA를 처리한 BV2 microglial cell line에서 염증반응 cytokine의 유전자 발현46) 을 관찰하였다.
2% BSA로 2시간 blocking한 후 anti-mouse APP N-terminal antibody를 처리하여 4℃에서 overnight시켰다. 그리고 anti-mouse Ig HRP-conjugated sceondary Ab(1:4000, Amersham, Arlington Heights, IL)과 반응시킨 후 ECL-Hybond film으로 immunoblotting 하여 분석하였다.
본 실험에서 사용한 BV2 microglial cell line은 생쥐의 소신경교세포(미세아교세포)로 primary 미세아교세포 모델을 제공하며18), LPS와 βA를 동시처리한 BV2 microglial cell line에서 염증반응 cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2, 그리고 NOS-II 유전자 발현 증가된다고 보고가 있어20) BV2 microglial cell line에 LPS와 βA을 처리하여 염증반응 cytokine을 유발시킨 뒤 서로 다른 농도의 豬苓車前子湯(100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리하여 이를 관찰함으로써, 豬苓車前子湯이 소신경교세포의 염증반응 cytokine 유전자 발현에 미치는 억제효과를 평가하기로 하였다. 그리고 양성대조군으로 in vivo에서 빠르게 blood-brain barrier를 통과하여 neuroprotective 효과를 나타내는 calpain protease inhibitor MDL28170(MDL 28170)을 사용하였다47).
기기는 spectrophotometer(shimazue, Japan), 원심분리기(한일과학, Korea), Bio-freezer(sanyo, Japan), 열탕추출기(대웅, DWT-1800T, Korea), 감압 증류장치(Rotary evaporator, BUCHI B-480, Switzerland), 동결 건조기(Freeze dryer, EYELA FDU-540, Japen), histidin affinity column을 (Invitrogen. USA), Windows 1D main program(AAB, USA), stereotaxic frame(Adamec, USA), Cellection Pan anti-mouse IgG-bead(Dynal, USA), brain matrix(ASI instruments, Warren, MI., USA), Quantitative Real-Time RT-PCR(Applied Biosystems, USA), ice-maker(비전과학, Korea), ELISA leader(Molecular devise, USA), CO2 incubator(Lepco, USA), Cytometry(BD, USA), Microscope(Nikon, Japan), Cooling microtome(Serotec. USA), VIDEOTRACK(animal and human being behaviour analysis system, Viewpoint, France) 및 homogenizer(OMNI, USA) 등의 것을 사용하였다.
. 동결된 BV-2 세포를 해동하여 10% FBS-DMEM(USA) 배지에서 3일 동안 배양하고 5% FBS-DMEM 배지로 교체 후 4일 동안 배양하였다. 1% 이하의 FBS는 BV-2 세포의 활성화에 영향을 주지 않으므로, 모든 실험에서는 1% FBS-DMEM 배지에서 안정화시킨 BV-2세포를 in vitro 모델로 사용하였다19).
여기에 豬苓車前子湯투여군(100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖)을 처리하고 1시간 후 LPS(10 ㎍/㎖)와 25 μM synthetic βA fragment, residues 25-35(βA; Bachem California, USA), 그리고 LPS와 βA 25 μM에 양성대조군으로 calpain protease inhibitor MDL 28170(35 μM, MDL28170)을 처리하고 각각의 well에 첨가하여 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 전체 배양액을 2,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 회수한 후 여기에 Griess 시약 용액 A(0.2% naphthylethylene diamine dihydrochloride in D.W.)와 용액 B(2% sulfonylamide in 5% H3PO4)를 1:1로 혼합하여 처리하였다. 또한 배양 상층액 100 ㎕를 96 well plate에 분주하고 혼합 용액 100 ㎕를 처리한 후 ELISA reader를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다22).
배양 종료 후 전체 배양액을 2000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 βA protein 생성량을 ELISA(Code No. 27720, Mouse/Rat Amyloidβ(1-40) High Specific Assay Kit-IBL, USA)로 측정하였다.
본 실험에서 사용한 BV2 microglial cell line은 생쥐의 소신경교세포(미세아교세포)로 primary 미세아교세포 모델을 제공하며18), LPS와 βA를 동시처리한 BV2 microglial cell line에서 염증반응 cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2, 그리고 NOS-II 유전자 발현 증가된다고 보고가 있어20) BV2 microglial cell line에 LPS와 βA을 처리하여 염증반응 cytokine을 유발시킨 뒤 서로 다른 농도의 豬苓車前子湯(100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리하여 이를 관찰함으로써, 豬苓車前子湯이 소신경교세포의 염증반응 cytokine 유전자 발현에 미치는 억제효과를 평가하기로 하였다.
여기에 豬苓車前子湯투여군(100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖)을 처리하고 1시간 후 LPS(10 ㎍/㎖)와 25 μM synthetic βA fragment, residues 25-35(βA; Bachem California, USA), 그리고 LPS와 βA 25 μM에 양성대조군으로 calpain protease inhibitor MDL 28170(35 μM, MDL28170)을 처리하고 각각의 well에 첨가하여 24시간 배양하였다.
역전사(reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3 ㎍을 DNase I(10 U/㎕) 2 U/tube에 37℃ heating block에서 30분간 반응 시킨 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5 ㎕ 10mM dNTPs mix, 1 ㎕ random sequence hexanucleotides(25 pmole/ 25 ㎕), RNA inhibitor로서 1 ㎕ RNase inhibitor(20 U/㎕), 1 ㎕ 100 mM DTT, 4.5 ㎕ 5×RT buffer(250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)를 가한 후, 1㎕의 M-MLV RT(200 U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다.
염증 cytokine 및 항염증 cytokine 유전자 발현은 SYBR Green PCR Master mix(ABI)를 사용하였고, internal standard를 GAPDH를 사용하였고, primer의 최종농도가 200 nM이 되게 반응시켰다. Real time quantitative PCR의 조건은 pre-denaturation은 2분간 50℃에서, 10분간 94℃에서, 그리고 40 cycles을 0.
대상 데이터
βA는 AD 환자의 뇌에서 senile plaques 와 diffuse deposits를 주로 유도하는 것으로 알려졌다. Calbiochem 회사에서 공급받았고 아미노산 배열은 Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met이다.
polymerase, DNase, RNase, 그리고 Deoxynucleotide triphosphate(dNTP)는 TaKaRas사(Japan) 제품을, Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase(M-MLV RT)와 RNase inhibitor는 Promega사(USA) 제품을, RNAzolB는 Tel-Test사(USA) 제품을, 그리고, Agarose는 FMC사(USA) 제품을 사용하였고, βA(USA), anti-mouse IgG-bead(USA), anti-IL-1β와 anti-TNF-α(USA), 그리고 anti-CD44-PE(USA), anti-CD68-FITC(USA), anti-CD11b-FITC(USA), anti-GFAP-FITC(USA), anti-mouse Ig HRP-conjugated sceondary Ab(USA)와 ECL-Hybond film(USA), anti-mouse GFAP mAb와 anti-mouse Tau mAb는 Santa-Cruz 사(USA) 제품을, LSAB kit 는 DAKO 사(Denmark) 제품을 사용하였으며, 그 외 시약들은 특급 및 일급을 사용하였다.
본 실험에 사용한 豬苓車前子湯의 구성은 『東醫壽世保元』17)에 준하였으며, 약재들은 대전대학교 둔산 한방병원에서 구입하여 사용하였고 1첩의 내용과 구성은 다음과 같다(Table I)
이론/모형
Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system(USA)를 이용하여 수행하였다.
성능/효과
1. 豬苓車前子湯은 IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2, 및 NOS-II 유전자 발현을 억제하였다.
2. 豬苓車前子湯은 BACE와 APP 유전자 발현을 억제하였다.
3. 豬苓車前子湯은 Nitric oxide(NO) 유전자 발현을 억제하였다.
4. 豬苓車前子湯은 β-APP 단백질 발현을 억제하였다.
BV-2 microglial cell line에서의 β-APP를 Western blot을 통해 관찰한 결과, LPS와 β-APP만을 처리한 대조군에 비해 50㎍/㎖와 100㎍/㎖의 豬苓車前子湯 투여군을 함께 처리한 실험군에서 β-APP 단백질 발현이 억제되었다(Fig. 10).
BV2 cell에서 발현된 염증반응 cytokine 중, IL-1β 유전자는 LPS와 βA만을 투여한 대조군에 비해 豬苓車前子湯을 투여한 실험군 모두에서 발현이 억제되었고, IL-6 유전자는 LPS와 βA만을 투여한 실험군에 비해 豬苓車前子湯을 투여한 실험군 모두에서 IL-6 유전자 발현이 억제되었으며, TNF-α 유전자 역시 LPS와 βA만을 투여한 대조군 보다 豬苓車前子湯을 투여한 실험군의 발현이 억제되었다.
BV2 microglial cell line 정상군의 NO 생성량은 8.8±2.5(μM)이었고, 대조군의 NO 생성량은 302.9±18.4(μM)로 나타났다.
Comparisons between groups were analyzed using Student's paired test and differences between experimental and control groups were considered significant when the degree of confidence in significance was 95% or higher T test(**p<0.01).
Morris water maze를 통한 Stepthrough latency, distance movement through latency 측정에서 기억력 개선 효과를 나타냈었고 AD 병변 뇌조직에서의 세포내 IL-1β, TNF-α의 발현 측정에서 양성세 포수를 억제하였으며 MDA와 CD68+, CD11b+의 세포수를 억제하였다.
Morris water maze를 통한 Stepthrough latency, distance movement through latency 측정에서 기억력 개선 효과를 나타냈었고 AD 병변 뇌조직에서의 세포내 IL-1β, TNF-α의 발현 측정에서 양성세 포수를 억제하였으며 MDA와 CD68+, CD11b+의 세포수를 억제하였다. 뇌조직의 허혈 상태를 개선하였고 허혈로 인한 뇌조직 손상을 억제하였으며 tau단백질과 GFAP의 발현을 억제하였다.
대조군의 RQ값이 1 일 때 정상군의 APP mRNA 유전자 발현의 상대정량 값은 0.574±0.225이었고, 양성대조군(MDL28170) 35 μM 처리군에서는 0.773±0.032(RQ)로 나타났고, 豬苓車前子湯 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 투여군에서는 각각 0.779±0.011(p<0.001)와 0.895±0.052(RQ)로 나타나 100 ㎍/㎖ 투여군에서만 유의한 억제를 보였다(Fig. 7).
대조군의 RQ값이 1 일 때 정상군의 BACE mRNA 유전자 발현의 상대정량 값은 0.191±0.088이었고, 양성대조군(MDL28170) 35 μM처리군에서는 0.341±0.143(RQ)로 나타났고, 豬苓車前子湯100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 투여군에서는 각각 0.584±0.191(p<0.05)과 0.851±0.195(RQ)로 나타나 100㎍/㎖ 투여군에서 유의한 억제를 보였다(Fig. 6).
대조군의 RQ값이 1 일 때 정상군의 IL-1β mRNA 유전자 발현의 상대정량 값은 0.038±0.004이었고, 豬苓車前子湯 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 투여군은 각각 0.545 ± 0.148(p<0.01)과 0.708 ± 0.103(RQ)(p<0.05)로 나타나 대조군에 비해 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 1).
대조군의 RQ값이 1 일 때 정상군의 IL-6 mRNA 유전자 발현의 상대정량 값은 0.011±0.003이었고, 양성대조군(MDL28170) 35 μM처리군은 0.330±0.086(RQ)로 나타났으며, 豬苓車前子湯 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 투여군은 각각 0.617 ± 0.053(p<0.001)과 0.908 ± 0.011(RQ)(p<0.05)로 나타나 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 2).
대조군의 RQ값이 1 일 때 정상군의 TNF-α mRNA 유전자 발현의 상대정량 값은 0.059±0.047이었고, 양성대조군(MDL28170) 35 μM처리군은 0.274±0.024(RQ)로 나타났으며, 豬苓車前子湯100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 투여군은 각각 0.696±0.121(p<0.01)과 0.844 ±0.099(RQ)로 나타나 100 ㎍/㎖ 투여군에서만 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 3).
또한 AD관련 유전자인 BACE와 APP, 그리고 NO, β-APP 모두에서 유의한 결과를 얻었다.
배양상층액에서 βA protein 생성량을 측정한 결과, 정상군은 0.926±0.230(pg/㎖)이었고, 대조군은 27.7±15.4(pg/㎖)로 나타났고, 양성대조군(MDL28170) 35 μM처리군에서는 6.9±3.9(pg/㎖)로 나타났다.
본 실험에서는 BV2 microglial cell line 에서 LPS와 βA의 자극으로 유도된 BACE와 APP 유전자 발현을 관찰한 바 豬苓車前子湯 처리군에서 BACE와 APP 유전자 발현이 억제되었고 β-APP의 발현량을 조절하는지를 Western blot으로 분석한 결과 대조군에 비하여 β-APP 발현량이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
양성대조군(MDL28170) 35 μM처리군에서는 39.8±9.5(㎍/㎖)로 나타났으며, 豬苓車前子湯 100, 50 ㎍/㎖ 투여군에서 NO 생성량은 각각 155.5±27(p<0.001), 그리고 164.4±24.4(p<0.001)(μM)로 나타나 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 8).
이 실험에서 BV2 microglial cell line에서 LPS와 βA로 유도된 NO 생성량을 관찰한 바 NO의 생성량은 豬苓車前子湯 처리군에서 높게 나타나는 것을 볼 수 있었다.
본 실험에서는 豬苓車前子湯 투여군에서 COX-2와 NOS-II의 유의한 억제를 보였고 NOS-II의 경우 荊防瀉白散의 연구41) 결과와 비슷하였다. 이러한 결과는 gene expression 및 protein analysis에서 보다 구체적인 비교를 실시하였으며, 결과적으로 COX-2 및 iNOS gene expression은 豬苓車前子湯에 의해 조절되고 있음을 알 수 있었다. 특히 豬苓車前子湯 100 μg/㎖에서 가장 효과적인 억제가 관찰되었다.
이상을 종합하면 豬苓車前子湯은 LPS와 βA를 처리한 BV2 microglial cell line에서 염증발현 유전자인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현을 억제하였고 이는 소신경교세포의 활성화를 효과적으로 억제했기 때문이라고 사료된다.
특히 豬苓車前子湯 100 μg/㎖에서 가장 효과적인 억제가 관찰되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
치매란?
치매는 뇌의 만성적 진행성 변성질환에 의해 흔히 기억장애 및 기타 지적기능의 상실이 일어나는 임상증후군을 말한다. 좀 더 넓은 의미로는 지적 황폐화뿐만 아니라 행동 이상 및 인격변화를 초래하며, 정서적 기능상실과 진행성인 지적 황폐화가 사회적 혹은 직업적 기능의 장애를 초래하게 되는 상태이다1) .
AD를 유발하는 원인은?
AD를 유발하는 원인은, βA, estrogen, apolipoprotein E, presenilin(PS), 산화제, 염증, 사고에 의한 손상, 신경전달물질의 감소, 신경영양인자 등의 다양한 인자가 관여하는 것으로 알려져 있으며5-6),여러 가지 요인에 의하여 신경섬유매듭(neurofibrillary tangles)과 신경반(neuritic plaque)과 같은 독특한 병리학적 소견을 나타낸다6).
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