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문제 정의
- 농업과학기술원 응용미생물과에 보존되어 있는 균주는 외국에서 도입되었거나 국내에서 수집된 버섯에서 분리한 균주들로 수집 당시 자실체의 형태적인 특징만으로 동정하여 보존하는 경우가 많았고, 외국에서 들여오는 균주, 또한 확인되거나 인증된 기관의 균주들이 아닌 출처가 명확하지 않은 균주가 많았다. 따라서 본 연구는 보존되어 있는 겨울우산버섯(Polyporus)속의 rDNA ITS 영역의 염기서열을 분석하여 이들 균주들의 분류학적 위치와 계통분류학적인 유연관계를 분석하고 RAPD분석에 의한 유전적 다형성을 조사한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 각 균주로부터 추출한 염색체 DNA에서 rDNA의 ITS(internal transcribed spacers)영역을 증폭하기 위하여 ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3’)과 ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)의 universal primers를 사용하였다(White 등, 1990). PCR 증폭은 15ng의 genomic DNA, 각 0.5 pmol의 primer, 200㎛ dNTP, 2.5 unit의 Taq DNA polymerase, 10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2에 증류수를 첨가하여 최종 volume을 30㎕로 하였다. DNA 증폭은 initial denaturation을 94℃에서 2분간 실시하고, denaturation 40초(94℃), annealing 1분(58℃), extension 1분(72℃)으로 30cycle을 반응시키고 마지막으로 72℃에서 5분간 incubation 하였다.
- PCR은 94℃에서 4분간 pre-heating시킨 다음, 94℃ 1분간 denaturation, 55℃에서 40초간 annealing, 72℃에서 2분 동안 extension을 1cycle로 하여 총 40cycles를 반응시킨 후 4℃에서 유지하였다. PCR산물은 1.2% agarose gel에서 90 volt로 loading한 후 UV transilluminator lamp상에서 밴드를 관찰하였다.
- Polyporus속 균주로부터 염색체 DNA 추출은 PDA배지(potate dextrose agar)에서 7일간 배양한 균사체를 수확하여 동결건조한 후 소량을 2㎖ 튜브에 넣고 마쇄한 뒤 1㎖ CTAB solution 〔2% CTAB(w/v), 100mM Tris-HCl(pH 8.0), 20mM EDTA(pH 8.0), 1.4 M NaCl, 1% PVP(polyvinylpyrrolidone)에 현탁한 후 60℃에서 40분 동안 반응시켰다. 반응 후 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 Rnase와 Proteinase K 50㎍을 첨가 후 37℃에서 40분간 반응시켰다.
- Polyporus속으로 동정된 균주들에 대한 분류학적위치 및 유전학적인 유연관계 분석을 위하여 계통수를 그려 이들 사이의 유연관계를 확인해 보았다(Fig. 2). 분석결과 P.
- 보존중인 구멍장이버섯속에 대한 온도, pH, 배지종류 등에 따른 배양적 특성과 균사의 생육모양, 균총의 색깔 등을 조사하여 2가지 이상 균주가 섞여 오염된 균주는 실험에서 제외 시켰다(자료생략). 이들 실험 균주 중 Polyporus속으로 동정된 균주를 선발하여 배양적 및 형태적 특성을 조사하여 비슷한 균주별로 그룹화한 다음 rDNA의 ITS 영역을 증폭하여 염기서열을 결정하였다. 그 결과 보존당시 균주의 학명과 염기서열분석에 따른 학명과는 많은 차이를 보였으며, 균사의 모양 및 색깔에도 많은 차이를 보였다(Fig.
- 실험에 사용한 균주들의 계통분석을 위하여 ITS 1과 ITS 4 프라이머를 이용하여 rDNA의 ITS 영역을 증폭한 결과 600~700 bp 정도의 증폭 산물을 얻었다. 이들 염기서열을 바탕으로 GenBank에 상동성을 조사하였다. 보존균주 목록과 염기서열 분석을 통한 동정결과에서 종이 다른 균주가 3균주, 학명이 완전히 다른 균주가 4균주로 전체의 53.
- DNA 증폭은 initial denaturation을 94℃에서 2분간 실시하고, denaturation 40초(94℃), annealing 1분(58℃), extension 1분(72℃)으로 30cycle을 반응시키고 마지막으로 72℃에서 5분간 incubation 하였다. 증폭된 DNA는 1.5% agarose gel에서 전기영동을 하여 확인 후 sequencing을 수행하였다. 균주간 유연관계 분석을 위한 염기서열의 분석은 ClustralW 분석프로그램(Thompson 등, 1994)을 사용하였다.
대상 데이터
- 다형성 분석을 위하여 각각의 균주에서 추출한 염색체 DNA를 RAPD-PCR 방법을 이용하여 증폭하였다(Williams 등, 1990). Primer(20 mer)는 시제품으로 PELF을 구입하여 사용하였다. PCR은 94℃에서 4분간 pre-heating시킨 다음, 94℃ 1분간 denaturation, 55℃에서 40초간 annealing, 72℃에서 2분 동안 extension을 1cycle로 하여 총 40cycles를 반응시킨 후 4℃에서 유지하였다.
- 각 균주로부터 추출한 염색체 DNA에서 rDNA의 ITS(internal transcribed spacers)영역을 증폭하기 위하여 ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3’)과 ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)의 universal primers를 사용하였다(White 등, 1990).
- 본 시험에 사용한 균주는 2006년 농업과학기술원 응용미 생물과에 보존하고 있는 Polyporus속으로 동정된 13균주를 사용하였다(Table 1, Table 2). 균주의 배양은 PDA(Potato Dextrose Agar, Difco)을 사용하였고, 25℃의 항온기에서 약 15일간 배양하였다. 시험균주 멸균증류수 튜브에 옮겨 상온에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 본 시험에 사용한 균주는 2006년 농업과학기술원 응용미 생물과에 보존하고 있는 Polyporus속으로 동정된 13균주를 사용하였다(Table 1, Table 2). 균주의 배양은 PDA(Potato Dextrose Agar, Difco)을 사용하였고, 25℃의 항온기에서 약 15일간 배양하였다.
데이터처리
- 5% agarose gel에서 전기영동을 하여 확인 후 sequencing을 수행하였다. 균주간 유연관계 분석을 위한 염기서열의 분석은 ClustralW 분석프로그램(Thompson 등, 1994)을 사용하였다. Jukes와 Cantor(1969)방법을 이용하여 evolutionary distance matrix를 작성하고, MEGA 4의 Neighbor-joining 방법을 이용하여 계통수를 작성하였으며, tree의 안정성은 1000 반복의 bootstrap 분석으로 조사하였다.
이론/모형
- 균주간 유연관계 분석을 위한 염기서열의 분석은 ClustralW 분석프로그램(Thompson 등, 1994)을 사용하였다. Jukes와 Cantor(1969)방법을 이용하여 evolutionary distance matrix를 작성하고, MEGA 4의 Neighbor-joining 방법을 이용하여 계통수를 작성하였으며, tree의 안정성은 1000 반복의 bootstrap 분석으로 조사하였다.
- 다형성 분석을 위하여 각각의 균주에서 추출한 염색체 DNA를 RAPD-PCR 방법을 이용하여 증폭하였다(Williams 등, 1990). Primer(20 mer)는 시제품으로 PELF을 구입하여 사용하였다.
성능/효과
- tuberaster종들간에는 99%의 상동성을 보였다. P. arcularius그룹은 P. alveolarius그룹과는 86~88%의 상동성을 보였고, P. tuberaster 그룹과는 86~87%의 비교적 낮은 상동성을 보였다. P.
- 4와 같다. P. arcularius종들은 99~100%, P. alveolarius 종들는 97~100%, P. tuberaster종들간에는 99%의 상동성을 보였다. P.
- tuberaster 그룹과는 86~87%의 비교적 낮은 상동성을 보였다. P. squamosus그룹인 PM04균주는 P. alveolarius 그룹과는 84~86%의 상동성을 보였고, P. tuberaster그룹과는 84~86%의 상동성을 보였지만 P. arcularius그룹과는 81%의 아주 낮은 상동성을 보였다. 그리고 P.
- tuberaster균주들 간에는 아주 다른 밴드 패턴을 보였다. PM07과 PM13 균주는 보존목록에서는 P. squamosus와 Cerrena unicola로 분류되어 있으나, 염기 서열에 의한 상동성 분석 결과 P. tuberaster로 밝혀졌으며, RAPD분석에서도 같은 밴드패턴을 보였다. 또한 한국에서 수집된 PM02균주와 일본에서 수집한 PM05균주는 염기 서열에 의한 상동성 분석 결과 동일한 P.
- 8%를 차지하였다. 국내에서 수집한 Polyporus속은 P. tuberaster, P. arcularius, P. squamosus, P. brumalis, P. alveolarius 등 5개 종으로 동정되었고, 미국에서 수집한 2균주(PM10, PM11)는 P. arcularius와 P. alveolarius로 동정되었다(Table 2). 이와 같이 균주를 수집하여 보존할 때 정확한 동정이 이루어지지 않았고, 수집자의 기록에만 의존하여 보존하였기 때문에 발생한 문제라 판단된다.
- 8%를 차지하였다. 국내에서 수집한 Polyporus속은 경우 P. alveolarius, P. brumalis, P. squamosus, P. tuberaster, P. arcularius 등 5개 종으로 동정되었고, 미국에서 수집한 균주는 P. alveolarius와 P. arcularius로 동정되었다. 그리고 일본에서 수집한 균주는 P.
- 이들 실험 균주 중 Polyporus속으로 동정된 균주를 선발하여 배양적 및 형태적 특성을 조사하여 비슷한 균주별로 그룹화한 다음 rDNA의 ITS 영역을 증폭하여 염기서열을 결정하였다. 그 결과 보존당시 균주의 학명과 염기서열분석에 따른 학명과는 많은 차이를 보였으며, 균사의 모양 및 색깔에도 많은 차이를 보였다(Fig. 1). 따라서 수집 당시 정확한 동정을 통하여 균주를 분리하여 보존하지 않았을 경우 균주의 생육, 형태 및 색깔 등 통하여 같은 종으로 분류하는 것은 어렵다고 생각된다.
- arcularius그룹과는 81%의 아주 낮은 상동성을 보였다. 그리고 P. brumalis그룹인 PM06균주는 P. alveolarius그룹과는 86~88%의 상동성을 보였고, P. tuberaster그룹과는 88%의 상동성을 보였으며, P. arcularius그룹과은 96~97%의 비교적 높은 상동성을 보였다. 또한 P.
- brumalis와 아주 가까운 유연관계를 보였다. 그리고 PM03 등 4균주(PM03, PM08, PM10, PM12)는 P. alveolarius, PM01 등 3균주(PM01, PM07, PM13)는 P. tuberaster와 같은 그룹에 속하며 유연관계도 가까웠으며, PM04 균주는 P. squamosus와 같은 그룹에 속하며 유연관계도 가까운 것으로 분석되었다. 또한 여러 Polyporus 종들 간의 유사도와 evolutionary distance는 Table 2에서 나타내었으며, 결과는 유전적인 유연관계분석과 유사한 경향을 보였다.
- arcularius로 동정되었다. 그리고 일본에서 수집한 균주는 P. arcularius로 동정되었다. RAPD 분석을 통한 유전적인 다형성 조사에서 Polyporus속간에는 완전히 다른 밴드 패턴을 보였지만 같은 종내에서는 비슷한 밴드 패턴을 보였다.
- arcularius그룹과은 96~97%의 비교적 높은 상동성을 보였다. 또한 P. squamosus그룹인 PM04균주와 P. brumalis그룹인 PM06균주는 아주 낮은 81%의 상동성을 보였다. 이와 같이 이들 종들간의 동정을 위해서는 보다 다양한 유전자 분석을 통한 보다 정확한 동정이 이루어져야 할 것으로 판단된다.
- tuberaster로 밝혀졌으며, RAPD분석에서도 같은 밴드패턴을 보였다. 또한 한국에서 수집된 PM02균주와 일본에서 수집한 PM05균주는 염기 서열에 의한 상동성 분석 결과 동일한 P. arcularius로 동정되었지만, RAPD분석에서는 서로 다른 밴드패턴을 보였다. 따라서 이들에 대해서는 보존균주의 오염여부와 자실체 유전자와의 상동성에 대한 검토가 필요할 것으로 생각된다.
- 보존중인 Polyporus속 균주를 선발하여 배양 및 형태적 특성을 조사하여 비슷한 균주별로 그룹화하여 rDNA의 ITS 영역을 증폭하여 염기서열을 결정한 결과 보존시 균주의 학명과 많은 차이를 보였으며, 균사의 모양 및 색깔에도 많은 차이를 보였다. 보존 당시 동정한 결과와 rDNA의 ITS 영역의 염기서열 분석을 통한 결과를 비교한 결과 종이 다른 균주가 3균주와 학명이 다른 균주가 4균주로 전체의 53.8%를 차지하였다. 국내에서 수집한 Polyporus속은 경우 P.
- 이들 염기서열을 바탕으로 GenBank에 상동성을 조사하였다. 보존균주 목록과 염기서열 분석을 통한 동정결과에서 종이 다른 균주가 3균주, 학명이 완전히 다른 균주가 4균주로 전체의 53.8%를 차지하였다. 국내에서 수집한 Polyporus속은 P.
- 보존중인 Polyporus속 균주를 선발하여 배양 및 형태적 특성을 조사하여 비슷한 균주별로 그룹화하여 rDNA의 ITS 영역을 증폭하여 염기서열을 결정한 결과 보존시 균주의 학명과 많은 차이를 보였으며, 균사의 모양 및 색깔에도 많은 차이를 보였다. 보존 당시 동정한 결과와 rDNA의 ITS 영역의 염기서열 분석을 통한 결과를 비교한 결과 종이 다른 균주가 3균주와 학명이 다른 균주가 4균주로 전체의 53.
- 2). 분석결과 P. alveolarius, P. brumalis, P. squamosus, P. tuberaster, P. arcularius 등 5개의 분류군으로 이루어졌으며, PM02 등 4 균주(PM02, PM05, PM09, PM11)는 P. arcularius, PM06은 P. brumalis와 아주 가까운 유연관계를 보였다. 그리고 PM03 등 4균주(PM03, PM08, PM10, PM12)는 P.
- 3과 같다. 분석결과 P. arcularius, P. brumalis 그리고 P. tuberaster균주들 간에는 아주 다른 밴드 패턴을 보였다. PM07과 PM13 균주는 보존목록에서는 P.
- 이 부위의 염기서열 분석 자료는 mt-DNA등과 함께 최근 균류의 계통분류에 널리 사용되고 있다(박 등, 1999; Kim 등, 2000). 실험에 사용한 균주들의 계통분석을 위하여 ITS 1과 ITS 4 프라이머를 이용하여 rDNA의 ITS 영역을 증폭한 결과 600~700 bp 정도의 증폭 산물을 얻었다. 이들 염기서열을 바탕으로 GenBank에 상동성을 조사하였다.
- 이와 같이 이들 종들간의 동정을 위해서는 보다 다양한 유전자 분석을 통한 보다 정확한 동정이 이루어져야 할 것으로 판단된다. 한편 미국(PM11), 일본(PM05), 한국(PM02, PM09)에서 수집된 P. arcularius종들간에는 99~100%의 높은 상동성을 보였고, 미국에서 수집된 PM10균주는 전남에서 수집된 PM12균주와는 100%의 상동성을 보였지만 제주에서 수집된 PM03균주와는 97%의 상동을 보였다. 따라서 서식지별 유전적인 다양성에서 약간의 차이를 발견할 수 있었으며, 이에 대해서는 보다 많은 개체의 분석을 통한 면밀한 연구가 이루어 져야 할 것으로 판단된다.
후속연구
- Krüger와 Gargas(2004)는 예전의 분자적인 유연관계 분석에서 Polyporus와 Lentinus는 아주 가깝게 연관 되어 주름이 있는 자실층탁에의해 구별할 수 있다고 하였고, Singer(1986)는 Lentinus 종은 해부상의 특징과 자실체의 발달에 기초해서 polyporoid 조상으로부터 유래한다고 하였다. 따라서 국내에 자생하고 있는 Polyporus 종들간의 유전적인 유연관계 뿐아니라 Lentinus 종과의 관련성에 대해서도 면밀한 연구가 이루어져야 할 것으로 판단된다.
- alveolarius 등 5개의 분류군으로 나누어졌으며, ITS부위 유전자수준의 상동성 분석에서도 비슷한 경향을 보였다. 따라서 기존 목록과 완전히 다른 속으로 동정된 균주들에 대해서는 계통분류학적인 유연관계 분석과 보존중인 자실체 유전자와의 상동성을 비교하여 기존 목록의 학명을 재분류해야 할 것으로 판단된다.
- 이와 같이 균주를 수집하여 보존할 때 정확한 동정이 이루어지지 않았고, 수집자의 기록에만 의존하여 보존하였기 때문에 발생한 문제라 판단된다. 따라서 보존 목록과 완전히 다른 genus로 나타난 균주들에 대해서는 계통분류학적인 유연관계 분석과 보존중인 자실체 유전자와의 상동성을 비교하여 보존진균의 오염 여부를 판단하여 기존 목록의 학명을 재분류해야 할 것으로 판단된다.
- arcularius종들간에는 99~100%의 높은 상동성을 보였고, 미국에서 수집된 PM10균주는 전남에서 수집된 PM12균주와는 100%의 상동성을 보였지만 제주에서 수집된 PM03균주와는 97%의 상동을 보였다. 따라서 서식지별 유전적인 다양성에서 약간의 차이를 발견할 수 있었으며, 이에 대해서는 보다 많은 개체의 분석을 통한 면밀한 연구가 이루어 져야 할 것으로 판단된다.
- arcularius로 동정되었지만, RAPD분석에서는 서로 다른 밴드패턴을 보였다. 따라서 이들에 대해서는 보존균주의 오염여부와 자실체 유전자와의 상동성에 대한 검토가 필요할 것으로 생각된다.
- brumalis그룹인 PM06균주는 아주 낮은 81%의 상동성을 보였다. 이와 같이 이들 종들간의 동정을 위해서는 보다 다양한 유전자 분석을 통한 보다 정확한 동정이 이루어져야 할 것으로 판단된다. 한편 미국(PM11), 일본(PM05), 한국(PM02, PM09)에서 수집된 P.
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