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문제 정의
- 소아 알레르기 환자는 체계적인 관리와 더불어 소아의 특성에 적합한 치료가 중요하다. 이에 저자는 우리나라 각지에서 재배가 용이하고 藥性이 無毒하며 峻烈하지 않고 適用이 廣範圍한 장점이 있는 紫蘇葉을 선정하여 점막형 비만세포인 RBL-2H3 세포의 제 1형 알레르기 반응에 대한 즉시반응과 후기반응의 억제 효과를 조사하였다.
- 저자는 紫蘇葉 추출물이 알레르기 반응 조절에 미치는 영향을 확인하고자 RBL-2H3 세포를 이용하여 항알레르기 활성을 조사하여, 즉시반응을 유도하는 탈과립으로 인한 β-hexosaminidase 분비와 후기반응을 유도하는 사이토카인의 생산과 mRNA 발현 및 신호전달에 유의한 효과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Microplate reader(Molecular Devices Co. Ltd., USA)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 누출된 IL-4와 TNF-α의 양을 계산하였다.
- RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 48 well plate(Cornig, USA)에 5×104 cells/ml의 세포 수가 되도록 분주하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 24 시간 배양하였다. PF를 농도별 (0, 1, 2, 4, 8 및 10mg/ml)로 처리한 후 1시간 동안 반응시켰다. 배양액을 제거한 후 5mg/ml의 MTT를 각 well에 넣고 잘 섞어준 후 4시간 37℃ incubator에서 배양한 후 tetrazolium bromide salt를 제거하고 DMSO를 150 μl씩 분주하여 well에 생성된 formazin이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 평균값과 표준 편차를 구하였다.
- 1% Tween20)에 용해된 5% skim milk에 1시간 동안 실온에서 blocking한 후 anti-phospho-ERK(p-ERK)와 anti-ERK, anti-phospho-JNK(p-JNK)와 anti-JNK, anti-phospho-IκBα(p-IκBα)와 β-actin primary antibody(1:1000 dilution)로 4℃에서 overnight 반응한 후 TBST로 3회 세척하고, HRP-conjugated secondary antibody (1:1000 dilution)로 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후 ECL system (Amersham)을 이용하여 발색시켰다.
- RT-PCR은 one-step RT-PCR PreMix kit(iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 45℃에서 30분, 94℃에서 5분간 반응시킨 후 94℃에서 30초간 denaturation시키고, 55℃에서 30초간 annealing 시킨 다음, 72℃에서 1분간 extension시키는 cycle을 32회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72℃에서 5분간 PCR machine(GeneAmp, PCR system 9700, USA)에서 수행하였다. 각 PCR products는 2% agarose gel에 loading하여 100V 조건에서 30분간 전기영동을 통하여 분석하였다. 각각의 primer의 염기서열은 다음과 같다 (Table 1).
- 5μ g/ml)로 감작하고 37℃ 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 각 well의 세포들을 Siraganian buffer(119mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl2, 25mM PIPES, 40mM NaOH, pH7.2)로 2번 세척한 다음 각 well당 5.6mM glucose, 1mM CaCl2와 0.1% BSA가 포함된 Siraganian buffer를 첨가하였다. 그 후 PF(0, 5 및 10mg/ml)를 처리하여 1시간 동안 37℃ 5% CO2 incubator에서 배양한 후 DNP-HSA(10μg/ml)를 처리한 후 4시간 동안 반응시키고 ice bath에서 10분 동안 방치한 후 반응을 종결시켰다.
- 배양액을 제거한 후 5mg/ml의 MTT를 각 well에 넣고 잘 섞어준 후 4시간 37℃ incubator에서 배양한 후 tetrazolium bromide salt를 제거하고 DMSO를 150 μl씩 분주하여 well에 생성된 formazin이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 평균값과 표준 편차를 구하였다.
- 상층액을 분리하여 5,000rpm 에서 10분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 -70℃에 보관하였다가 IL-4와 TNF-α ELISA kit(BD Biosciences Pharmingen, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 새로운 DMEM배지로 교환한 후 PF를 농도별(0, 5 및 10㎎/㎖)로 세포에 처리하여 1 시간 동안 배양한 후 PBS로 2회 세척한 다음 DNP-HSA(10 μg/ml)을 1시간 동안 처리하여 면역반응을 유도하였다.
- 새로운 DMEM배지로 교환한 후 PF를 농도별(0, 5 및 10㎎/㎖)로 세포에 처리하여 1시간 동안 배양한 후 PBS로 2회 세척한 다음 DNP-HSA(10μg/ml)을 4시간 동안 처리하여 면역반응을 유도하였다.
- 알레르기 즉시반응의 지표인 탈과립에 대한 억제효과를 살펴보기 위하여 β-hexosaminidase의 분비를 측정하였다.
대상 데이터
- RBL-2H3(rat basophilic leukemia cell line)은 한국 세포주은행 (Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 분양 받아 배양하였다. 세포의 배양을 위하여 10% heat-inactivated FBS (Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin(Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM(Gibco BRL, USA) 배양액에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 紫蘇葉(Perillae Folium: PF)은 옴니허브(대구, 한국)에서 구입하여 사용하였다. PF 100g을 증류수로 水洗하여 1L의 75% Ethanol을 加하여 incubator (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Korea)에서 60℃, 90rpm 조건 하에서 24시간 동안 추출하였다.
- RBL-2H3(rat basophilic leukemia cell line)은 한국 세포주은행 (Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 분양 받아 배양하였다. 세포의 배양을 위하여 10% heat-inactivated FBS (Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin(Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM(Gibco BRL, USA) 배양액에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였고, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.
데이터처리
- 成績은 SPSS 17.0K for Windows 통계 프로그램 패키지를 사용하여 평균치 ± 표준편차로 나타내었고 유의수준은 P<0.05로 하였다.
- 05로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Dunett 검정을 실시하였다.
이론/모형
- cells/ml) were treated with the indicated concentrations (0, 1, 2, 4, 8, and 10㎎/㎖) of PF for 1h. Cell viability was evaluated using a colorimetric assay based on MTT assay. Results represent as the mean±SD.
- IL-4 and TNF-α concentration was measured from cell supernatant using ELISA method.
- RBL-2H3 세포의 생존 및 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT법을 사용하였다. RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 48 well plate(Cornig, USA)에 5×104 cells/ml의 세포 수가 되도록 분주하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 24 시간 배양하였다.
- 또한 칼슘이온 운반체, 폴리믹신 B, 코데인, 몰핀 등의 약제도 비만세포를 직접 활성화할 수 있다9). 본 연구에서는 국소성 즉각형 알레르기 반응을 유도하는 anti-DNP IgE를 사용한 면역학적 자극법을 사용하였다.
- 알레르기 반응 연구에 앞서 紫蘇葉(Perillae Folium, PF) 농도(0.5, 1, 2, and 4mg/ml) 에 따른 RBL-2H3 비만 세포에 대한 독성을 MTT법을 사용하여 조사하였다. 그 결과 PF는 모든 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았고, 2 and 4mg/ml의 농도에서 세포성장을 촉진시키는 것으로 나타났다(Fig.
성능/효과
- RBL-2H3 cells에서 Th2 type cytokine 및 염증성 enzyme 유전자 의 발현에 대해 조사한 결과, 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 항원으로 자극한 세포에서 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-13, TNF-α, COX-1, COX-2, iNOS 와 HDC2 mRNA의 발현량이 현저하게 증가하였으며, PF(5 and 10mg/ml)를 처리한 세포에서 mRNA의 발현이 농도의존적으로 감소한 것으로 나타났다 (Fig. 4).
- RBL-2H3 cells에서의 ERK1/2, JNK1/2와 IκBα의 발현에 대해 조사한 결과, 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 항원으로 자극한 세포에서 p-ERK1/2, p-JNK 1/2와 p-IκBα의 발현이 증가하였으며, PF(5 and 10㎎/㎖)를 처리한 세포에서 p-ERK1/2, p-JNK1/2와 p-IκBα의 발현이 억제하는 것으로 보아 PF가 ERK1/2, JNK1/2와 IκBα의 인산화를 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 5).
- RBL-2H3 세포의 생존 및 증식에 미치는 영향을 알아본 결과 PF를 처리하지 않은 세포는 0.62±0.08의 흡광도를 나타내었고, PF를 농도별 (1, 2, 4, 8 및 10mg/ml)로 처리한 세포에서 각각 0.67±0.03, 0.68±0.03, 0.67±0.07, 0.67±0.03, 및 0.66±0.08의 흡광도를 나타내어 10mg/ml 농도 이하에서 세포생존 및 증식에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 결론적으로 PF는 비만세포의 활성을 효과적으로 억제하여 제 1형 알레르기의 즉시반응과 후기반응을 조절하였다. 면역학적 경로를 통한 비만세포 탈과립을 효과적으로 억제하여 초기 화학적 매개물질의 방출을 감소시켰고, 비만세포 자체에서 생산된 IL-4와 TNF-α을 감소시켰다.
- 5, 1, 2, and 4mg/ml) 에 따른 RBL-2H3 비만 세포에 대한 독성을 MTT법을 사용하여 조사하였다. 그 결과 PF는 모든 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았고, 2 and 4mg/ml의 농도에서 세포성장을 촉진시키는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 또한 PF가 Th2 후기반응을 지속시키는 사이토카인의 생성을 억제하는지 조사한 결과 IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF 및 TNF-α mRNA의 발현을 억제하였고, 특히 IL-5, IL-13과 GM-CSF mRNA의 발현은 PF(1, 2, and 4mg/ml) 모든 농도에서 현저하게 감소시켰다(Fig. 4).
- 또한 RBL-2H3 cells에서 분비된 TNF-α의 양은 아무런 처리를 하지 않은 세포에서 13.18±1.11pg/ml이었으며, 항원으로 자극한 세포에서 44.34±2.39pg/ml로 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 유의한(p<0.05) 증가를 나타내었다.
- 결론적으로 PF는 비만세포의 활성을 효과적으로 억제하여 제 1형 알레르기의 즉시반응과 후기반응을 조절하였다. 면역학적 경로를 통한 비만세포 탈과립을 효과적으로 억제하여 초기 화학적 매개물질의 방출을 감소시켰고, 비만세포 자체에서 생산된 IL-4와 TNF-α을 감소시켰다. 또한 지질 매개물질과 후기 Th2 사이토카인 mRNA의 발현을 감소시켰다.
- 본 실험에서 PF가 IgE 매개 알레르기 반응에서 염증 효과를 나타내는 cyclooxygenase 활성을 억제하는지 조사한 결과 COX-2 mRNA의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 특히 2mg/ml과 4mg/ml의 농도에서 현저하게 억제하였다.
- 본 실험에서 PF는 β-hexosaminidase의 분비를 효과적으로 억제하는 것으로 나타나 제 1형 알레르기 반응의 즉시 반응에 억제효과가 있는 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 본 실험에서 PF는 IgE 매개 알레르기 반응에서 염증침윤단계인 후기반응과 관련된 IL-4와 TNF-α의 생산을 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 3A and B).
- 본 실험에서 세포자극에 반응하는 ERK1/2, JNK1/2와 IκBα의 발현에 대해 조사한 결과, 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 항원으로 자극한 세포에서 p-ERK1/2, p-JNK1/2와 p-IκBα의 발현이 증가하였으며, PF(5 and 10㎎/㎖)를 처리한 세포에서 p-ERK1/2, p-JNK1/2와 p-IκBα의 발현이 억제하는 것으로 보아 PF가 ERK1/2, JNK1/2와 IκBα의 인산화를 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 5).
- 항원-항체 결합단계에서 β-hexosaminidase 분비에 미치는 PF의 효과를 살펴본 결과 PF 5mg/ml 농도에서 15.61±8.10%의 억제효과를 나타내었고, PF 10mg/ml 농도에서 24.58±3.82%의 억제효과를 나타내 유의한(p<0.05) 억제효과를 나타내었다(Fig. 2).
후속연구
- 이것으로 볼 때 PF는 제 1형 알레르기의 염증반응의 예방 또는 치료에 응용할 수 있는 가능성을 시사하는 것으로 사료된다.
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