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문제 정의
- 1 실험에서 사용한 암세포는 다양한 암유전자의 변이로 형질전환된 세포이므로 세포내의 어떤 유전자 변이로 인한 것인지, 세포증식 신호전달 과정의 어떤 경로가 에탄올의 세포증식 억제효과를 상쇄하는지 알 수 없으므로 이를 이해하는 것은 중요하다. 따라서 본 연구에서 정상적인 Rat-2 세포에 발암원성 H-rasV12나 K- rasV12로 형질전환 시킨 세포에서 에탄올의 세포증식 억제 효과를 조사하여 Ras단백질과의 상호관계를 알아보았다. Fig.
- 이러한 에탄올의 세포증식이나 세포 회복에 대한 억제효과는 잘 알려져 있으나, 암세포의 세포증식억제 효과에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서 에탄올의 여러 조직별 정상세포와 암세포의 세포증식억제 효과를 비교하였고, 발암원성 H-rasV12와 발암원성K-rasV12에 의해 형질 전환된 세포에서 세포증식과 DNA 합성을 관찰함으로써 에탄올에 의한 세포증식억제효과가 발암원성ras 유전자에 의한 암발생에는 어떤 영향을 미치는지를 조사하였다. 이번 실험결과에서 우리는 에탄올에 의해 세포증식 억제효과가 일반적인 정상세포에서는 작동하나 암세포 특히 ras 유전자 변이에 의한 세포의 증식에는 영향이 없음을 알 수 있었다.
- 2 mM)는 에탄올 처리 1시간 전에 처리하였고, 그 후에 에탄올(100 mM)을 처리하고 세포를 배양하였다. 에탄올에 의한 세포증식억제효과에 대한 항산화제의 효과를 알아보는 실험은 위와 같은 방법으로 진행하였다.
제안 방법
- 그 후에 발암원성 H-RasV12 protein (2 mg/ml)를 rat IgG (4 mg/ml)과 함께 MCF-12A세포에 미세주사하였다. MCF-12A 세포를 키운 3개의 coverslip에 coverslip당 평균 200개의 세포에 미세주사하였고, 이를 두 번 반복하였다. 따라서 미세주사 결과는 평균 1,200개의 세포에서 나온 결과이다.
- 이 세포를 미세주사하기 에탄올(100 mM)으로 4시간동안 처리하였다. 그 후에 발암원성 H-RasV12 protein (2 mg/ml)를 rat IgG (4 mg/ml)과 함께 MCF-12A세포에 미세주사하였다. MCF-12A 세포를 키운 3개의 coverslip에 coverslip당 평균 200개의 세포에 미세주사하였고, 이를 두 번 반복하였다.
- 다양한 조직 유래의 정상세포주와 암세포주를 배양하여 에탄올에 의한 세포증식억제 효과를 조사하였다(Fig. 1). 사용한 세포주를 분류하면, 유방세포주로는 사람의 정상세포인 MCF-12A와 대표적인 유방암세포 연구에 사용되는 MCF-7, SK-BR-3, T-47D에서의 에탄올의 효과를 비교하였고, 간세포는 정상세포인 Chang세포주와 간암세포인 HepG2세포를 비교하였고, 췌장세포로는 정상세포인 HIT-T12와 암세포인 MIA PaCa-2를 비교하였고, 신경세포에서는 정상세포인 RSC96과 암세포인 PC-12 및 Neuro-2a를 비교하였고, 폐세포로는 정상세포인 WI-38과 암세포인 HT-1080 및 A549 세포를 비교하였다.
- 미세주사된 세포를 찾기위해 세포에 같이 주사된 rat IgG를 FITC-labeled anti-rat IgG antibody로 염색하였다. 미세주사된 세포는 세포질의 FITC 염색으로 확인되고, DNA 합성은 핵의 TRITC 염색으로 확인되며, 에탄올이 발암원성 Ras에 의한 DNA 합성 유도에 대한 영향을 형광현미경으로 그 결과를 조사하였다.
- 미세주사된 세포는 anti-BrdU antibody로 면역염색하고, 그 후에 TRITC-conjugated anti-mouse igG antibody로 처리되었다. 미세주사된 세포를 찾기위해 세포에 같이 주사된 rat IgG를 FITC-labeled anti-rat IgG antibody로 염색하였다. 미세주사된 세포는 세포질의 FITC 염색으로 확인되고, DNA 합성은 핵의 TRITC 염색으로 확인되며, 에탄올이 발암원성 Ras에 의한 DNA 합성 유도에 대한 영향을 형광현미경으로 그 결과를 조사하였다.
- 1). 사용한 세포주를 분류하면, 유방세포주로는 사람의 정상세포인 MCF-12A와 대표적인 유방암세포 연구에 사용되는 MCF-7, SK-BR-3, T-47D에서의 에탄올의 효과를 비교하였고, 간세포는 정상세포인 Chang세포주와 간암세포인 HepG2세포를 비교하였고, 췌장세포로는 정상세포인 HIT-T12와 암세포인 MIA PaCa-2를 비교하였고, 신경세포에서는 정상세포인 RSC96과 암세포인 PC-12 및 Neuro-2a를 비교하였고, 폐세포로는 정상세포인 WI-38과 암세포인 HT-1080 및 A549 세포를 비교하였다. 그 결과, 공통적으로 정상세포에서는 에탄올에 의해 세포증식이 현저하게 억제되었고, 반면 암세포에서는 그 효과가 없음을 알 수 있었다.
- 세포미세주사법을 이용하여 발암원성 Ras에 의한 DNA 합성에 대한 에탄올의영향을 조사하기 위해 oncogenic H-RasV12를 정상유방 세포주인 MCF-12A세포에 주사하여 DNA합성은 아래와 같이 측정하였다 [19]. 요약하면, MCF-12A세포를 coverslip 위에서 배양한 후, serum-free DMEM으로 배양하여 세포주기를 정지시켰다.
- 에탄올의 증발을 최소화하기 위해서 parafilm으로 밀봉하였고, 이러한 처리는 원래의 세포증식이나 세포 morphology를 방해하지 않았다. 에타올을 처리한 세포는 trypsin으로 분리하고, 세포수는 tryphan blue staining을 통해 세포 숫자를 계산하였다. 항산화제인 N-acetylcysteine (1 mM), 4-methylpyrazole (1 mM), vitamin E (25 mM), trolox (0.
- 각 세포들은 여러 농도의 에탄올에서 37℃에서 배양하였고, 에탄올을 함유한 배지는 매일 교환하였다. 에탄올의 증발을 최소화하기 위해서 parafilm으로 밀봉하였고, 이러한 처리는 원래의 세포증식이나 세포 morphology를 방해하지 않았다. 에타올을 처리한 세포는 trypsin으로 분리하고, 세포수는 tryphan blue staining을 통해 세포 숫자를 계산하였다.
- Ras단백질외에도 활성산소가 에탄올의 세포증식억제 효과에 중요한 것으로 보고되어 왔다[10,15]. 우리는 다음으로 활성산소가 에탄올에 의한 세포증식억제효과와 어떤 관계가 있는지 알아보기 위해, 먼저 에탄올에 의한 활성산소의 형성을 조사하였고, Ras 형질전환 Rat-2 세포에서의 활성산소 형성을 조사하였다(Fig. 4A). 에탄올에 의해 대조군인 Rat-2 세포에서 활성산소 생성이 증가하였다.
- 정상세포에서 에탄올에 의해 증가한 활성산소가 세포증식 억제를 유도하는지를 조사하기 위해 free radical trapping agent를 사용하여 에탄올의 세포증식억제효과에 대한 영향을 조사하였다. 사용한 활성산소 억제제로서 free radical scavenger 인 N-acetylcysteine (NAC), CYP2E1 inhibitor인 4-methylpyrazole (4-MP), lipid peroxidation inhibitor인 vita-min E (Vit.
- 와 에탄올에 의한 세포증식억제 효과 사이의 관계를 직접적으로 확인하기 위해 우리는 세포미세주사기술을 적용했다. 정상유방세포인 MCF-12A세포의 세포주기를 정지시켜 DNA 합성을 억제시킨 후, 발암원성 발암원성 H-RasV12 단백질을 세포 내로 미세주사하고, 주입된 Ras단백질에 의한 세포증식을 위한 DNA합성에 대한 에탄올의 영향을 알아보았다(Fig. 3). 본 연구팀에 미세주사된 발암원성 H-RasV12 단백질은 농도의존적으로 DNA 합성을 촉진한다고 보고하였다[13].
- E인 trolox와 같은 항산화제를 사용하였다. 항산화제를 MCF-12A세포에 전처리 후, 에탄올을 처리하고 그 효과를 측정하였다(Fig. 4B). NAC와 4-MP는 효과적으로 에탄올에 의한 세포증식 억제효과를 방해하였다.
대상 데이터
- K Pai (Merck/Schering-Plough, Whitehouse Station, NJ)로부터 제공받았고, 이는 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM 배지에서 유지하였다. Bromodeoxyuridine (BrdU)과 mouse anti-BrdU antibody는 GE Healthcare Life Science (Piscataway, NJ)의 제품을 사용하였고, FITC-conjugated anti-rat IgG antibody는 Jackson Lab (Bar Harbor, ME)에서 제공받았다. 다른 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (Germany)에서 구입하였다.
- 5mM)을 만들어 -20℃에 보관하였고, 25 μM의 working 용액을 사용하였다. DCF의 형광광도는 형광마이크로 리더(Bio-Tek Instruments, Winooki, VT, USA)를 사용하여 excitation 파장은 485 nm, emission 파장은 530 nm에서 측정하였다.
- E), soluble Vit. E인 trolox와 같은 항산화제를 사용하였다. 항산화제를 MCF-12A세포에 전처리 후, 에탄올을 처리하고 그 효과를 측정하였다(Fig.
- 정상세포주와 암세포주들은 각 조직별로 American Tissue Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA)에서 구입하였고, ATCC에서 권하는 방법대로 각 배지에 배양하였다. H-rasV12-transformed Rat-2세포와 K-rasV12-transformed Rat-2세포 및 대조군 Rat-2 세포는 Dr. J.K Pai (Merck/Schering-Plough, Whitehouse Station, NJ)로부터 제공받았고, 이는 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM 배지에서 유지하였다. Bromodeoxyuridine (BrdU)과 mouse anti-BrdU antibody는 GE Healthcare Life Science (Piscataway, NJ)의 제품을 사용하였고, FITC-conjugated anti-rat IgG antibody는 Jackson Lab (Bar Harbor, ME)에서 제공받았다.
- Bromodeoxyuridine (BrdU)과 mouse anti-BrdU antibody는 GE Healthcare Life Science (Piscataway, NJ)의 제품을 사용하였고, FITC-conjugated anti-rat IgG antibody는 Jackson Lab (Bar Harbor, ME)에서 제공받았다. 다른 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (Germany)에서 구입하였다.
- 정상세포주와 암세포주들은 각 조직별로 American Tissue Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA)에서 구입하였고, ATCC에서 권하는 방법대로 각 배지에 배양하였다. H-rasV12-transformed Rat-2세포와 K-rasV12-transformed Rat-2세포 및 대조군 Rat-2 세포는 Dr.
데이터처리
- The significance was determined by the ANOVA test (#p<0.05 and *p<0.01 vs. untreated control).
- The significance was determined by the ANOVA test (*p<0.01 vs. untreated control).
- The significance was determined by the ANOVA test (*p<0.05 vs. untreated and uninjected control; #p<0.05 vs. ethanol-treated and uninjected control).
- The significance was determined by the ANOVA test (*p<0.05 vs. untreated control; **p<0.05 vs. untreated Rat-2 control cells).
- 실험에서 얻어진 결과치는 ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(means±SE)로 표시하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검정은 Fischer’s Protected LSD post-hoc test로 하였다.
이론/모형
- 발암원성 ras V12와 에탄올에 의한 세포증식억제 효과 사이의 관계를 직접적으로 확인하기 위해 우리는 세포미세주사기술을 적용했다. 정상유방세포인 MCF-12A세포의 세포주기를 정지시켜 DNA 합성을 억제시킨 후, 발암원성 발암원성 H-RasV12 단백질을 세포 내로 미세주사하고, 주입된 Ras단백질에 의한 세포증식을 위한 DNA합성에 대한 에탄올의 영향을 알아보았다(Fig.
- 세포내 활성산소양의 측정은 2,7-dichlorohydrofluerescence(H2DCFDA)가 형광을 나타내는 2,7-dichlorofluorescein(DCF)로 산화되는 측정법에 의해 조사하였다 [14]. 100% 에탄올에 H2DCFDA stock 용액(12.
성능/효과
- 따라서 본 연구에서 정상적인 Rat-2 세포에 발암원성 H-rasV12나 K- rasV12로 형질전환 시킨 세포에서 에탄올의 세포증식 억제 효과를 조사하여 Ras단백질과의 상호관계를 알아보았다. Fig. 2에서 보이는 바와 같이 에탄올은 parental Rat-2 세포의 증식을 농도의존적으로 억제했고, 이를 다른 세포주 연구와 비교해볼 때 유의성을 가진 것을 알 수 있었다. 반대로 형질변환된 H-ras나 K-ras 세포의 경우에는 에탄올 존재 하에서도 세포증식에는 특이한 영향이 없었다.
- 사용한 세포주를 분류하면, 유방세포주로는 사람의 정상세포인 MCF-12A와 대표적인 유방암세포 연구에 사용되는 MCF-7, SK-BR-3, T-47D에서의 에탄올의 효과를 비교하였고, 간세포는 정상세포인 Chang세포주와 간암세포인 HepG2세포를 비교하였고, 췌장세포로는 정상세포인 HIT-T12와 암세포인 MIA PaCa-2를 비교하였고, 신경세포에서는 정상세포인 RSC96과 암세포인 PC-12 및 Neuro-2a를 비교하였고, 폐세포로는 정상세포인 WI-38과 암세포인 HT-1080 및 A549 세포를 비교하였다. 그 결과, 공통적으로 정상세포에서는 에탄올에 의해 세포증식이 현저하게 억제되었고, 반면 암세포에서는 그 효과가 없음을 알 수 있었다. 또한 일반적인 세포 연구에 많이 사용되는 신장 유래 세포인 CV-1, 근육세포인 L6, 지방세포인 3T3-L1에서도 동일하게 에탄올에 의해 세포성장이 억제 되었다.
- 또한 일반적인 세포 연구에 많이 사용되는 신장 유래 세포인 CV-1, 근육세포인 L6, 지방세포인 3T3-L1에서도 동일하게 에탄올에 의해 세포성장이 억제 되었다. 그 억제 정도는 조직별로 차이가 있으며, 신경세포에서 현저한 억제 효과가 관찰되었고, 유방세포에서는 그 효과 다소 약함을 알 수 있었다.
- 에탄올에 의해 간세포의 인슐린신호와 EGF신호 및 IGF-1신호에 의한 세포증식이 억제 되었고[7,22,30], 또한 본 연구팀은 인슐린에 의한 DNA 합성 유도를 에탄올이 억제하였고, 이는 에탄올에 의한 PI3-kinase 활성 억제와 관련이 있는 것을 보고하였다[28]. 그러나 본 연구결과에서는 발암원성 ras 유전자에 의한 세포증식은 에탄올이 억제하지 못하므로 에탄올에 의한 세포증식 억제 효과의 작용점은 ras 단백질 위에 존재하는 PI3-kinase의 작용을 억제하거나 또는 활성산소의 형성을 통해 발생하는 것으로 사료된다.
- 본 연구팀에 미세주사된 발암원성 H-RasV12 단백질은 농도의존적으로 DNA 합성을 촉진한다고 보고하였다[13]. 대조군으로 미세주입된 Rat IgG를 주입한 세포에서는 15%의 세포에서 DNA 합성이 일어났고, 발암원성 RasV12 단백질이 미세주입된 세포에서는 66%의 세포에서 DNA합성이 유도되었다. 에탄올을 전처리한 세포에 발암원성 H-Ras단백질를 미세주입한 세포에서는 58.
- MCF-12A 세포를 키운 3개의 coverslip에 coverslip당 평균 200개의 세포에 미세주사하였고, 이를 두 번 반복하였다. 따라서 미세주사 결과는 평균 1,200개의 세포에서 나온 결과이다. 미세주사한 세포의 생존율은 90% 이상이었다.
- Ras에 의한 암세포에서 활성산소의 생성능이나 역할은 세포 종류와 Ras isoform에따라 상반된 결과가 보고 되어 있다[23,26]. 본 실험에서는 Ras 에 의해 형질전환된 Rat-2 세포의 경우에서는 활성산소 생성이 증가된 것이 관찰되었다. 그러나 대조군 세포에서 관찰된 에탄올에 의한 활성산소의 생성이 이 Ras 형질전환세포에서는 관찰되지 않았다.
- 본 연구에서 우리는 에탄올의 세포증식 억제 효과가 정상 세포와 암세포에서 조사하여 차이가 있는 것을 알 수 있었다. 특히 ras 유전자 변이에 의한 발암원성에 의한 세포증식에는 에탄올이 세포증식이나 DNA합성을 방해하지 못 하는 것을알 수 있었다.
- 본 연구에서 사용한 세포 미세주사기술은 세포내 신호전달분자가 특정 세포 현상이나 호르몬과 같은 신호유발 인자에 관여하는지 여부를 직접적으로 보여주는 기술이다. 세포미세주사기술을 통해 활성화된 발암원성 RasV12단백질이 에탄올의 존재하에서도 DNA 합성을 정상적으로 유도함을 알 수 있는데, 이 결과는 발암원성 RasV12 단백질의 작용점이 에탄올에 의한 억제효과를 나타내는 작용점과 먼 곳에 존재하는 것으로 결론지을 수가 있다.
- E계열간의 작용 차이는 에탄올에 의해 형성된 활성산소 중 세포내 수용성 부위에 작용하는 것이 에탄올에 의한 세포증식 억제에 중요할 것으로 사료된다. 이러한 결과는 활성산소 형성이 에탄올에 의한 세포증식 억제효과에 중요한 역할을 하며, 활성산소의 형성 부위에 따라 다르게 작용한다는 것을 알 수 있다.
- 본 연구에서 에탄올의 여러 조직별 정상세포와 암세포의 세포증식억제 효과를 비교하였고, 발암원성 H-rasV12와 발암원성K-rasV12에 의해 형질 전환된 세포에서 세포증식과 DNA 합성을 관찰함으로써 에탄올에 의한 세포증식억제효과가 발암원성ras 유전자에 의한 암발생에는 어떤 영향을 미치는지를 조사하였다. 이번 실험결과에서 우리는 에탄올에 의해 세포증식 억제효과가 일반적인 정상세포에서는 작동하나 암세포 특히 ras 유전자 변이에 의한 세포의 증식에는 영향이 없음을 알 수 있었다.
- 최근 에탄올의 장기 투여에 의해 간암조직에서 H-ras의 변이를, 췌장암에서는 K-ras의 변이를 유도하는 것이 보고되었다[6,12]. 즉 에탄올에 의한 직접적인 ras 유전자의 변이를 통해 암발생을 유도할 뿐 아니라, 본 연구결과에 의하면 변이된 ras 유전자에 의한 세포증식도 억제하지 못하는 것을 알 수 있었다. 최근 Chavez 등[4]은 에탄올에 의해 간암 발생이 야기되며 정상적인 간세포의 증식은 억제하는 것이 쥐의 실험에서 보고하였다.
- 본 연구에서 우리는 에탄올의 세포증식 억제 효과가 정상 세포와 암세포에서 조사하여 차이가 있는 것을 알 수 있었다. 특히 ras 유전자 변이에 의한 발암원성에 의한 세포증식에는 에탄올이 세포증식이나 DNA합성을 방해하지 못 하는 것을알 수 있었다. 이 결과는 에탄올의 세포증식억제 효과의 작용 점이 Ras단백질의 upstream이거나 독립적인 경로를 통하는 것으로 알 수 있다.
후속연구
- 그러나 대조군 세포에서 관찰된 에탄올에 의한 활성산소의 생성이 이 Ras 형질전환세포에서는 관찰되지 않았다. 따라서 Ras로 형질전환된 세포의 경우에는 세포내 redox state의 변화가 야기되어 이미 세포가 높은 활성산소에 적응되어 증식되고 있기 때문에 에탄올에 의한 세포증식 억제 효과가 작용하지 않는 것으로 사료되나, 정확한 기전을 밝히기 위해서는 앞으로 추가적인 실험이 필요한 것으로 생각된다.
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