[논문]하이드로젤에 탑재한 우슬(牛膝)추출물의 효과적인 파골세포 분화 억제 작용

최진영; 이창훈; 장준복; 이경섭; 이진무

doi:10.15204/jkobgy.2012.25.1.001

[국내논문] 하이드로젤에 탑재한 우슬(牛膝)추출물의 효과적인 파골세포 분화 억제 작용
Inhibitory Effects of Achyranthis Radix Extract Mixed with Hydrogel on Osteoclast Differentiation 원문보기

大韓韓方婦人科學會誌 = The Journal of Korean obstetrics & gynecology, v.25 no.1, 2012년, pp.1 - 10

최진영 (경희대학교 한의과대학 한방부인과 교실) , 이창훈 (경희대학교 한의과대학 한방부인과 교실) , 장준복 (경희대학교 한의과대학 한방부인과 교실) , 이경섭 (경희대학교 한의과대학 한방부인과 교실) , 이진무 (경희대학교 한의과대학 한방부인과 교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose: This study was conducted to evaluate the inhibitory effect of Achyranthis Radix extract(ARE) loaded hydrogel on osteoclast differentiation. Methods: MTT-assay was performed to estimate cytotoxicity of ARE, Achyranthis Radix-alginate hydrogel disk(ARHD) in bone marrow macrophages stimulated(BMMs) with human receptor activator of nuclear factor-${\kappa}B$ ligand(RANKL), human macrophage-colony stimulating factor(M-CSF). Tartrate resistant acid phosphatase staining and RT-PCR were performed to know the inhibitory effect on osteoclast differentiation. Reactive oxygen species and actin ring formation were analysed to observe the effect of ARHD. Results: ARE has no cytotoxicity at the concentration of 0.1 $mg/m{\ell}$ or lower. ARE decreased the number of TRAP positive cells in RANKL, M-CSF stimulated BMMs and the gene expression. ARHD has no cytotoxicity at the concentration of 10 ${\mu}g/m{\ell}$ (24, 48hours), 50 ${\mu}g/m{\ell}$ (24 hours). ARHD restrained the synthesis of reactive oxygen species and the formation of actin ring. Conclusions: Achyranthis Radix has the inhibitory effect of osteoclast differentiation and bone resorption. Further studies are needed to treat osteoporosis by Achyranthis Radix.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

또한 牛膝-alginate 하이드로젤 disk 역시 세포독성을 나타내지 않는 범위에서 ROS 발생을 감소시켜 파골 세포의 분화를 억제 시키고, actin ring 구조를 붕괴시켜 골흡수 과정의 억제에 관여함을 확인하였다. 본 논문은 약물의 지속적 발현이 가능한 하이드로젤 지지체를 사용한 최초의 파골세포 억제 연구이며, 또한 ROS 지표를 확인하여 牛膝이 골흡수 과정에 관여함을 밝힌 점에서 의의가 있다. 그러나 牛膝-alginate 하이드로젤 disk의 파골세포 분화 억제 작용을 TRAP staining 및 RT-PCR로써 확인하지 않은 한계를 갖고 있다.
이³³⁾는 약 159가지 식물 생약 중 우슬이 파골세포 분화 억제에 있어 가장 우수함을 밝혔다. 이에 기반하여 RANKL, M-CSF로 자극한 BMMs에 牛膝 추출물 및 牛膝 추출물의 지속적인 적용이 가능한 牛膝-alginate 하이드로젤 disk의 파골세포 분화 억제 효과에 대해 실험하였다.
이에 저자는 牛膝의 파골세포 분화 억제 작용 및 牛膝의 지속적인 적용을 위해 하이드로젤에 탑재한 牛膝-하이드로젤 지지체의 세포 독성 및 ROS, 골 재흡수에 미치는 영향을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

제안 방법

BMMs를 24-well plate에 5×104cells/well로 분주하고 RANKL 100 ng/㎖, M-CSF 30 ng/㎖ 및 牛膝-하이드로젤 지지체 10 ng/㎖ 및 50 ㎍/㎖를 첨가하여 같은 배양조건에서 1일 경과 후, 세포를 PBS로 세척하고 10uM DCFH-DA을 30분 동안 처리하였다. 3번의 세척 과정을 거친 후 DCF의 형광은 confocol laser scanning microscopy로 관찰하였다.
BMMs를 48-well plate에 2×104cells/well로 분주하고 RANKL 100 ng/㎖와 M-CSF 30 ng/㎖로 처리한 배지에 牛膝 추출물 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖를 맞추어 첨가하고 배양하였다. 3일 후 배양액을 교환한 후 추가로 2일을 더 배양하고 부착세포를 DPBS로 2회 세척한 후 1% Triton X-100으로 용해시킨 후 TRAP 용액으로 염색하여 보라색의 TRAP 양성세포를 파골세포로 인정하였다. 염색된 파골세포 중 핵이 3개 이상인 세포의 개수를 현미경에서 직접 관찰하여 확인후 통계 처리하여 그래프에 나타내었다.
BMMs를 24-well plate에 5×104cells/well로 분주하고 RANKL 100 ng/㎖, M-CSF 30 ng/㎖ 및 牛膝-하이드로젤 지지체 10 ng/㎖ 및 50 ㎍/㎖를 첨가하여 같은 배양조건에서 1일 경과 후, 세포를 PBS로 세척하고 10uM DCFH-DA을 30분 동안 처리하였다.
BMMs를 48-well plate에 2×104cells/well로 분주하고 RANKL 100 ng/㎖와 M-CSF 30 ng/㎖로 처리한 배지에 牛膝 추출물 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖를 맞추어 첨가하고 배양하였다.
BMMs를 6-well plate에 1×105cells/well로 분주하고 RANKL 100 ng/㎖와 M-CSF 30 ng/㎖로 처리한 배지에 牛膝 추출물 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖를 첨가하고 5일 동안 배양 후 파골세포를 harvest 하여 RNA RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다.
BMMs를 96-well plate에 1×104cells/well로 분주하고 M-CSF 30 ng/㎖를 처리한 후 牛膝 추출물 0.01 ㎎/㎖, 0.5 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖ 및 1 ㎎/㎖를 첨가하여 24, 48시간 배양하였다.
BMMs을 24-well plate에 5×104cells/well로 분주하고 RANKL 100ng/㎖, M-CSF 30 ng/㎖를 처리하여 파골 세포 분화를 6일간 유도시켰다.
Primer은 TRAP were 5'-ACT TCC CCA GCC CTT ACT ACC G-3' (sense) and 5'-TCA GCA CAT AGC CCA CAC CG-3' (antisense), and the Primers for GAPDH were 5'-ACT TTG TCA AGC TCA TTT CC -3' (sense) and 5'-TGC AGC GAA CTT TAT TGA TG -3' (antisense)와 같이 제작되었으며 증폭은 94 ℃ 30초, 57 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 30회 반응시킨 후 Ethidium bromide이 포함된 1% agarose gel에 전기영동을 걸어 분리하여 UV상에서 band를 관찰하였다.
牛膝 및 牛膝-alginate 하이드로젤 disk가 파골세포 분화 및 활성 및 골의 재흡수를 억제하는지 평가하기 위해, 파골세포 분화, ROS, 골 재흡수에 미치는 영향을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
BMMs을 24-well plate에 5×104cells/well로 분주하고 RANKL 100ng/㎖, M-CSF 30 ng/㎖를 처리하여 파골 세포 분화를 6일간 유도시켰다. 그 후 牛膝-하이드로젤 지지체 10 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖를 첨가하여 1일 동안 배양한 후 세포를 3.7% formaldehyde에 10분간 고정하고 PBS로 세척 후에 rhodamin-conjugated phalloidin을 처리하여 30분간 배양하였다. Actin-ring 형성은 형광현미경 Olympus IX71-F32PH 모델을 사용하여 관찰하였다.
5 ㎎/㎖ 이상에서 24, 48시간 배양시 유의한 세포 독성이 나타났다. 따라서 본 실험에서 사용 할 牛膝 추출물의 농도를 10, 50, 100 ㎍/㎖로 선택하여 실험을 진행하였다.
이는 김 등¹⁰⁾이 밝힌 우슬의 유의한 파골세포 억제와 비슷한 결과이다. 또한 TRAP gene expression의 감소를 RT-PCR로 확인하였다.
약물의 효과를 지속적으로 발현할 수 있으며, 국소부위 처리에 유용한 牛膝-alginate 하이드로젤 disk를 제작 후 세포 독성 여부를 확인하였다. 그 결과 牛膝-alginate 하이드로젤 disk 50 ㎍/㎖ 군에서 48시간 배양 시 세포 독성을 나타냈다.
3일 후 배양액을 교환한 후 추가로 2일을 더 배양하고 부착세포를 DPBS로 2회 세척한 후 1% Triton X-100으로 용해시킨 후 TRAP 용액으로 염색하여 보라색의 TRAP 양성세포를 파골세포로 인정하였다. 염색된 파골세포 중 핵이 3개 이상인 세포의 개수를 현미경에서 직접 관찰하여 확인후 통계 처리하여 그래프에 나타내었다.
합성된 cDNA를 PCR preMix (Bioneer, DaeJeon, Korea)로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 중합효소연쇄반응에 사용된 primer는 파골세포 분화의 지표로 사용된 TRAP, GAPDH 유전자 부분을 주형으로 제작하였다. Primer은 TRAP were 5'-ACT TCC CCA GCC CTT ACT ACC G-3' (sense) and 5'-TCA GCA CAT AGC CCA CAC CG-3' (antisense), and the Primers for GAPDH were 5'-ACT TTG TCA AGC TCA TTT CC -3' (sense) and 5'-TGC AGC GAA CTT TAT TGA TG -3' (antisense)와 같이 제작되었으며 증폭은 94 ℃ 30초, 57 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 30회 반응시킨 후 Ethidium bromide이 포함된 1% agarose gel에 전기영동을 걸어 분리하여 UV상에서 band를 관찰하였다.
채취한 골수세포에서 적혈구를 제거한 후 FBS과 M-CSF 30 ng/㎖를 첨가한 α-MEM배지에서 5% CO2, 95% 습도 및 37 ℃의 배양기조건으로 3일간 배양하였다.
추출한 RNA의 1 ㎍을 oligo-dT(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용 하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA를 PCR preMix (Bioneer, DaeJeon, Korea)로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 중합효소연쇄반응에 사용된 primer는 파골세포 분화의 지표로 사용된 TRAP, GAPDH 유전자 부분을 주형으로 제작하였다.

대상 데이터

6주령의 수컷 ICR 생쥐를 희생 시킨 후 antibiotic을 첨가한 α-MEM을 1 ㏄주사기에 충전하여 경골 및 대퇴골에서 골수를 채취하였다.
Human receptor activator of nuclear factor-ƙB ligand (이하 RANKL)과 Human macrophage-colony stimulating factor (이하 M-CSF)는 Peprotech 사(London, UK)에서 구입하였다. Tartrate resistant acid phosphatase (이하 TRAP) staining solution은 Sigma Aldrich사 (St.
Tartrate resistant acid phosphatase (이하 TRAP) staining solution은 Sigma Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, α-minimum essential medium (이하 α-MEM), 10% Fetal bovine serum (이하 FBS), antibiotic, Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (이하 DPBS)는 Gibco사 (Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며 1% Triton X-100는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
용해된 이 두 가지 용액인 2 wt% alginate solution과 calcium sulfate를 주사기에 연결하여 혼합하고 동시에 牛膝 추출물 10 ㎍/㎖과 50 ㎍/㎖를 첨가하여 상온에서 15분간 하이드로젤을 架橋시켰다. 架橋된 牛膝-alginate 하이드로젤 disk를 15 mm지름과 1 mm의 두께를 가지는 disk로 제작하여 사용하였다.
또한 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFH), rhodamin-conjugated phalloidin은 Molecular Probes (Eugene, OR, USA)에서 제품을 구입하였다.
채취한 골수세포에서 적혈구를 제거한 후 FBS과 M-CSF 30 ng/㎖를 첨가한 α-MEM배지에서 5% CO₂, 95% 습도 및 37 ℃의 배양기조건으로 3일간 배양하였다. 배양 후 부착된 세포를 파골전구세포로서의 대식세포 (bone marrow macrophages, 이하 BMMs)로 사용하였다.
비름과 (Amaranthaceae)에 속하는 多年生草本인 쇠무릅 Achyranthes japonica Nakai의 뿌리 (Achyranthis Radix)를 시료:3차증류수=1:10의 비율로 3시간정도 약탕기에서 추출한 후 filtering하고 Freeze dryer로 물을 제거하여 제조한 한국식물 추출물은행의 제품 (CW02-083)을 구매하여 멸균된 3차 증류수로 희석하여 0.22 ㎛ 필터 (Millopore Carrigtwohill, Ireland)에 여과하여 4 ℃에 보관하였으며 생약 추출물은 용액제조 후 15일 이내에 사용하였다.
BMMs를 6-well plate에 1×105cells/well로 분주하고 RANKL 100 ng/㎖와 M-CSF 30 ng/㎖로 처리한 배지에 牛膝 추출물 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖를 첨가하고 5일 동안 배양 후 파골세포를 harvest 하여 RNA RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 추출한 RNA의 1 ㎍을 oligo-dT(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용 하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA를 PCR preMix (Bioneer, DaeJeon, Korea)로 중합효소연쇄반응을 수행하였다.

데이터처리

* Statistical significances were tested by ANOVA.
실험결과에 대한 통계처리는 SPSS (Stastical Package for the Socail Sciences, version 13.0, SPSS INC. IL)을 이용하였다. 실험군과 대조군의 비교는 one-way analysis of variances (ANOVA)를 사용하였고, p<0.
실험군과 대조군의 비교는 one-way analysis of variances (ANOVA)를 사용하였고, p<0.05 일 때 통계적으로 유의한 차이가 있다고 판정하였다.

이론/모형

7% formaldehyde에 10분간 고정하고 PBS로 세척 후에 rhodamin-conjugated phalloidin을 처리하여 30분간 배양하였다. Actin-ring 형성은 형광현미경 Olympus IX71-F32PH 모델을 사용하여 관찰하였다.

성능/효과

1. 牛膝 추출물은 0.1 ㎎/㎖ 이하의 농도에서 세포 독성이 없었다.
2. 牛膝 추출물 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖은 TRAP(+) cell을 통계적으로 유의하게 감소시켰다.
3. 牛膝 추출물 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖은 TRAP gene expression을 감소시켰다.
5. 牛膝-alginate 하이드로젤 disk 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖에서 농도 의존적으로 ROS 생성을 억제하였다.
6. 牛膝-alginate 하이드로젤 disk 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖에서 actin ring 형성이 억제되었다.
Actin ring 염색을 실시한 결과 牛膝-alginate 하이드로젤 disk 10 ㎍/㎖, 50㎍/㎖에서 actin ring 형성이 억제됨을 확인하였다(Fig. 6).
BMMs에 대한 牛膝 추출물의 세포 독성을 측정한 결과 0.1 ㎎/㎖ 이하의 농도에서 세포 독성이 없는 것으로 평가되었다(Table 1, Fig. 1).
BMMs에 대한 牛膝-alginate 하이드로젤 disk의 세포 독성을 측정한 결과 10㎍/㎖ (24, 48시간), 50 ㎍/㎖ (24시간)에서 세포 독성이 없는 것으로 평가되었다(Table 3, Fig. 4)
TRAP 염색 후 TRAP(+) cell을 측정한 결과 대조군 139.33±13.50에 비해, 10 ㎎/㎖군 57.67±7.64, 50 ㎎/㎖군 25.00±5.29, 100 ㎎/㎖군 9.67±2.52로 통계적으로 유의한 파골세포 분화 억제 효과를 나타냈다(Table 2, Fig. 2).
牛膝 추출물 농도별로 TRAP gene expression이 감소됨을 확인하였다(Fig. 3)
牛膝-alginate 하이드로젤 disk 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖에서 농도 의존적으로 ROS 생성이 억제됨을 확인하였다(Fig. 5).
파골세포가 분화하면 그 크기가 거대해 지고 표면이 actin ring을 형성하여 골흡수 과정에 관여하게 된다. 牛膝-alginate 하이드로젤 disk 처리군에서 actin ring 형성이 억제됨을 확인하였다. 이는 牛膝-alginate 하이드로젤 disk가 골 흡수 과정에 관여하여 파골세포 분화를 억제함을 의미한다.
이는 파골세포 분화 시 TRAP 이 활성화되면서 TRAP의 redox-active iron이 hydrogen peroxide와 반응하여 ROS 를 생산하기 때문이다³⁵⁾. 牛膝-alginate 하이드로젤 disk의 파골세포 분화 억제 작용을 알아보기 위해, ROS 생성을 측정한 결과 농도 의존적으로 억제되었다. 이는 牛膝-alginate 하이드로젤 disk가 효과적으로 파골 세포 분화 억제함을 나타낸다.
牛膝의 세포 독성여부를 확인하기 위해 牛膝 추출물에서의 cell viability를 살펴본 결과 牛膝 추출물 0.5 ㎎/㎖ 이상에서 24, 48시간 배양시 유의한 세포 독성이 나타났다. 따라서 본 실험에서 사용 할 牛膝 추출물의 농도를 10, 50, 100 ㎍/㎖로 선택하여 실험을 진행하였다.
TRAP은 성숙한 파골세포에서 발현되는 것으로 TRAP(+) cell은 파골세포 분화 여부를 판단하는 기준으로 이용될 수 있다³⁴⁾. 牛膝의 파골 세포 억제 효과를 확인하기 위해 TRAP 염색을 시행한 결과 牛膝 추출물 10, 50, 100 ㎍/㎖를 첨가한 군은 牛膝 추출물 처리를 하지 않은 군에 비해 각각 41.4%, 17.9%, 6.9% 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. 이는 김 등¹⁰⁾이 밝힌 우슬의 유의한 파골세포 억제와 비슷한 결과이다.
약물의 효과를 지속적으로 발현할 수 있으며, 국소부위 처리에 유용한 牛膝-alginate 하이드로젤 disk를 제작 후 세포 독성 여부를 확인하였다. 그 결과 牛膝-alginate 하이드로젤 disk 50 ㎍/㎖ 군에서 48시간 배양 시 세포 독성을 나타냈다.
이상의 실험 결과 牛膝 추출물은 세포독성을 나타내지 않는 범위에서 파골세포 분화 억제 효과를 나타냈다. 또한 牛膝-alginate 하이드로젤 disk 역시 세포독성을 나타내지 않는 범위에서 ROS 발생을 감소시켜 파골 세포의 분화를 억제 시키고, actin ring 구조를 붕괴시켜 골흡수 과정의 억제에 관여함을 확인하였다. 본 논문은 약물의 지속적 발현이 가능한 하이드로젤 지지체를 사용한 최초의 파골세포 억제 연구이며, 또한 ROS 지표를 확인하여 牛膝이 골흡수 과정에 관여함을 밝힌 점에서 의의가 있다.
이상의 실험 결과 牛膝 추출물은 세포독성을 나타내지 않는 범위에서 파골세포 분화 억제 효과를 나타냈다. 또한 牛膝-alginate 하이드로젤 disk 역시 세포독성을 나타내지 않는 범위에서 ROS 발생을 감소시켜 파골 세포의 분화를 억제 시키고, actin ring 구조를 붕괴시켜 골흡수 과정의 억제에 관여함을 확인하였다.

후속연구

파골세포 분화 과정을 매개하는 가장 중요한 것은 TNF-related activation-induced cytokine (TRANCE) 인 RANKL과 polypeptide 성장 인자인 colony-stimulating factor-1 (CSF-1)이다^16,17). 따라서 RANKL 신호 과정의 각 단계별 차단을 통한 과도한 파골세포 형성의 억제는 골다공증에 대한 치료적 접근을 가능하게 할 것이다.
그러나 牛膝-alginate 하이드로젤 disk의 파골세포 분화 억제 작용을 TRAP staining 및 RT-PCR로써 확인하지 않은 한계를 갖고 있다. 향후 하이드로젤을 이용한 동물 실험 및 나아가 폐경기 골다공증에 있어 호르몬 대체 요법을 대신할 한약 치료에 대한 임상 연구가 이루어져야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	파골세포는 무엇인가?	파골세포(osteoclast)는 골흡수에 관여하는 다핵세포이다. 골의 항상성은 새로운 골기질을 형성하는 조골세포와 오래된 골기질을 흡수하는 파골세포의 적절한 균형에 의해 유지된다.
	한의학에서 골다공증은 어떤 병증으로 설명하는가?	한의학적으로 骨은 腎主骨, 腎生骨髓로써 腎과 밀접한 관련을 갖는다6). 골다공증은 骨痺, 骨痿 등의 병증과 유사성을 찾을 수 있고, 腎의 盛衰와 관련되어 腎虛로 辨證할 수 있다7). 갱년기 여성의 근본 병인 병기 역시 腎虛이다8).
	호르몬 대체 요법이 부작용에도 폐경기 여성의 골다공증에 대한 명확한 치료 지침이 되는 이유는 무엇인가?	폐경기 여성에 있어 에스트로겐의 감소는 퇴행성 골다공증의 가장 주요한 원인이다11). 에스트로겐은 파골세포 분화 및 골의 재흡수 작용을 억제하여 골다공증 발생을 막는다12,13). 따라서 호르몬 대체 요법은 부작용14)에도 불구하고 폐경기 여성의 골다공증 및 그로 인한 골절 예방의 명확한 치료지침이 된다15).

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이준원. 생약의 파골 세포 분화 저해 활성 검색. 생약학회지. 2009;40(2):83-8.

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Minkin C. Bone acid phosphatase: Tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcif Tissue Int. 1982;34(3):285-90.

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Jussi MH et al. Intracellular fragmentation of bone resorption products by reactive oxygen species generated by osteoclastic tartrate-resistant acid phosphatase. J Biol Chem. 1999;274(33):22907-10.

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Takuma M et al. Critical role of cortactin in actin ring formation and osteoclastic bone resorption. J Bone Miner Metab. 2006;24:368-72.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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