신작물보호제로 개발된 '비티플러스'의 천적에 대한 영향평가가 이뤄졌다. 분석된 천적은 두 종의 기생성 천적인 콜레마니진디벌($Aphidius$$colemani$) 및 황온좀벌($Eretmocerus$$eremicus$)과 네 종의 포식성 천적인 무당벌레($Harmonia$$axyridis$), 애꽃노린재($Orius$$laevigatus$), 지중해이리 응애($Amblyseius$$swirskii$) 및 칠레이리응애($Phytoseiulus$$persimilis$)를 포함했다. '비티플러스'는 세 가지 곤충병원세균($Xenorhabdus$$nematophila$(Xn), $Photorhabdus$$temperata$ subsp. $temperata$(Ptt), $Bacillus$$thuringiensis$(Bt))과 세균 대사물질(BM)을 조합하여 개발되었다. 배추좀나방($Plutella$$xylostella$) 4령충에 대해서 세 종류의 '비티플러스'('Xn+Bt', 'Ptt+Bt' 그리고 'BM+Bt') 모두는 Bt 단독에 비해 높은 살충력을 나타냈다. '비티플러스'의 천적에 대한 영향에서 세균배양액 혼합체('Xn+Bt' 또는 'Ptt+Bt')는 접촉독성 및 섭식독성 분석에서 모두 독성이 낮은 것으로 나타났다. 그러나 'BM+Bt'는 일부 독성을 보였으며, 특별히 지중해이리응애와 칠레이리응애에 대해서 높은 독성을 나타냈다. 이들 세균대사물질의 살비효과를 점박이응애($Tetranychus$$urticae$)를 대상으로 분석하였다. 각 대사물질별로 상이한 살비력을 보인 가운데, '비티플러스'에 이용된 대사물질 복합체는 반수치사약량이 218.7 ppm(95% 신뢰구간: 163.2 - 262.3)으로 비교적 높은 살비효과를 나타냈다. 이들 물질의 독성은 Sf9 세포주에 대한 세포독성 분석을 통해 나타났다. 특별히 'BM+Bt' 제조에 사용된 주성분인 벤질리덴아세톤은 낮은 농도에서도 높은 세포독성을 보였다.
신작물보호제로 개발된 '비티플러스'의 천적에 대한 영향평가가 이뤄졌다. 분석된 천적은 두 종의 기생성 천적인 콜레마니진디벌($Aphidius$$colemani$) 및 황온좀벌($Eretmocerus$$eremicus$)과 네 종의 포식성 천적인 무당벌레($Harmonia$$axyridis$), 애꽃노린재($Orius$$laevigatus$), 지중해이리 응애($Amblyseius$$swirskii$) 및 칠레이리응애($Phytoseiulus$$persimilis$)를 포함했다. '비티플러스'는 세 가지 곤충병원세균($Xenorhabdus$$nematophila$(Xn), $Photorhabdus$$temperata$ subsp. $temperata$(Ptt), $Bacillus$$thuringiensis$(Bt))과 세균 대사물질(BM)을 조합하여 개발되었다. 배추좀나방($Plutella$$xylostella$) 4령충에 대해서 세 종류의 '비티플러스'('Xn+Bt', 'Ptt+Bt' 그리고 'BM+Bt') 모두는 Bt 단독에 비해 높은 살충력을 나타냈다. '비티플러스'의 천적에 대한 영향에서 세균배양액 혼합체('Xn+Bt' 또는 'Ptt+Bt')는 접촉독성 및 섭식독성 분석에서 모두 독성이 낮은 것으로 나타났다. 그러나 'BM+Bt'는 일부 독성을 보였으며, 특별히 지중해이리응애와 칠레이리응애에 대해서 높은 독성을 나타냈다. 이들 세균대사물질의 살비효과를 점박이응애($Tetranychus$$urticae$)를 대상으로 분석하였다. 각 대사물질별로 상이한 살비력을 보인 가운데, '비티플러스'에 이용된 대사물질 복합체는 반수치사약량이 218.7 ppm(95% 신뢰구간: 163.2 - 262.3)으로 비교적 높은 살비효과를 나타냈다. 이들 물질의 독성은 Sf9 세포주에 대한 세포독성 분석을 통해 나타났다. 특별히 'BM+Bt' 제조에 사용된 주성분인 벤질리덴아세톤은 낮은 농도에서도 높은 세포독성을 보였다.
Effect of a new crop protectant 'Bt-Plus' on natural enemies was analyzed in this study. Tested natural enemies included two parasitic species of $Aphidius$$colemani$ and $Eretmocerus$$eremicus$, and four predatory species of $Harmonia$$...
Effect of a new crop protectant 'Bt-Plus' on natural enemies was analyzed in this study. Tested natural enemies included two parasitic species of $Aphidius$$colemani$ and $Eretmocerus$$eremicus$, and four predatory species of $Harmonia$$axyridis$, $Orius$$laevigatus$, $Amblyseius$$swirskii$, and $Phytoseiulus$$persimilis$. 'Bt-Plus' was formulated by combination of three entomopathogenic bacteria ($Xenorhabdus$$nematophila$ (Xn), $Photorhabdus$$temperata$ subsp. $temperata$ (Ptt), $Bacillus$$thuringiensis$ (Bt)) and bacterial metabolite (BM). All three types of 'Bt-Plus' showed significantly higher toxicities against fourth instar $Plutella$$xylostella$ larvae than Bt single treatment. Two types of bacterial mixtures ('Xn+Bt' and 'Ptt+Bt') showed little toxicity to all natural enemies in both contact and oral feeding assays. However, 'BM+Bt' showed significant toxicities especially to two predatory mites of $A.$$swirskii$ and $P.$$persimilis$. The acaricidal effects of different bacterial metabolites were evaluated against two spotted spider mite, $Tetranychus$$urticae$. All six BM chemicals showed significant acaricidal effects. The BM mixture used to prepare 'Bt-Plus' showed a high acaricidal activity with a median lethal concentration at 218.7 ppm (95% confidence interval: 163.2 - 262.3). These toxic effects of bacterial metabolites were also proved by cytotoxicity test against Sf9 cells. Especially, benzylideneacetone, which was used as a main ingredient of 'BM+Bt', showed high cytotoxicity at its low micromolar concentration.
Effect of a new crop protectant 'Bt-Plus' on natural enemies was analyzed in this study. Tested natural enemies included two parasitic species of $Aphidius$$colemani$ and $Eretmocerus$$eremicus$, and four predatory species of $Harmonia$$axyridis$, $Orius$$laevigatus$, $Amblyseius$$swirskii$, and $Phytoseiulus$$persimilis$. 'Bt-Plus' was formulated by combination of three entomopathogenic bacteria ($Xenorhabdus$$nematophila$ (Xn), $Photorhabdus$$temperata$ subsp. $temperata$ (Ptt), $Bacillus$$thuringiensis$ (Bt)) and bacterial metabolite (BM). All three types of 'Bt-Plus' showed significantly higher toxicities against fourth instar $Plutella$$xylostella$ larvae than Bt single treatment. Two types of bacterial mixtures ('Xn+Bt' and 'Ptt+Bt') showed little toxicity to all natural enemies in both contact and oral feeding assays. However, 'BM+Bt' showed significant toxicities especially to two predatory mites of $A.$$swirskii$ and $P.$$persimilis$. The acaricidal effects of different bacterial metabolites were evaluated against two spotted spider mite, $Tetranychus$$urticae$. All six BM chemicals showed significant acaricidal effects. The BM mixture used to prepare 'Bt-Plus' showed a high acaricidal activity with a median lethal concentration at 218.7 ppm (95% confidence interval: 163.2 - 262.3). These toxic effects of bacterial metabolites were also proved by cytotoxicity test against Sf9 cells. Especially, benzylideneacetone, which was used as a main ingredient of 'BM+Bt', showed high cytotoxicity at its low micromolar concentration.
본 연구는 비티플러스를 작물보호제로 개발하기 위해서 이 생물제제에 포함되는 Xn과 Ptt 세균 배양액과 이들 대사물질이 기생성 및 포식성 천적류에 미치는 영향을 평가했다. 또한 이들 대사물질이 갖는 세포독성 작용도 곤충세포주를 이용하여 분석했다.
이들 균주는 Luria-Bertani(LB) 배지를 이용하여 28℃에서 12시간동안 배양하여 단일 균총을 채취하였다. 채취된 단일 균총을 2 mL의 LB 액체배지를 이용하여 28℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 글리세롤을 30% 첨가하여 동결 분획시료를 만들었다. 이 동결시료가 추후 반복되는 세균 배양의 원시료로 이용되어 계대배양에 따른 세균 변이 가능성을 줄였다.
글리세롤 동결 세균시료 250 μL를 1 L의 LB 액체배지에 첨가하고 28℃에서 48 시간 동안 200 rpm에서 교반 배양하였다. 배양된 세균은 분광광도계(Uvikon 930, Kontron, Ales, France)를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 2.4 이상이 되면 동결건조기(PVTFD 100R, Ilshin BioBase, Yangju, Korea)를 이용하여 함수량 14.7% 이하의 조건에서 72 시간 동안 동결 건조하였으며, 동결 건조된 시료에 규조토(Duksan, Seoul, Korea)가 전체 제형의 70%가 되도록 첨가하였다.
각각의 균주에 멸균수를 1 mL를 혼합하여 현탁액을 만든 후 loop를 이용하여 LB 사면 배지에 세균을 도말하고 30℃에서 48 시간 배양하였다. 평판배지에서 배양된 세균에서 단일 콜로니를 얻고 이를 멸균수로 희석하여 2 mL의 LB 액체배지를 이용하여 30℃에서 24 시간 동안 200 rpm에서 교반배양 후, 글리세롤을 30%가 되도록 첨가하여 동결 분획시료를 만들었다.
실험약제인 ‘Xn+Bt’ 혼합제 그리고 ‘Ptt+Bt’ 혼합제는 물을 이용하여 1,000 ppm의 농도로 희석하였다. 세균대사물질 복합체(BM)는 BZA, indole, oxindole, cPY, PHPP를 6:1:1:1:1(g/g)의 비율로 혼합하고 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich Korea, Seoul, Korea)를 이용하여 1,000 ppm의 농도로 조제한 후 증류수를 이용하여 희석 현탁액으로 만들었다. 이 현탁액에 Bt를 용해시켜 혼합제를 조제하였다.
배춧잎을 10 분간 침지시킨 후 여과지가 깔려진 용기(직경 9 cm)에서 5 분간 건조시켰다. 각 배추 잎에 배추좀나방 4령충을 10 마리씩 3 반복으로 처리하였으며, 처리 후 5일째 사망률로 살충 효과를 평가했다. 처리된 배춧잎은 24 시간만 섭식시키고 이후 매일 새로운 무처리 배춧잎으로 교체하여 섭식시켰다.
처리된 배춧잎은 24 시간만 섭식시키고 이후 매일 새로운 무처리 배춧잎으로 교체하여 섭식시켰다. 대조구는 증류수에 침지시킨 배춧잎을 이용하여 동일한 방법으로 살충력을 검정하였다.
배양된 세포를 대상으로 하여 조제된 대사물질을 각각 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 그리고 100 ppm의 농도가 되게 처리하였으며 배양액을 각 well에 200 μL가 되도록 분주하였다.
콜레마니진디벌은 머미 상태로 30 마리씩 3 반복으로 처리하였다. 처리방법으로는 직경 6 cm의 페트리디쉬를 이용하였다. 접촉독성을 검정할 시료는 모두 DMSO를 이용하여 1,000 ppm으로 제조한 후 스프레이를 이용하여 공중에서 3 회(1 회 살포량 0.
처리방법으로는 직경 6 cm의 페트리디쉬를 이용하였다. 접촉독성을 검정할 시료는 모두 DMSO를 이용하여 1,000 ppm으로 제조한 후 스프레이를 이용하여 공중에서 3 회(1 회 살포량 0.7 mL) 살포하였다. 살포 후 25℃ 조건에서 배양시키고 7 일 후 생존율을 우화수로 산출하였다.
살포 후 25℃ 조건에서 배양시키고 7 일 후 생존율을 우화수로 산출하였다. 섭식독성을 검정할 시료는 동일한 방법으로 조제하여 기장테두리진딧물에 3 회 살포하였으며 살포 후 접촉독성과 동일한 방법으로 확인하였다.
황온좀벌 머미, 무당벌레 유충, 애꽃노린재 성충, 칠레이리응애 성충 그리고 지중해이리응애 성충을 이용하여 30 마리씩 3 반복으로 위와 같은 방법으로 접촉독성을 검정하였다. 황온좀벌은 온실가루이 알, 무당벌레 유충과 애꽃노린재 성충은 줄알락명나방 알 그리고 칠레이리응애와 지중해이리응애는 점박이응애를 이용하여 먹이 곤충에 약제를 처리하여 위와 같은 방법으로 섭식독성을 검정하였다.
황온좀벌 머미, 무당벌레 유충, 애꽃노린재 성충, 칠레이리응애 성충 그리고 지중해이리응애 성충을 이용하여 30 마리씩 3 반복으로 위와 같은 방법으로 접촉독성을 검정하였다. 황온좀벌은 온실가루이 알, 무당벌레 유충과 애꽃노린재 성충은 줄알락명나방 알 그리고 칠레이리응애와 지중해이리응애는 점박이응애를 이용하여 먹이 곤충에 약제를 처리하여 위와 같은 방법으로 섭식독성을 검정하였다. 무처리구는 모두 증류수 처리로 삽식 및 접촉독 대조구를 구성했다.
Ac-FGV, BZA, cPY, indole, oxindole, PHPP 그리고 PY를 DMSO를 이용하여 0, 125, 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000 ppm의 농도로 조제하였다. 페트리디쉬(직경 9 cm) 바닥 전체에 탈지면을 깔고 약 5 mL의 증류수를 처리하였다.
페트리디쉬(직경 9 cm) 바닥 전체에 탈지면을 깔고 약 5 mL의 증류수를 처리하였다. 이 탈지면 위에 원형 강낭콩 잎(직경 6 cm) 위에 점박이응애 성충을 30 마리씩 접종하였다. 각각의 처리구는 스프레이를 이용하여 공중에서 3 회(1회 살포량 0.
이 탈지면 위에 원형 강낭콩 잎(직경 6 cm) 위에 점박이응애 성충을 30 마리씩 접종하였다. 각각의 처리구는 스프레이를 이용하여 공중에서 3 회(1회 살포량 0.7 mL) 살포하였으며 3 반복으로 처리하였으며, 처리 후 5일째 사망률로 살비 효과를 평가했다. 처리된 강낭콩 잎은 24 시간만 섭식시키고 이후 매일 새로운 무처리 먹이로 교체하여 섭식시켰다.
처리된 강낭콩 잎은 24 시간만 섭식시키고 이후 매일 새로운 무처리 먹이로 교체하여 섭식시켰다. 대조구는 증류수에 침지시킨 강낭콩 잎을 이용하여 동일한 방법으로 살비력을 검정하였다.
세포의 증식 또는 생존 능력을 측정하기 위해 MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 세포독성검정을 실시하였다. 96 well microplate에 2 × 104 cells/well의 세포를 100 μL의 배양액(TC-100 Insect Medium, Welgene, Daegu, Korea)과 함께 각 well에 분주하여 28℃에서 12 시간동안 배양하였다.
곤충병원세균 유래 신작물보호제의 살충력을 확인하기 위해 배추좀나방 4령 유충을 대상으로 잎 침지법을 이용하여 섭식독성을 검정하였다(Fig. 1). Xn, Ptt 그리고 BM의 단독 살충력은30% 이하로 낮게 나타났으며, 1,000 ppm의 Bt 생물농약을 단독으로 처리하면 약 60%의 살충력을 나타내었다.
이러한 결과는 이전 연구(Seo, 2012)에서 보고된 ‘비티플러스’의 살충력 상승효과를 재확인하였고, 이렇게 조제된 ‘비티플러스’를 유용 천적에 대한 안전성 평가에 이용하였다.
기생성천적(콜레마니진디벌, 황온좀벌)과 포식성천적(무당벌레, 애꽃노린재, 칠레이리응애, 지중해이리응애)에 대한 세종류의 ‘비티플러스’ 독성을 접촉독과 섭식독으로 나누어 평가하였다.
칠레이리응애 및 지중해이리응애에 대해 비교적 높은 접촉 독성을 나타낸 BM 처리구의 구성 성분인 BZA, cPY, indole, oxindole 그리고 PHPP의 물질을 대상으로 점박이응애에 대한 살비력을 검정하였다(Fig. 3). 각각의 약제들을 2,000 ppm으로 처리하여 보면(Fig.
각 세균대사물질의 점박이응애에 대한 반수치사약량을 평가 하였다(Fig. 3B). BM이 가장 낮은 반수치사약량을 보였고, BZA와 PHPP가 다음으로 낮은 치사약량을 보였고, 나머지 약제가 이들 보다 높은 반수치사약량을 보였다.
포식성응애 및 점박이응애에 대하여 높은 살비력을 나타낸 곤충병원세균 유래물질에 대한 세포독성을 MTT 검정법으로 분석하였다(Fig. 4). 이들 물질들은 모두 10 ppm의 농도에서 모두 세포독성을 보였다(Fig.
4A). 이들의 세포독성 차이를 비교하기 위해 서로 다른 농도로 처리하여 50% 세포치사농도를 산출하였다(Fig. 4B). 그 결과 모든 약제들은 100 μM 이하의 농도에서 50% 세포치사농도를 보였으며, 이 가운데 BZA와 PHPP 가 가장 독성이 높은 것으로 나타났다.
본 연구는 유용천적에 대해서 ‘비티플러스’의 안전성 분석으로 실시되었다.
이러한 결과를 얻기 위해 본 연구는 먼저 분석에 이용될 ‘비티플러스’의 살충력을 재확인하였다.
이러한 결과를 얻기 위해 본 연구는 먼저 분석에 이용될 ‘비티플러스’의 살충력을 재확인하였다. 둘째로 이러한 결과를 바탕으로 천적에 대한 섭식 및 접촉독성을 실제 방제에 이용되는 1,000 ppm을 기준으로 다양한 농도에서 분석하였다. 이를 통해 섭식보다는 접촉에 기인된 천적 영향이 더 클 것으로 판정되었다.
이를 통해 섭식보다는 접촉에 기인된 천적 영향이 더 클 것으로 판정되었다. 셋째로 세균대사물질의 살비력을 점박이응애를 대상으로 각각 대사물질 별로 분석했다. 마지막으로 높은 살비력을 이해하기 위해 이들 물질의 세포독성을 분석하여 살비력과 세포독성의 연관성을 밝혔다.
셋째로 세균대사물질의 살비력을 점박이응애를 대상으로 각각 대사물질 별로 분석했다. 마지막으로 높은 살비력을 이해하기 위해 이들 물질의 세포독성을 분석하여 살비력과 세포독성의 연관성을 밝혔다.
이 연구는 또한 세균대사물질이 세포독성을 가지고 있다고 밝혔다. 세포독성 분석은 MTT를 이용하였다. MTT는 살아있는 세포의 환원효소 작용으로 분홍색의 formazan 물질로 변하게 되면서 세포 생존력, 증식력 및 특정 물질들의 세포치사효과를 분석하는 데 이용한다(Cory et al.
세균대사물질들이 보이는 살비효과는 점박이응애를 대상으로 개별 독성을 분석했다. 이들 가운데 BZA과 PHPP가 모두 높은 살비효과를 나타냈다.
대상 데이터
비티플러스 약효 검정을 위해 실내에서 배추로 누대 사육(> 10 년)하여 유지시킨 배추좀나방(Plutella xylostella) 종령충(4령)을 대상으로 실시하였다.
thuringiensis var. aizawai NT0423을 사용하였다. 각각의 균주에 멸균수를 1 mL를 혼합하여 현탁액을 만든 후 loop를 이용하여 LB 사면 배지에 세균을 도말하고 30℃에서 48 시간 배양하였다.
실험에 사용된 dimethylsulfoxide(DMSO), BZA, indole, oxindole 및PHPP는 Sigma-Aldrich Korea(Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다. Ac-FGV과 PY는 (주)펩트론(Daejon, Korea)에서 합성하여 구매하였고 cyclo-PY(cPY)는 안동대학교 응용화학과에서 합성한 것(Lee, 2012)을 이용하였다.
실험에 사용된 dimethylsulfoxide(DMSO), BZA, indole, oxindole 및PHPP는 Sigma-Aldrich Korea(Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다. Ac-FGV과 PY는 (주)펩트론(Daejon, Korea)에서 합성하여 구매하였고 cyclo-PY(cPY)는 안동대학교 응용화학과에서 합성한 것(Lee, 2012)을 이용하였다.
96 well microplate에 2 × 104 cells/well의 세포를 100 μL의 배양액(TC-100 Insect Medium, Welgene, Daegu, Korea)과 함께 각 well에 분주하여 28℃에서 12 시간동안 배양하였다. 검정에 사용되는 Ac-FGV, BZA, cPY, indole, oxindole, PHPP 그리고 PY는 DMSO를 이용하여 200 ppm으로 조제하였다. 배양된 세포를 대상으로 하여 조제된 대사물질을 각각 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 그리고 100 ppm의 농도가 되게 처리하였으며 배양액을 각 well에 200 μL가 되도록 분주하였다.
Effects of three ‘Bt-plus’ formulations on contact and ingestion toxicities against six natural enemies. Each treatment used 30 mummy and was replicated three times. Mortality was measured at 5 days after treatment (DAT).
Each treatment was replicated three times. Each replication used 10 test larvae. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among means at type I error = 0.
Each treatment was replicated three times. Each replication tested 30 individuals. Each toxicity is denoted by mean mortality ± standard deviation.
세 종류의 ‘비티플러스’가 분석에 이용되었다.
본 연구는 2011년도 농촌진흥청 아젠다 사업(대과제명: 화학 농약 대체기술)으로부터 지원받아 수행하였다. 서삼열과 스리칸스는 교육과학기술부 2단계 BK21 사업으로부터 지원받았다.
데이터처리
모든 살충효과 시험 결과는 백분율 자료로서 arsin 변환 후 SAS의 PROC GLM(SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA 분석을 실시하였다. 반수치사약량(median lethal concentration: LC50)은 probit 분석법(Raymond, 1985)을 이용하여 산출하였다.
이론/모형
모든 살충효과 시험 결과는 백분율 자료로서 arsin 변환 후 SAS의 PROC GLM(SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA 분석을 실시하였다. 반수치사약량(median lethal concentration: LC50)은 probit 분석법(Raymond, 1985)을 이용하여 산출하였다.
성능/효과
채취된 단일 균총을 2 mL의 LB 액체배지를 이용하여 28℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 글리세롤을 30% 첨가하여 동결 분획시료를 만들었다. 이 동결시료가 추후 반복되는 세균 배양의 원시료로 이용되어 계대배양에 따른 세균 변이 가능성을 줄였다. 글리세롤 동결 세균시료 250 μL를 1 L의 LB 액체배지에 첨가하고 28℃에서 48 시간 동안 200 rpm에서 교반 배양하였다.
1). Xn, Ptt 그리고 BM의 단독 살충력은30% 이하로 낮게 나타났으며, 1,000 ppm의 Bt 생물농약을 단독으로 처리하면 약 60%의 살충력을 나타내었다. 하지만 Xn, Ptt 그리고 BM을 Bt와 1:1 비율로 혼합하여 1,000 ppm으로 처리하면 살충력이 현격하게 증가되어 세균혼합제(‘Xn+Bt’, ‘Ptt+Bt’)의 경우 100%의 방제 효과를 나타냈다.
콜레마니진디벌 머미에 살포한 약제들의 접촉 및 섭식독성은 2,000 ppm의 ‘Xn+Bt’ 처리구에서 일부 독성을 나타낸 것을 제외하고 이들 세균복합체(‘Xn+Bt’, ‘Ptt+Bt’)의 경우 거의 모든 처리에서 독성이 없는 것으로 나타났다(Table 2).
세 종류의 ‘비티플러스’ 가운데 BM 혼합체가 포식성응애류에 대해서 높은 독성을 나타내는 것으로 나타났다.
최대 2,000 ppm의 ‘비티플러스’에 대해서 분석된 모든 천적은 접촉독성에 비해 섭식독성이 낮은 것으로 나타났다(Fig. 2).
그러나 세균대사물질 처리구(‘BM+Bt’)에서는 접촉독성의 경우 500 ppm 이상에서 독성을 나타내는 것으로 나타났다. 황온좀벌의 머미에 살포한 약제들이 경우도 콜레마니진디벌과 마찬가지로 세균 복합체는 거의 독성을 보이지 않은 반면, 세균대사물질 처리구에서는 접촉독성의 경우 500 ppm 이상에서 독성을 나타내는 것으로 나타났다. 무당벌레 유충에 살포한 약제들의 경우 높은 농도의 세균복합체에서 일부 접촉독성을 나타냈다.
세균대사물질 처리구에서는 500 ppm 이상에서 높은 접촉독성을 나타냈다. 애 꽃노린재 약충에 살포한 약제들도 세균복합체는 거의 독성을 보이지 않은 반면, 세균대사물질 처리구에서는 접촉독성의 경우 1,000 ppm 이상에서 독성을 나타내는 것으로 나타났다.
그 결과 모든 약제들은 100 μM 이하의 농도에서 50% 세포치사농도를 보였으며, 이 가운데 BZA와 PHPP 가 가장 독성이 높은 것으로 나타났다.
칠레이리응애는 지중해이리응애에 비해 다소 높은 내성을 보였다. 세균복합체는 거의 모든 농도에서 낮은 독성을 보였으나, 세균대사물질 복합체의 경우는 250 ppm 이상의 농도에서 높은 살비 독성을 보였다.
3). 각각의 약제들을 2,000 ppm으로 처리하여 보면(Fig. 3A), 이들 복합체인 BM의 살비력이 100%로 높게 나타났으며, BZA와 PHPP가 약 90%의 살비력을 나타내었으며 oxindole, indole 그리고 cPY 순으로 살비력이 감소하였다.
3B). BM이 가장 낮은 반수치사약량을 보였고, BZA와 PHPP가 다음으로 낮은 치사약량을 보였고, 나머지 약제가 이들 보다 높은 반수치사약량을 보였다.
세 종의 ‘비티플러스’ 모두는 배추좀나방의 종령 유충에 대해서 높은 살충력을 보였다.
세균혼합물인 ‘Xn+Bt’ 또는 ‘Ptt+Bt’는 비교적 높은 농도에서도 천적 생존에 영향을 주지 않는 반면 세균대사물질인 BM을 기반으로 만들어진 ‘비티플러스’의 경우는 접촉 및 섭식독성을 나타냈으며, 특별히 포식성응애류에 대해서는 높은 살비력을 나타냈다.
이들 물질은 PLA2 억제 뿐만 아니라 PO 효소활성 및 혈구세포의 소낭형성 반응도 억제시켰다(Seo, 2012). 따라서 Xn 배양액, Ptt 배양액 및 세균대사물질인 BM은 모두 면역억제 효과가 있다는 것을 의미하며, 이에 따라 Bt의 병원력을 높여 배추좀나방에 대한 살충력을 증가시켰을 것으로 해석된다.
, 1991). 이 가운데 BZA와 PHPP의 세포독성은 가장 높은 것으로 나타났다. BZA의 경우는 두 세균 배양액에 모두 가장 많이 검출되는 세포대사물질이다.
이 연구는 이들 천적류에 대해서 세균배양액 혼합 비티플러스(‘Xn+Bt’, ‘Ptt+Bt’)는 사용 약량 1,000 ppm에서 안전하지만, 세균대사물질 혼합체(‘BM+Bt’)는 독성을 나타냈으며, 특별히 지중해이리 응애 및 칠레이리응애에 대해서 살비효과를 나타냈다.
이 연구에서 분석된 천적류는 모두6 종으로 기생성2 종과 포식성4 종을 포함하고 있다. 진딧물 천적으로 알려진 콜레마니진디벌은 단독 내부기생벌로 진딧물아과에 속한 진딧물에 기생 및 치사를 일으킨다(Stary, 1975).
후속연구
두 곤충병원세균의 상이한 병원기작을 조합하여 제작한 이 생물제제는 IBC 해충 방제 개념(Jung, 2006) 의 결과물로서 세균 조합형(‘Xn+Bt’, ‘Ptt+Bt’) 비티플러스는 야외 포장조건에서도 약효가 우수하고(Seo and Kim, 2011) 약해도 없고, 포유류 독성도 없고, 천적에도 독성이 낮아 새로운 미생물 농약으로 산업화가 가능할 것으로 본 연구는 제시하고 있다.
그러나 이들 대사물질은 새로운 화학농약으로서의 개발 가능성이 있다. 즉, 이 연구에서 보여 준 BZA와 PHPP의 높은 살비 효과와 이 물질의 고추 탄저병에 대한 방제 효과(Park et al., 2010)는 새로운 작물보호제로의 개발 가능성을 제시하고 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
통합생물방제 기술이란 무엇인가?
상이한 작용점을 가지고 대상 곤충에 병원성을 발휘하는 두종 이상의 병원 미생물을 혼합하여 상승적 살충 효과를 꾀하는 통합생물방제(integrated biological control: IBC) 기술이 고안되었다(Jung, 2006). 특별히 곤충의 중장세포를 파괴시킬 수 있는 Bacillus thuringiensis(Bt) 세균과 이를 통해 혈강으로 침입하여 곤충면역반응을 억제시키는 Xenorhabdus nematophila(Xn) 또는 Photorhabdus temperata temperata(Ptt) 세균들의 혼합을 통해 효과적인 생물제제를 개발하고 이를 ‘비티플러스’라 명명하였다(Jung and Kim, 2006a,b, 2007; Kwon and Kim, 2008; Seo and Kim, 2011).
Bt에 대한 감수성 저하는 어떻게 나눌 수 있는가?
이러한 Bt에 대한 감수성 저하는 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫째로, Bt 내독소와 대상 곤충의 중장 수용체의 결합능력 저하에기인될 수 있다. Bt의 살충기작은 궁극적으로 대상 해충의 패혈증에 기인되지만, 이 세균이 혈강으로 들어가기 위해서는 내독소에 의한 곤충 중장세포를 파괴해야한다(Gill et al., 1992). Bt 내독소에 대한 중장 파괴는 중장세포 막에 존재하는 cadherin 단백질, aminopeptidase-N(APN) 단백질 및 alkaline phosphatase(ALP) 단백질과 내독소단백질의 결합에 의존한다(Pigot and Ellar, 2007). 대상 곤충의 섭식 행동에 따라 중장에 도달한 Bt는 알칼리성 pH에서 Bt 내독소가 활성화된다. 이때 활성화된 Bt 내독소가 비교적 빈도가 높은 APN 또는 ALP에 결합하게 되고, 이에 따라 국부적으로 밀도가 높아진 내독소 단백질 사이에 중합체를 이루게 된다(Gómez et al., 2006; Pacheco et al, 2009). 이 내독소 중합체는 cadherin과 다시 결합하면서 중장세포막에 구멍을 형성할 수 있는 내독소 올리고결합체를 형성하게 된다(Gómez et al., 2002; Atsumi et al., 2008). 이 내독소 올리고결합체는 다시 glycosylphosphatidylinositol(GPI)에 연결된 ALP 또는 APN 과 결합하고, GPI의 도움으로 중장세포막으로 침입하여 구멍을 형성하게 된다(Pardo-López et al., 2006). 이러한 세포막 손상은 중장세포에 급격한 삼투압 변화를 일으켜 세포 붕괴가 일어나고 Bt 세균병이 유발되게 된다. Bt 내독소의 다른 살충 기작으로 내독소 단위체가 cadherin에 결합하게 되면 세포내 cAMP의 농도가 올라가고 이에 따라 protein kinase A 활성 증가가 유발되고 궁극적으로 세포치사에 이르는 작용도 포함될 수 있다 (Zhang et al., 2006). 따라서 Bt 살충기작은 대상 곤충의 중장세포막에 존재하는 수용체 단백질에 의존하기에 이들의 돌연변이는 Bt에 대한 저항성으로 이어질 수 있다(Heckel et al., 2007).
둘째로, Bt 세균에 대한 곤충의 면역기작으로부터 이 세균에 대한 내성을 획득할 수 있다. 실제로 낮은 농도의 Bt 세균에 미리 노출되면 혈림프의 멜라닌 형성반응과 같은 면역 반응이 증가하여 Bt 감수성 저하로 이어진다(Rahman et al., 2004). Bt 병원성과 곤충 면역작용 사이의 기능적 관계성은 면역억제 물질이 배추좀나방에 대해서 Bt의 감염력을 상승시키는 사실에서도 입증되 었다(Kwon and Kim, 2007, 2008). 따라서 대상 곤충의 면역력은 Bt의 감수성 저하를 유도할 수 있는 인자로 간주할 수 있다.
비티플러스란 무엇인가?
상이한 작용점을 가지고 대상 곤충에 병원성을 발휘하는 두종 이상의 병원 미생물을 혼합하여 상승적 살충 효과를 꾀하는 통합생물방제(integrated biological control: IBC) 기술이 고안되었다(Jung, 2006). 특별히 곤충의 중장세포를 파괴시킬 수 있는 Bacillus thuringiensis(Bt) 세균과 이를 통해 혈강으로 침입하여 곤충면역반응을 억제시키는 Xenorhabdus nematophila(Xn) 또는 Photorhabdus temperata temperata(Ptt) 세균들의 혼합을 통해 효과적인 생물제제를 개발하고 이를 ‘비티플러스’라 명명하였다(Jung and Kim, 2006a,b, 2007; Kwon and Kim, 2008; Seo and Kim, 2011).
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