다양한 유리화 용액과 동결기구에서 유리 동결 생쥐 포배기 배아의 생존율 비교 The Comparison of Survival Rates of Vitrified Mouse Blastocysts in Various Vitrification Solutions and Apparatuses원문보기
The purpose of this study was to evaluate survival rates of vitrified mouse blastocysts in various vitrification solutions (cryoprotectants) and apparatuses. The mouse blastocysts were harvested from culture of mouse 2 cell embryo and were divided into three group (i) untreated (control); (ii) expos...
The purpose of this study was to evaluate survival rates of vitrified mouse blastocysts in various vitrification solutions (cryoprotectants) and apparatuses. The mouse blastocysts were harvested from culture of mouse 2 cell embryo and were divided into three group (i) untreated (control); (ii) exposed to cryoprotectant agents; or (iii) cryopreserved by various vitrification apparatuses. Vitrification solutions are 40% ethylene glycol (EG) + 5.8 mg/mL ficoll + 0.5M sucrose (EFS solution), 3M glycerol + 3M EG (ES solution), 20% EG + 20% dimethyl sulfoxide (ED solution), 3M EG + 1.0 m sucrose (ES solution). Vitrification apparatuses consisted of 5 groups ; closed plastic straw (CPS), electron microscope (EM) grid, cryoloop, open pulled straw (OPS), and glass micropippete in plastic straw (GPS). The survival rates of control were 88.0%. The survival rates of exposed blastocysts in EFS, GE, ED, and ES solutions were 70.8%, 43.5% (P<0.01), 83.3% and 65.2%, respectively. The survival rates of vitrified blastocysts in CPS, EM grid, cryoloop, OPS and GPS were 56.5% (P< 0.01), 72.7%, 83.3%, 60.9% (P<0.05) and 54.2% (P<0.01), respectively. Among the vitrification solutions, the highest survival rate was seen in blastocysts vitrified in EG + DMSO (83.3%). The survival rate was not significantly different from that of the control (88%). Blastocysts cryopreserved with glycerol in all groups had an overall low survival rate of 43.5%. Survival rate of mouse blastocysts between vitrification apparatuses showed higher in cryoloop.
The purpose of this study was to evaluate survival rates of vitrified mouse blastocysts in various vitrification solutions (cryoprotectants) and apparatuses. The mouse blastocysts were harvested from culture of mouse 2 cell embryo and were divided into three group (i) untreated (control); (ii) exposed to cryoprotectant agents; or (iii) cryopreserved by various vitrification apparatuses. Vitrification solutions are 40% ethylene glycol (EG) + 5.8 mg/mL ficoll + 0.5M sucrose (EFS solution), 3M glycerol + 3M EG (ES solution), 20% EG + 20% dimethyl sulfoxide (ED solution), 3M EG + 1.0 m sucrose (ES solution). Vitrification apparatuses consisted of 5 groups ; closed plastic straw (CPS), electron microscope (EM) grid, cryoloop, open pulled straw (OPS), and glass micropippete in plastic straw (GPS). The survival rates of control were 88.0%. The survival rates of exposed blastocysts in EFS, GE, ED, and ES solutions were 70.8%, 43.5% (P<0.01), 83.3% and 65.2%, respectively. The survival rates of vitrified blastocysts in CPS, EM grid, cryoloop, OPS and GPS were 56.5% (P< 0.01), 72.7%, 83.3%, 60.9% (P<0.05) and 54.2% (P<0.01), respectively. Among the vitrification solutions, the highest survival rate was seen in blastocysts vitrified in EG + DMSO (83.3%). The survival rate was not significantly different from that of the control (88%). Blastocysts cryopreserved with glycerol in all groups had an overall low survival rate of 43.5%. Survival rate of mouse blastocysts between vitrification apparatuses showed higher in cryoloop.
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문제 정의
본 연구의 목적은 다양한 유리화 용액과 동결 기구에서 유리화 동결된 쥐의 포배기 배아의 융해 후 생존율을 비교 연구하는 것이다. 2세포기 배아를 채취하여 체외에서 72시간 배양하여 얻은 생쥐 포배기 배아를 (i) 동결처리 하지 않은 군(대조군) (ii) 여러 동결보호제를 처리 한 군 (iii) 여러 동결 기구를 사용한 군으로 각각 나누어 조사하였다.
현재까지 융해 후 생존율과 동결배아의 발생률 및 발달의 최적 조건을 찾기 위한 연구가 더 필요한 형편이다. 이에 저자들은 배아의 생존율을 증진하기 위한 방편으로 여러 유리화 동결용액과 유리화 동결기구를 적용하여 생쥐 포배기 배아를 동결 융해하여 생존율을 비교 연구하고 이 중 성적이 좋은 것을 임상에 적용하고자 본 연구를 시행하였다.
제안 방법
본 연구의 목적은 다양한 유리화 용액과 동결 기구에서 유리화 동결된 쥐의 포배기 배아의 융해 후 생존율을 비교 연구하는 것이다. 2세포기 배아를 채취하여 체외에서 72시간 배양하여 얻은 생쥐 포배기 배아를 (i) 동결처리 하지 않은 군(대조군) (ii) 여러 동결보호제를 처리 한 군 (iii) 여러 동결 기구를 사용한 군으로 각각 나누어 조사하였다. 유리화 동결 보존액은 40% ethylene glycol (EG) + 5.
, 1'Aigle, France)를 이용하여 유리화 동결 및 융해하였다. 2) Electron microscope (EM) grid: EM grid (400 mesh copper, IGC 400; Pelco International, CA, USA)를 이용하여 유리화 동결 및 융해하였다. 3) Cryoloop: Cryoloop(Hampton Research Laguna Niguel, CA, USA)의 stainless steel tube는 한쪽이 1.
본 연구는 여러 가지 동결보호제를 혼합 합성하여 만든 동결액을 사용하여 생쥐 포배기 배아를 유리화 동결하였다. 20%EG + 20%DMSO (ED) 용액에서 동결한 결과 부화율이 83.
생쥐 포배기 배아를 가장 높은 부화율을 보인 ED용액을 이용하여 각 동결보존용기에서 동결 및 융해한 후 배양하여 부화율을 비교 조사 하였다. EM grid에 동결하고 융해한 후 배양액에서 배양했을 때의 부화율은 72.
생쥐 포배기 배아를 각 유리화 동결액에서 동결 및 융해한 후 배양하여 부화율을 비교 조사하여 보았다. 2세포기의 생쥐 배아를 체외에서 72시간 배양하여 얻은 포배기 배아를 다시 24시간 계속 배양하여 부화한 포배기의 부화율을 대조군으로 하였으며 20% EG용액에서 1분 두어 전평형 시킨 후 40%EG + 5.
2세포기 배아를 채취하여 체외에서 72시간 배양하여 얻은 생쥐 포배기 배아를 (i) 동결처리 하지 않은 군(대조군) (ii) 여러 동결보호제를 처리 한 군 (iii) 여러 동결 기구를 사용한 군으로 각각 나누어 조사하였다. 유리화 동결 보존액은 40% ethylene glycol (EG) + 5.8 mg/ml ficoll + 0.5M sucrose (EFS 용액), 3M glycerol + 3M EG (GE 용액), 20% EG + 20% dimethyl sulfoxide (ED 용액), 3M EG + 1.0M sucrose (ES 용액)에서 동결보존 및 융해 후 배아 생존율을 비교 조사하였으며, 동결기구는 closed plastic straw (CPS), electron microscope (EM) grid, Cryoloop, open pulled straw (OPS), plastic straw내에 든 glass micropipette를 5군으로 나누어 동결보존 및 융해 후의 배아 생존율을 비교 조사하였다. 대조군의 배아 생존율은 88.
유리화 동결은 20% SSS (serum substitute supplement, Irvine Scientific)가 함유된 D-PBS (Dulbeco's phosphate buffered saline, GIBCO)를 기본배양액으로 사용하여 4종류의 유리화 동결보존액을 아래와 같이 만들었다.
전평형 용액(equliblium solution, ES)는 20% EG에서 1분 동안 처리했으며, 유리화 동결 용액(vitrification solution, VS)는 40% EG + 5.8%mg/mL ficoll + 0.5M sucrose로 구성되며 30초 이내에 각 동결보존기구에 담아 액체질소에 침지하여 보관하였다.
제 1일에 생쥐 암컷의 난포성장을 촉진시키기 위해 6~8주 된 흰 생쥐의 복강 내에 PMSG(pregnant mare's serum gonadotropin; Sigma, St. Louis, MO, USA) 5 IU를 주사 후 48시간 뒤에 hCG (human chorionic gonadotropin; Sigma, St. Louis, MO, USA) 5 IU를 다시 복강 내 주사하여 암수를 합사시켰으며, 제 4일에 질 점액전(vaginal plug)이 확인되면 교미가 이루어진 것으로 간주하였다.
포배기 배아를 동결하지 않고 G2,2 배양액에서 계속 배양하여 부화(hatching)에 도달한 배아를 대조군으로 삼아 발달율을 구하였다.
대상 데이터
Louis, MO, USA)이 들어있는 배양접시에 옮긴 후 해부현미경하에서 30-gauge 주사바늘을 이용하여 배양액을 주입하여 난관을 씻어 냄으로써 배아를 채취하였다. 난할이 일어난 정상적이고 건강한 2 세포기 배아만을 골라 72시간 배양하여 포배기에 도달한 배아를 동결에 사용하였다.
4% BSA(bovine serum albumin, Sigma)를 첨가하여 배아채취에 필요한 배양액으로 사용하였다. 배아 배양액은 G2,2 (Vitrolife, Gothenburg, Sweden)에 HSA 용액 (human serum albumin solution, Vitrolife)를 5% 섞어서 사용하였다.
배아채취 배양액인 Ham's F-10 배양액에 0.4% BSA(bovine serum albumin, Sigma)를 첨가하여 배아채취에 필요한 배양액으로 사용하였다.
실험동물은 물과 사료를 자유롭게 섭식시켜 사육한 ICR계 흰 생쥐를 사용하였다. 제 1일에 생쥐 암컷의 난포성장을 촉진시키기 위해 6~8주 된 흰 생쥐의 복강 내에 PMSG(pregnant mare's serum gonadotropin; Sigma, St.
제 5일에 교미가 일어난 암컷으로부터 난관을 무균적으로 절취하여 기본배양액인 Ham's F-10 배양액(Sigma, St. Louis, MO, USA)이 들어있는 배양접시에 옮긴 후 해부현미경하에서 30-gauge 주사바늘을 이용하여 배양액을 주입하여 난관을 씻어 냄으로써 배아를 채취하였다.
데이터처리
유의성 검정은 Student t test를 이용하였고 P < 0.01, P < 0.05를 통계적으로 의미 있다고 하였다.
성능/효과
01). 10% EG + 10% DMSO에 포배기배아를 1분 전평형 시킨 후 유리화동결보존액인 20%EG + 20%DMSO (ED용액)에 옮겨 20초 이내에 동결기구에 담아 액체질소에 침지하고 동결보존한 후 융해하였을 때에는 83.3%의 높은 부화율을 보였다. 포배기 배아를 1.
본 연구는 여러 가지 동결보호제를 혼합 합성하여 만든 동결액을 사용하여 생쥐 포배기 배아를 유리화 동결하였다. 20%EG + 20%DMSO (ED) 용액에서 동결한 결과 부화율이 83.3%로 높았으며, 다른 동결보존액인 40% EG + 5.8 mg/ml Ficall + 0.5M sucrose (EFS), 3M EG + 1.0M sucrose (ES) 용액에서 동결 융해한 결과 ED 만큼 높은 부화율을 보이지는 못하였으나 각각 70.8%, 65.2%의 부화율을 얻을 수 있었다. 이상의 결과는 포배기에서부터 부화기까지의 비율은 Ali 등(1)의 97.
3) Cryoloop: Cryoloop(Hampton Research Laguna Niguel, CA, USA)의 stainless steel tube는 한쪽이 1.8 mL cryovial 뚜껑에 고정되어 있고, 다른 한 쪽 끝에는 20 µm nylon filament가 0.7~1.0 mm 직경으로 달려있다.
CPS, EM grid, Cryoloop, OPS, GPS 등 동결 기구를 이용한 생쥐 포배기 배아의 동결보존 및 융해 후 배아 생존율은 각각 56.5% (P < 0.01), 72.7%, 83.3%, 60.9% (P < 0.05), 54.2% (P < 0.01) 였다.
EFS, GE, ED, ES 등 유리화 동결보존액에서의 생쥐 포배기 배아의 동결보존 및 융해 후 부화까지의 배아 생존율은 각각 70.8%, 43.5% (P < 0.01), 83.3%, 65.2% 이었다.
01). 각 동결기구에 따른 유리화 동결의 효과를 비교 검토한 결과 OPS, CPS, GPS 군에서 통계적으로 유의하게 낮은 부화율을 보였고, EM grid군과 Cryoloop군에서는 높은 부화율을 보였다(Table 2). 특히 Cryoloop는 대조군에 비해서는 낮지만 다른 군보다 상대적으로 높은 부화율을 보였다.
각각의 동결보존액에서 유리화 동결 · 융해 후의 부화율을 비교하여 보면 GE용액에서 통계적으로 유의하게 낮은 부화율(P < 0.01)을 보였고 EFS, ED, ES 용액에서는 높은 부화율을 보였다(Table 1).
결론적으로 생쥐 배반포를 동결 및 융해하고 배양한 후 부화율은 ED를 유리화 동결액으로 사용했을 때 좋은 성적을 보였으며, Cryoloop를 동결기구로 사용 시 보다 좋은 성적을 보여, 손이 많이 가고 세심하고 조심스럽게 숙련된 기술로 다루어야 하는 EM grid에 비해 사용이 간편하면서도 효과가 좋은 동결기구로 생각되어 이의 사용이 권장 되며, 또한 아직 감염은 보고되지 않았지만 액체질소에 직접 침지할 때에 비폐쇄성 도구(EM grid, Cryoloop, OPS)는 감염의 위험성이 있기 때문에 액체질소에 직접 침지하지 않는 폐쇄성 동결기구(CPS, GPS)를 만들기 위해 노력해 보았으나 직접 침지하는 것보다 시간이 더 걸리고 아직은 성적이 저조하여 더 많은 노력과 함께 효율적인 기구를 찾아야 할 것으로 보인다. 또한 동결보존액의 조합과 동결농도와 노출시간 및 노출 단계, 적절한 세포시기 등의 보완 연구가 이루어질 때 배아 생존율을 증진 할 수 있는 최적의 동결과 융해 조건이 이루어 질 것으로 사료 된다.
01) 였다. 동결보존액과 동결 기구를 사용한 유리화 동결 생쥐 포배기 배아의 생존율은 동결보존액으로 ED 유리화 동결보존액에서 동결 및 융해 했을 때, 또한 Cryoloop를 동결 기구로 이용할 때 가장 높았다.
본 연구에서는 특히 Cryoloop를 이용하였을 때 부화율이 가장 높았으며 이는 간편하면서도 사용하기 손쉽기 때문이 아닌가 생각된다.
2%의 부화율을 얻을 수 있었다. 이상의 결과는 포배기에서부터 부화기까지의 비율은 Ali 등(1)의 97.5%의 부화율과는 상당한 차이를 보이는데 이는 실험동물의 종류, 동결과 융해의 방법 및 노출시간, 배아 발생시기 및 발달단계 등의 차이 때문인 것으로 보인다.
포배기 배아를 1.5M glycerol + 1.5M EG에 넣어 1분, 3M glycerol + 3M EG (GE용액)에 넣어 20초 이내에 동결 기구에 담아 액체질소에 침지하고 동결 보존한 후 융해하였을 때에는 43.5%의 낮은 부화율을 보였다(P < 0.01).
후속연구
결론적으로 생쥐 배반포를 동결 및 융해하고 배양한 후 부화율은 ED를 유리화 동결액으로 사용했을 때 좋은 성적을 보였으며, Cryoloop를 동결기구로 사용 시 보다 좋은 성적을 보여, 손이 많이 가고 세심하고 조심스럽게 숙련된 기술로 다루어야 하는 EM grid에 비해 사용이 간편하면서도 효과가 좋은 동결기구로 생각되어 이의 사용이 권장 되며, 또한 아직 감염은 보고되지 않았지만 액체질소에 직접 침지할 때에 비폐쇄성 도구(EM grid, Cryoloop, OPS)는 감염의 위험성이 있기 때문에 액체질소에 직접 침지하지 않는 폐쇄성 동결기구(CPS, GPS)를 만들기 위해 노력해 보았으나 직접 침지하는 것보다 시간이 더 걸리고 아직은 성적이 저조하여 더 많은 노력과 함께 효율적인 기구를 찾아야 할 것으로 보인다. 또한 동결보존액의 조합과 동결농도와 노출시간 및 노출 단계, 적절한 세포시기 등의 보완 연구가 이루어질 때 배아 생존율을 증진 할 수 있는 최적의 동결과 융해 조건이 이루어 질 것으로 사료 된다.
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