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문제 정의
- 따라서 본 연구에서 본태성고혈압쥐를 대상으로 규칙적인 지구성운동에 의한 말초혈관 생성과 VEGF발현의 관련성을 확인하기 위해 골격근의 VEGF 발현을 측정하였다. 연구결과, 고혈압쥐 골격근의 VEGF 발현이 정상군에 비해 현저히 감소되어 있고, 이러한 고혈압의 VEGF 발현의 감소는 규칙적인 지구성운동에 의해 회복되는 것으로 나타났다(Fig.
- 정상군에 비해 본태성 고혈압동물(SHR)의 골격근에서 VEGF발현이 감소되어 있으나[34], AngiotensinII-유발 고혈압동물에서 규칙적인 운동이 좌심실의 모세혈관밀도와 VEGF 발현이 증가되었다는 보고[4]를 종합해 보면, 지구성운동에 의한 골격근의 VEGF 증가가 본태성 고혈압의 모세혈관밀도의 증가와 혈압강하에 중요한 요인일 가능성이 있다. 따라서 장기간 규칙적인 지구성운동이 자연발생고혈압쥐의 혈압, 골격근의 모세혈관밀도와 VEGF 단백발현에 미치는 효과를 규명하고자 한다.
- 본 연구에서 고혈압의 혈압강하에 미치는 지구성운동의 효과를 분석하기 위해 고혈압 동물을 이용하여 16주간 중강도 지구성운동을 실시하였다. 정상혈압쥐(WKY)의 수축기혈압은 123.
제안 방법
- 박절한 조직 절편은 xylene에 3회씩 3분, xylene:ethyalcohol에 3분간 처리하여 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 70% 에탄올을 각 2회씩 3분간 처리하고 증류수 처리로 함수과정을 실시하였다. Hematoxylin (MHS-32, Sigma, USA)으로 3분간 염색한 후 흐르는 물에서 수세하고 80%, 90%, 100% 에탄올에 각각 10분, 100% xylen 에 2회씩 10분간 조직을 처리하여 탈수 및 투명화 과정을 거쳤다. 모든 슬라이드는 perment mounting media를 이용하여 봉입하였다.
- Membrane의 비특이적인 반응은 5% nonfat dry milk가 첨가된 TBS-T 용액으로 상온에서 1시간 동안 반응시켜 제거하였다. VEGF-A (1:1,000, Cell signaling, USA)와 Beta-actin (1:1000, Sigma, USA)의 일차 항체를 5% skim milk가 첨가된 TBS-T 용액에 희석하여 4℃에서 18 시간 동안 반응시켰고, 이차 항체는 HRP가 부착된 rabbit-antimouse IgG (Calbiochem, USA) 를 이용하였다. 반응의 확인은 ECL detection system(Thermo, USA)을 이용하여 분석하였다.
- 고혈압의 말초혈관 생성에 미치는 장기간 지구성운동의 효과를 알아보기 위해, 골격근의 모세혈관밀도를 분석하였다(Fig. 2, Fig. 3). 모세혈관밀도는 정상혈압군(WKY)에 비해 고혈압통제군(SHR-C)에서 유의하게 감소되었으나(p<0.
- 모든 슬라이드는 perment mounting media를 이용하여 봉입하였다. 골격근의 모세혈관밀도 측정은 DP70카메라(Olympus, Tokyo)를 이용하여 100X와 300X를 촬영하고, 이미지는 TSView version 7 (Fuzhou Tucsen Image Technology, Japan)을 이용하였으며, 각각의 샘플은 9개 영역으로 구분하여 평균하여 모세혈관밀도를 계산하였다.
- 지구성운동은 중강도 트레드밀 운동방법을 이용하였고[3], 설치류 전용 트레드밀에서 속도와 운동시간을 점진적으로 늘려 16주간 실시하였다(1～3주: 12 m/min, 30분, 4～6주: 14 m/min, 40～50분, 7주: 16 m/min, 50분, 8주: 18 m/min, 60분, 9～16주: 20 m/min, 60분). 동일한 환경적 스트레스의 조건을 위해, 정상혈압군와 고혈압통제군도 고혈압운동군이 트레드밀운동을 실시할 때, 동일한 트레드밀 소음 및 진동에 노출시켰다.
- 1). 또한 이러한 지구성운동에 의한 고혈압의 혈압강하현상이 말초혈관 생성과 관련이 있는지를 확인하기 위해 골격근의 모세혈관밀도를 측정하였다. 연구결과, 고혈압쥐 골격근의 모세혈관밀도가 정상혈압군에 비해 현저히 감소되어 있었고, 이러한 고혈압의 모세혈관밀도의 감소는 규칙적인 지구성운동에 의해 정상혈압군 수준으로 회복되는 것으로 나타났다(Fig.
- Hematoxylin (MHS-32, Sigma, USA)으로 3분간 염색한 후 흐르는 물에서 수세하고 80%, 90%, 100% 에탄올에 각각 10분, 100% xylen 에 2회씩 10분간 조직을 처리하여 탈수 및 투명화 과정을 거쳤다. 모든 슬라이드는 perment mounting media를 이용하여 봉입하였다. 골격근의 모세혈관밀도 측정은 DP70카메라(Olympus, Tokyo)를 이용하여 100X와 300X를 촬영하고, 이미지는 TSView version 7 (Fuzhou Tucsen Image Technology, Japan)을 이용하였으며, 각각의 샘플은 9개 영역으로 구분하여 평균하여 모세혈관밀도를 계산하였다.
- 적출한 근조직을 4℃에서 4% paraformaldehyde (PFA) 용액에 24시간 침전시키고 파라핀 포매 후 5 μm 두께로 박절한 관상 절편은 모세혈관의 밀도 및 수의 발현을 알아보기 위해 Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하였다. 박절한 조직 절편은 xylene에 3회씩 3분, xylene:ethyalcohol에 3분간 처리하여 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 70% 에탄올을 각 2회씩 3분간 처리하고 증류수 처리로 함수과정을 실시하였다. Hematoxylin (MHS-32, Sigma, USA)으로 3분간 염색한 후 흐르는 물에서 수세하고 80%, 90%, 100% 에탄올에 각각 10분, 100% xylen 에 2회씩 10분간 조직을 처리하여 탈수 및 투명화 과정을 거쳤다.
- VEGF-A (1:1,000, Cell signaling, USA)와 Beta-actin (1:1000, Sigma, USA)의 일차 항체를 5% skim milk가 첨가된 TBS-T 용액에 희석하여 4℃에서 18 시간 동안 반응시켰고, 이차 항체는 HRP가 부착된 rabbit-antimouse IgG (Calbiochem, USA) 를 이용하였다. 반응의 확인은 ECL detection system(Thermo, USA)을 이용하여 분석하였다.
- 본 연구에서 장기간의 규칙적인 지구성운동이 고혈압의 혈압강하현상을 확인하였다(Fig. 1). 또한 이러한 지구성운동에 의한 고혈압의 혈압강하현상이 말초혈관 생성과 관련이 있는지를 확인하기 위해 골격근의 모세혈관밀도를 측정하였다.
- 사육실의 온도(23±1℃), 습도(50±5%) 및 조명(12시간 light/dart cycle)은 자동조절로 운영하였다.
- 사육실의 온도(23±1℃), 습도(50±5%) 및 조명(12시간 light/dart cycle)은 자동조절로 운영하였다. 실험동물은 실험 전 1주간의 사육실 환경적응기간을 두었으며, 무균음료 및 멸균사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 연구는 C대학교 동물윤리위원회 동물실험승인(CNU 20100241)을 받아 시행하였다.
- 장기간 지구성운동이 말초혈관 생성과 밀접한 관련이 있는 VEGF 단백의 변화를 골격근에서 확인하였다(Fig. 4). 골격근의 VEGF단백 발현은 정상혈압군(WKY)에 비해 고혈압통제군(SHR-C)에서 유의하게 감소되었으나(p<0.
- 적출한 근조직을 4℃에서 4% paraformaldehyde (PFA) 용액에 24시간 침전시키고 파라핀 포매 후 5 μm 두께로 박절한 관상 절편은 모세혈관의 밀도 및 수의 발현을 알아보기 위해 Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하였다.
- 지구성운동은 중강도 트레드밀 운동방법을 이용하였고[3], 설치류 전용 트레드밀에서 속도와 운동시간을 점진적으로 늘려 16주간 실시하였다(1～3주: 12 m/min, 30분, 4～6주: 14 m/min, 40～50분, 7주: 16 m/min, 50분, 8주: 18 m/min, 60분, 9～16주: 20 m/min, 60분). 동일한 환경적 스트레스의 조건을 위해, 정상혈압군와 고혈압통제군도 고혈압운동군이 트레드밀운동을 실시할 때, 동일한 트레드밀 소음 및 진동에 노출시켰다.
- 혈압측정은 측정 전 12시간 이상 충분한 휴식을 취한 후, tail-cuff 방법(AD instrument, USA)으로 총 3회 수축기혈압(systolic blood pressure)을 측정하여 평균을 구하였다.
대상 데이터
- A and a: WKY; WKY sedentary, B and b: SHR-C; SHR Control, C and c: SHR-E; SHR exercise. Microscope were used by 100X (left panel) and 300X (right panel). Scale bars are 100 um.
- 본 연구에서 사용한 실험동물은 6주령의 정상혈압쥐(wistar kyoto rat; WKY, n=9)와 고혈압쥐(spontaneously hypertensive rats; SHR, n=18)를 분양 받았으며, 고혈압쥐는 고혈압대조군(SHR-C, n=9)과 고혈압운동군(SHR-E, n=9)으로 무작위로 분류하였다. 사육실의 온도(23±1℃), 습도(50±5%) 및 조명(12시간 light/dart cycle)은 자동조절로 운영하였다.
데이터처리
- 본 실험의 연구결과는 SPSS 통계 프로그램을 이용하여 기술통계량을 산출하고, 혈압, 모세혈관 밀도 및 VEGF 단백 발현량의 변화에 대한 검증은 일원변량분석(one-way ANOVA) 을 이용하였으며, 사후검증은 Duncan을 이용하였다. 통계적 유의수준은 0.
성능/효과
- 골격근의 VEGF단백 발현은 정상혈압군(WKY)에 비해 고혈압통제군(SHR-C)에서 유의하게 감소되었으나(p<0.05), 고혈압운동군(SHR-E)이 고혈압대조군(SHR-C)에 비해 유의하게 증가한 것으로 나타났다(p<0.05).
- 모세혈관밀도는 정상혈압군(WKY)에 비해 고혈압통제군(SHR-C)에서 유의하게 감소되었으나(p<0.05), 고혈압통제군(SHR-C)에 비해 고혈압운동군(SHR-E)에서 유의하게 증가된 것으로 나타났다(p<0.05).
- 따라서 본 연구에서 본태성고혈압쥐를 대상으로 규칙적인 지구성운동에 의한 말초혈관 생성과 VEGF발현의 관련성을 확인하기 위해 골격근의 VEGF 발현을 측정하였다. 연구결과, 고혈압쥐 골격근의 VEGF 발현이 정상군에 비해 현저히 감소되어 있고, 이러한 고혈압의 VEGF 발현의 감소는 규칙적인 지구성운동에 의해 회복되는 것으로 나타났다(Fig. 4). 이러한 연구결과는 장기간의 규칙적인 지구성운동이 고혈압쥐 골격근의 VEGF 발현의 증가를 통해 말초혈관의 생성을 유발할 가능성이 있다는 것을 의미한다.
- 또한 이러한 지구성운동에 의한 고혈압의 혈압강하현상이 말초혈관 생성과 관련이 있는지를 확인하기 위해 골격근의 모세혈관밀도를 측정하였다. 연구결과, 고혈압쥐 골격근의 모세혈관밀도가 정상혈압군에 비해 현저히 감소되어 있었고, 이러한 고혈압의 모세혈관밀도의 감소는 규칙적인 지구성운동에 의해 정상혈압군 수준으로 회복되는 것으로 나타났다(Fig. 2, Fig. 3). 이러한 연구결과는 장기간의 규칙적인 지구성운동이 고혈압쥐 골격근의 말초혈관생성을 증가시켜 혈압을 감소시켰을 가능성이 있다는 것을 의미한다.
- 이러한 결과를 종합하면, 규칙적인 지구성운동에 의한 본태성 고혈압쥐의 혈압상승의 억제효과는 VEGF 단백 발현의 증가를 통한 말초혈관생성의 향상에 의해 나타난다는 것을 의미한다.
- 정상혈압쥐(WKY)의 수축기혈압은 123.77±0.79 mmHg, 고혈압통제군(SHR-C)는 189.89±3.49 mmHg, 그리고 고혈압운동군(SHR-E)는 174.48±2.8 mmHg를 보여(Fig. 1), 고혈압이 자연발생적으로 잘 유도된 것을 확인할 수 있었고(WKY vs SHR-C) (p<0.05), 고혈압운동군(SHR-E)이 고혈압통제군(SHR-C)에 비해 수축기 혈압이 유의하게 낮게 나타났다(p<0.05).
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