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문제 정의
- 만약, 일반적인 가정용 냉장고에서 유지할 수 있는 온도인 4℃에서 돼지 액상 정액을 효율적으로 보관할 수있는 방법이 개발된다면 실제 양돈 농가에서 액상 정액 보존의 어려움이 줄어들 것이다. 본 연구에서 기존의 냉장정액 보관 온도의 적정성을 분석하기 위해 온도별 정자의 운동성을 분석하였다. 채취된 정액을 4℃와 17℃에서 다르게 보관한 결과 기존의 17℃에서 보관한 정자의 운동성이 좋은 결과를 나타내었으며, 5일 동안의 운동성의 유지되는 정도도 가장 좋은 것으로 나타났다(Table 2.
- 이에 따라 본 연구에서는 일반적으로 많이 쓰이는 보존액인 Androhep에 다양한 동결 보호제를 처리하였을 때 4℃ 냉장고에서 보존 기간에 따른 활성도 및 생존 여부를 이용한 정액성상 변화를 조사하여 어떠한 방법이 가장 효율적인지 알아보고자 한다.
제안 방법
- 그 후 39℃로 가온된 슬라이드 글라스에 정액 10μl를 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮어 정자활성도를 400배 광학현미경에서 육안으로 관찰하였다.
- 그리고 운동의 정도에 따라 5단계로 나누어 평가하였다(+++: 매우 활발한 전진 운동, ++: 활발한 전진 운동, +: 완만한 전진 운동, +/- :선회 또는 진자 운동 , - : 운동하지 않는다. ).
- Androhep 보존액에 각각 glycerol, DMSO, ethylene glycol을 주입 후 혼합하였다. 다음 17℃에 맞춘 후 보관한 정액을 각각의 그룹으로 나누어 최종적으로 각각의 그룹에 3% 농도로 동결 보호제를 처리하였다. 실험 그룹은 17℃에서 보관하는 무처리 정액(Control Group), 4℃에서 보관하는 무처리 정액(Group A), 4℃에 보관하고 glycerol 3%처리한 정액(Group B), 4℃에 보관하고 DMSO 3% 처리한 정액(Group C), 4℃에 보관하고 ethylene glycol을 3% 처리한 정액(Group D)로 설정하였으며, 17℃에서 4℃로 온도 감소 시 정액을 15 ml 튜브에 넣은 후 마개를 닫고 바깥쪽에 얼음물을 채워서 2시간에 걸쳐서 서서히 4℃로 낮추어 저온 충격에 의한 손실을 최소화 하였다.
- 액상 정액의 제조에 사용된 Androhep 보존액의 성분은 Table 1과 같다. 동결 보호제가 정자에 미치는 영향을 비교 관찰하기 위해 glycerol, DMSO, ethylen glycol을 처리하는 시험군을 설정하였다. Androhep 보존액에 각각 glycerol, DMSO, ethylene glycol을 주입 후 혼합하였다.
- 보존 기간 5일 동안 매일 정자의 생존율 변화를 비교 측정하였다. 정자의 생존율 변화 양상은 Table 3과 같다.
- 보존 기간 5일 동안 매일 정자의 운동성 변화를 비교 측정하였다. 정자의 운동성 변화 양상은 Table 2와 같다.
- 다음 17℃에 맞춘 후 보관한 정액을 각각의 그룹으로 나누어 최종적으로 각각의 그룹에 3% 농도로 동결 보호제를 처리하였다. 실험 그룹은 17℃에서 보관하는 무처리 정액(Control Group), 4℃에서 보관하는 무처리 정액(Group A), 4℃에 보관하고 glycerol 3%처리한 정액(Group B), 4℃에 보관하고 DMSO 3% 처리한 정액(Group C), 4℃에 보관하고 ethylene glycol을 3% 처리한 정액(Group D)로 설정하였으며, 17℃에서 4℃로 온도 감소 시 정액을 15 ml 튜브에 넣은 후 마개를 닫고 바깥쪽에 얼음물을 채워서 2시간에 걸쳐서 서서히 4℃로 낮추어 저온 충격에 의한 손실을 최소화 하였다.
- ). 여기에 각 부호별로 일정한 계수를 부여하여 정자의 생존지수를 계산하였다. 이렇게 계산된 생존 지수는 정액의 정자의 생존율과 생존지수의 활력의 정도를 동시에 나타내고 있다.
대상 데이터
- 그 후 39℃로 가온된 슬라이드 글라스에 정액 10μl를 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮어 정자활성도를 400배 광학현미경에서 육안으로 관찰하였다. 각 실험군별로 100개의 정자를 세어서 평가하였다. 그리고 운동의 정도에 따라 5단계로 나누어 평가하였다(+++: 매우 활발한 전진 운동, ++: 활발한 전진 운동, +: 완만한 전진 운동, +/- :선회 또는 진자 운동 , - : 운동하지 않는다.
- 공시동물은 경기도 축산위생연구소에서 사육되고 있는 랜드레이스 종을 사용하였다. 채취된 정액은 정자 농도 3.
데이터처리
- 통계 분석은 통계 분석 프로그램(SPSS Version 14.0, USA)을 이용하였으며, 일원 분산 분석을 실시하여 보존 기간 동안 희석액에 따른 정자의 변화를 비교 분석하였다. p<0.
이론/모형
- Eosin에 의한 염색은 김 등(2000)의 방법에 준하여 실시하였다. 즉, semen sample 100μl와 0.
성능/효과
- Control). 4℃ 보관 처리군 중 동결 보호제를 처리하지 않은 군(Table 2. Group A)과 4℃ 보관 및 3% glycerol 처리 군(Table 2. Group B) 및 3% DMSO 처리군(Table 2. Group C)에서는 1일차에서부터 운동성이 급격하게 감소하여 5일차에는 운동성을 거의 나타내지 않아 효과가 거의 없는 것으로 나타났다. 그러나 4℃ 보관 시 3% ethylene glycol을 사용한 군(Table 2.
- 결론적으로, 17℃에서 보관한 정자에 비해 4℃에 보관한 정자들은 운동성 및 생존율이 1일차부터 급격하게 낮아졌으며, 5일차에는 거의 모두 사멸하는 정도였으나, 그 중 4℃에 보관시 3%의 ethylene glycol을 첨가한 군에서는 다른 군에 비해 운동성 및 생존율이 높게 측정되었다.
- 돼지 정액에 동결 보호제 처리를 하지 않은 후, 각기 다른 온도에서 보관한 실험에서 4℃에 정액을 보관할 경우, 48시간에 운동성이 12%, 생존율이 30% 정도를 나타내었는데(Zou와 Yang, 2000), 본 실험에서는 운동성이 11%, 생존율이 19%로 생존율이 다소 낮은 결과를 나타내었으며(Group A), ethylene glycol을 처리한 군에서는 48시간에 운동성이 32%, 생존율이 33%로써 유의성을 가지는 결과가 나와(Group D), ethylene glycol의 효과가 다소 있음을 알 수 있었다. 그러나 48시간 이후에는 운동성과 생존율이 급격하게 감소하여 5일 이후에는 17℃에 보관한 돼지정자의 운동성이 40%, 생존율이 37%를 나타내었는데 반해, ethylene glycol을 처리후 4℃에 보관한 경우 운동성이 2.33%, 생존율이 8%의 결과를 나타내어 실질적으로 농가에서 인공수정에 사용하기는 어려운 결과를 나타내었다.
- 전체 보존 기간 동안 동결 보호제 첨가 없이 17℃에서 Androhep 보존액에 보존(Control group)한 정자가 동결 보호제를 첨가하여 4℃ 냉장 보존한 정자들에 비해 생존율이 높았다. 동결 보호제를 첨가하여 4℃ 냉장 보존한 정자들간에도 차이가 나타났는데, 1일째부터 3일째까지 ethylene glycol을 3% 첨가한 액상 정액(Group D)의 정자 생존율은 43.3%에서 25.3% 감소하였지만, 35.7%에서 17.7%로 감소한 동결 보호제를 첨가하지 않고 4℃ 냉장 보존한 액상 정액(Group A)의 운동성보다 유의적으로 높게 관찰되었다. 반면, 다른 동결 보호제를 첨가한 액상 정액의 정자 운동성은 3% gycerol을 첨가한 정액(Group B)에서 35.
- 전체 보존 기간 동안 동결 보호제 첨가 없이 17℃에서 Androhep 보존액에 보존(Control group)한 정자가 동결 보호제를 첨가하여 4℃ 냉장 보존한 정자들에 비해 운동성이 높았다. 동결 보호제를 첨가하여 4℃ 냉장 보존한 정자들간에도 차이가 나타났는데, 1일째부터 3일째까지 ethylene glycol을 3% 첨가한 액상 정액(Group D)의 정자 운동성은 42.0%에서 21.7% 감소하였지만, 25.0%에서 10.7%로 감소한 동결 보호제를 첨가하지 않고 4℃ 냉장 보존한 액상 정액(Group A)의 운동성보다 유의적으로 높게 관찰되었다. 반면, 다른 동결 보호제를 첨가한 액상 정액의 정자 운동성은 3% gycerol을 첨가한 정액(Group B)에서 25.
- 돼지 정액에 동결 보호제 처리를 하지 않은 후, 각기 다른 온도에서 보관한 실험에서 4℃에 정액을 보관할 경우, 48시간에 운동성이 12%, 생존율이 30% 정도를 나타내었는데(Zou와 Yang, 2000), 본 실험에서는 운동성이 11%, 생존율이 19%로 생존율이 다소 낮은 결과를 나타내었으며(Group A), ethylene glycol을 처리한 군에서는 48시간에 운동성이 32%, 생존율이 33%로써 유의성을 가지는 결과가 나와(Group D), ethylene glycol의 효과가 다소 있음을 알 수 있었다. 그러나 48시간 이후에는 운동성과 생존율이 급격하게 감소하여 5일 이후에는 17℃에 보관한 돼지정자의 운동성이 40%, 생존율이 37%를 나타내었는데 반해, ethylene glycol을 처리후 4℃에 보관한 경우 운동성이 2.
- 33%, 생존율이 8%를 나타내었다. 따라서 ethylene glycol이 4℃에서 돼지 정액을 보관함에 있어서 48시간까지는 효과적이었으나, 보존 기간이 증가할수록 그 효과는 급격하게 감소하며, 5일 이후에는 17℃에서 보관한 돼지 정자에 비해 운동성 및 생존율이 크게 낮은 결과를 나타내어, 만족할만한 보호 효과를 나타내지는 않았다.
- 본 실험에서는 돼지정액을 Androhep 보존액을 이용하여 4℃에 보관함에 있어서 동결 보호제의 효과를 알아보고자 glycerol, DMSO, ethylene glycol을 이용하여 정자의 운동성, 생존율을 평가한 결과, ethylene glycol이 다른 동결 보호제에 비하여 유의적으로 좋은 결과를 나타내었다. 처리 후 48시간에서는 운동성이 32%, 생존율이 33%을 나타내었으며, 5일에는 운동성이 2.
- Control)가 가장 높은 생존율을 5일차까지 유지하고 있었으나, 3일차부터는 급격하게 감소하여 72시간 이후에 정자 운동성, 형태학적 특성이 현저하게 달라진다는 연구와 일치함을 나타내었다(김 등, 2001). 생존율 평가는 운동성 평가보다는 다소 높게 측정되었으나, 4℃에서 보관할 때 glycerol과 DMSO는 큰 역할을 하지 못하는 것으로 나타났으나(Table 3. Group A, B, C), 3%의 ethylene glycol을 첨가하여 4℃에서 보관한 군(Table 3. Group D)에서는 1일차 생존율이 다른 4℃ 보관군에 비해 다소 높게 측정되었으며, 5일차에서의 결과 또한 다른 4℃ 보관군에 비해 높게 측정되었다.
- 또한 72시간 이후에는 급격하게 운동성이 낮아졌다. 염색에 의한 정자의 생존율 평가 결과, 생존 정자는 30초 내에 염색되지 않아 투명한 상태였고, 사멸 정자는 정자 머리 내부까지 붉은 색으로 염색되었다. 생존율 평가에서도 역시 기존의 17℃에서 보관한 정자(Table 3.
- 이번 실험의 결과에서 실험실에서 흔히 사용되는 동결 보호제가 4℃에서 돼지정자의 열충격을 보호하는데 효과는 미비한 것으로 나타났지만, 3% ethylene glycol 처리 시 동결 보호제를 처리하지 않은 경우보다는 향상된 결과를 결과를 보여, 4℃에서 액상 정액을 보존하는 방법의 가능성을 보여주었다. 그리고, 돼지정액을 BF5 보존액 등으로 동결하였을 때, 난황이 열충격을 완화시켜주는 것처럼 다른 동결 보호제 등이 4℃에서 돼지정액을 보존할 때 열충격을 완화시켜 줄 가능성도 있다고 사료된다(Bamba과 Adams, 1990).
- 정자의 생존율은 첨가된 동결 보호제의 종류와 보존 온도에 따라 유의적인 차이가 발생하였다. 전체 보존 기간 동안 동결 보호제 첨가 없이 17℃에서 Androhep 보존액에 보존(Control group)한 정자가 동결 보호제를 첨가하여 4℃ 냉장 보존한 정자들에 비해 생존율이 높았다. 동결 보호제를 첨가하여 4℃ 냉장 보존한 정자들간에도 차이가 나타났는데, 1일째부터 3일째까지 ethylene glycol을 3% 첨가한 액상 정액(Group D)의 정자 생존율은 43.
- 정자의 운동성은 첨가된 동결 보호제의 종류와 보존 온도에 따라 유의적인 차이가 발생하였다. 전체 보존 기간 동안 동결 보호제 첨가 없이 17℃에서 Androhep 보존액에 보존(Control group)한 정자가 동결 보호제를 첨가하여 4℃ 냉장 보존한 정자들에 비해 운동성이 높았다. 동결 보호제를 첨가하여 4℃ 냉장 보존한 정자들간에도 차이가 나타났는데, 1일째부터 3일째까지 ethylene glycol을 3% 첨가한 액상 정액(Group D)의 정자 운동성은 42.
- 본 연구에서 기존의 냉장정액 보관 온도의 적정성을 분석하기 위해 온도별 정자의 운동성을 분석하였다. 채취된 정액을 4℃와 17℃에서 다르게 보관한 결과 기존의 17℃에서 보관한 정자의 운동성이 좋은 결과를 나타내었으며, 5일 동안의 운동성의 유지되는 정도도 가장 좋은 것으로 나타났다(Table 2. Control). 4℃ 보관 처리군 중 동결 보호제를 처리하지 않은 군(Table 2.
- 본 실험에서는 돼지정액을 Androhep 보존액을 이용하여 4℃에 보관함에 있어서 동결 보호제의 효과를 알아보고자 glycerol, DMSO, ethylene glycol을 이용하여 정자의 운동성, 생존율을 평가한 결과, ethylene glycol이 다른 동결 보호제에 비하여 유의적으로 좋은 결과를 나타내었다. 처리 후 48시간에서는 운동성이 32%, 생존율이 33%을 나타내었으며, 5일에는 운동성이 2.33%, 생존율이 8%를 나타내었다. 따라서 ethylene glycol이 4℃에서 돼지 정액을 보관함에 있어서 48시간까지는 효과적이었으나, 보존 기간이 증가할수록 그 효과는 급격하게 감소하며, 5일 이후에는 17℃에서 보관한 돼지 정자에 비해 운동성 및 생존율이 크게 낮은 결과를 나타내어, 만족할만한 보호 효과를 나타내지는 않았다.
후속연구
- 최근에는 돼지 정액에서 추출된 단백질 결합성 Zn 이온이 열충격에 효과적으로 작용하여 정자의 첨체 반응에 효과적이었다는 실험결과도 보고되고 있다(Mogielnicka-Brzozowska 등, 2011). 따라서 이와 같은 연구를 바탕으로 4℃에서 정액을 보관함에 있어 효과적인 동결 보호제 관련 연구를 지속적으로 수행되어 효과적인 동결 보호제 개발이 가능할 경우, 실제 양돈 농가에서 액상 정액을 보다 수월하게 보관하게 되고, 이를 통해 보다 효과적인 인공수정과 산자 생산이 가능해질 것이다.
- 하지만 이런 특정한 온도에서 돼지 액상 정액을 보관하기 위해서는 온도를 유지할 수 있는 특별한 보관용기가 별도로 필요하다. 만약, 일반적인 가정용 냉장고에서 유지할 수 있는 온도인 4℃에서 돼지 액상 정액을 효율적으로 보관할 수있는 방법이 개발된다면 실제 양돈 농가에서 액상 정액 보존의 어려움이 줄어들 것이다. 본 연구에서 기존의 냉장정액 보관 온도의 적정성을 분석하기 위해 온도별 정자의 운동성을 분석하였다.
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