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문제 정의
- 따라서 본 연구는 연안해역에서 구리농도의 증가에 따라(Lee and Kim, 2000) 전복에 미치는 영향을 파악하기 위하여 hemolymph내의 무기, 유기 및 효소활성, hepatopancreas의 항산화 효소의 변화를 검토하였다.
제안 방법
- 흡광도 측정 후 28℃ 배양기에서 20분간 반응 시킨 후, 차가운 증류수를 넣어 반응을 정지시켰다. Hemolymph의 무기성분은 마그네슘(Mg)과 칼슘(Ca)을 측정하였다. Mg의 정량은 Xylidyl blue method, Ca은 OCPC (o-cresolphthaleincomplexon)법으로 비색 정량하였다.
- 실험은 환수식 방법에 의해 매일 새로운 용액으로 교환하였고, 수질분석을 실시하였다. 먹이는 매일 미역(Undaria pinnatifida)을 충분한 양으로 공급하며 4주 동안 실험을 실시하였다. 생화학적 분석은 시험시작 후 2주 및 4주에 실시하였다.
- 모든 실험은 항온실(20±1℃)에서 순치 시에 사용한 수조에서 동일공간을 사용하여 실시하였으며, 매주 구간별로 6미의 전복을 분석에 사용하였다.
- , Japan)를 이용하였다. 분리 보관중인 간췌장 상층액을 5의 배수로 희석하여 각 희석배수에 따른 inhibition rate를 구한 다음 spectrophotometer를 이용하여 450 nm에서 inhibition curve를 작성하고, inhibition curve에서 활성이 50% 억제되는 농도를 찾아 계산하였다. CAT활성도 측정은 H2O2를 기질로 사용하여 spectrophotometer에 의해 240 nm 파장에서 H2O2가 환원되어 감소하는 흡광도로서 효소 활성도의 단위는 1분간에 1 mg의 단백질이 반응하여 환원시킨 H2O2를 nmol로 나타내었다.
- 먹이는 매일 미역(Undaria pinnatifida)을 충분한 양으로 공급하며 4주 동안 실험을 실시하였다. 생화학적 분석은 시험시작 후 2주 및 4주에 실시하였다.
- 시험용액은 구리표준용액(copper standard solution) 1,000 mg/L을 이용하여 예비실험을 바탕으로 5, 10, 20, 및 40 µg/L로 설정하였다.
- 시험용액은 구리표준용액(copper standard solution) 1,000 mg/L을 이용하여 예비실험을 바탕으로 5, 10, 20, 및 40 µg/L로 설정하였다. 실험은 환수식 방법에 의해 매일 새로운 용액으로 교환하였고, 수질분석을 실시하였다. 먹이는 매일 미역(Undaria pinnatifida)을 충분한 양으로 공급하며 4주 동안 실험을 실시하였다.
- Mg의 정량은 Xylidyl blue method, Ca은 OCPC (o-cresolphthaleincomplexon)법으로 비색 정량하였다. 유기성분은 총 단백질(total protein)과 glucose를 측정하였다. 총 단백질은 Biuret법, glucose는 GOD법으로 측정하였다.
- 항산화효소는 간췌장을 적출하여 SOD (superoxide dismutase) 및 CAT (catalase)를 각각 분석하였다. 간췌장 부위를 적출 한 후 약 0.
- 총 단백질은 Biuret법, glucose는 GOD법으로 측정하였다. 효소는 aspartate aminotransferase (AST), alanine amiotransferase (ALT) 및 alkaline phosphatase (ALP)를 분석하였다. AST와 ALT는 Retiman-Frankel법, ALP는 Kind-king법을 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- SOD는 SOD Assay Kit-WST (Dojindo Co., Japan)를 이용하였다. 분리 보관중인 간췌장 상층액을 5의 배수로 희석하여 각 희석배수에 따른 inhibition rate를 구한 다음 spectrophotometer를 이용하여 450 nm에서 inhibition curve를 작성하고, inhibition curve에서 활성이 50% 억제되는 농도를 찾아 계산하였다.
- AST와 ALT는 Retiman-Frankel법, ALP는 Kind-king법을 이용하여 측정하였다. 각 측정에는 임상용 키트(Asan Pham. Co., Korea)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 전복(Haliotis discus hannai)은 제주도 소재의 양식장으로부터 분양받아 PVC(52×36×30 cm) 수조에서 10일간 순치하였고, 시험에는 외관상 건강한 개체(각장 50.44±3.0 mm, 전중 14.74±2.5 g)를 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과의 통계 처리는 SPSS 통계프로그램(version 12.0k)을 이용하여 ANOVA test를 실시한 후, 사후 검정은 다중 비교로 Duncan test를 사용하여 각 처리구 사이에 유의성(P<0.05)을 조사하였다(Zar, 1996).
이론/모형
- 효소는 aspartate aminotransferase (AST), alanine amiotransferase (ALT) 및 alkaline phosphatase (ALP)를 분석하였다. AST와 ALT는 Retiman-Frankel법, ALP는 Kind-king법을 이용하여 측정하였다. 각 측정에는 임상용 키트(Asan Pham.
- Hemolymph의 무기성분은 마그네슘(Mg)과 칼슘(Ca)을 측정하였다. Mg의 정량은 Xylidyl blue method, Ca은 OCPC (o-cresolphthaleincomplexon)법으로 비색 정량하였다. 유기성분은 총 단백질(total protein)과 glucose를 측정하였다.
- 6)를 도포된 주사기로 심장 옆의 혈관에서 채취 한 뒤, 1,200×g에서 10분간 원심분리 후 상층액에서 채취하여 -75℃에 보관하였다. Phenoloxidase의 활성은 Ashida and Soderhall (1984)을 이용하였다. 0.
- CAT활성도 측정은 H2O2를 기질로 사용하여 spectrophotometer에 의해 240 nm 파장에서 H2O2가 환원되어 감소하는 흡광도로서 효소 활성도의 단위는 1분간에 1 mg의 단백질이 반응하여 환원시킨 H2O2를 nmol로 나타내었다. 단백질 함량은 Bradford법을 이용한 Kit (Biorad. Co. Ltd., USA)를 사용했으며, 표준 단백질로서 BSA (bovine serum albumin)를 사용하여 spectrophotometer에서 540 nm로 측정하였다.
- 유기성분은 총 단백질(total protein)과 glucose를 측정하였다. 총 단백질은 Biuret법, glucose는 GOD법으로 측정하였다. 효소는 aspartate aminotransferase (AST), alanine amiotransferase (ALT) 및 alkaline phosphatase (ALP)를 분석하였다.
성능/효과
- AST와 ALT활성은 노출 4주째에 40 µg/L에서 유의한 증가를 보였으며(P<0.05), ALP 활성은 노출 4주째에 20 µg/L이상의 농도에서 유의한 증가를 나타냈다(P<0.05).
- CAT활성은 Cu의 노출기간과 노출 농도에 따라 보편적으로 상승하는 경향이 나타났으나, 유의한 활성의 증가는 2주 4주째에 40 µg/L 농도에서 확인되었다(P<0.05).
- 본 실험에서 역시 SOD의 활성이 증가하면서 발생된 과산화수소를 CAT가 분해하는 모습을 보여주고 있다. SOD의 활성 이후에 천천히 CAT의 활성이 증가하고 있으며, Cu 20 µg/L이상 2주째부터 유의성은 없으나 증가폭이 커짐을 확인할 수 있었다. 이는 SOD에서 CAT로 이어지는 단계적인 산화스트레스의 저하 시스템으로 가정할 수 있다.
- SOD활성은 Cu노출에 따라 증가하는 경향을 나타냈으며, 2주째부터는 20 µg/L이상의 농도에서 유의하게 증가하여 4주후에 40 µg/L농도에서 최대 활성을 나타냈다(P<0.05).
- SOD와 더불어 CAT의 활성은 SOD에 의해 전환된 과산화수소(H2O2)를 다시 산소(O2)와 물(H2O)로 전환시킨다(Forman and Fridovich, 1973). 본 실험에서 역시 SOD의 활성이 증가하면서 발생된 과산화수소를 CAT가 분해하는 모습을 보여주고 있다. SOD의 활성 이후에 천천히 CAT의 활성이 증가하고 있으며, Cu 20 µg/L이상 2주째부터 유의성은 없으나 증가폭이 커짐을 확인할 수 있었다.
- 전복의 SOD활성은 2주째부터 20 µg/L이상의 Cu농도에서 유의한 증가가 관찰되었다.
- 전복의 hemolymph의 무기성분인 마그네슘(Mg)에서는 모든 실험구간에서 유의적인 변화가 관찰되지 않았으며, 칼슘(Ca)에서는 20 µg/L의 농도에서부터 유의적인 감소가 나타났다.
- 결합조직을 구성하는 Hemolymph의 유기성분인 총 단백질 및 glucose 농도는 일반적으로 대사 과정에서 필수적인 요소로서 스트레스에 의한 체내의 방어 작용에서 사용되어 지기도 한다(Abdel-Moati, 1992). 전복의 hemolymph의 총 단백질과 glucose농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았지만, 고농도의 노출에서는 감소하는 경향을 나타냈다. 이는 다양한 방어 작용을 일으키는 과정에서 발생한 총 단백질 및 glucose 농도의 소모가 하나의 원인으로 생각할 수 있다.
후속연구
- 이상의 결과와 논의로부터 구리에 대한 전복의 hemolymph 내의 생리적 변동 및 hepatopancreas의 항산화효소의 활성의 변동은 연안 중금속 오염에 대한 모니터링의 수단으로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
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