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문제 정의
- 본 연구에서는 최근 개발되고 연구되고 있는다양한 기술들, 특히 분자생물학적 미생물 군집구조 분석 기법들을 통해 새로이 밝혀지고 있는 정보(김, 2009)들이 새로운 지식으로서 기존의 실용적인 공학기법들에 연계하는 길을 열고자 한다. 따라서 본 연구에서는 다양한 조건에서 활성슬러지 반응조들을 운전하여 탈질능과 탈질박테리아의 정량적 관계를 알아보고자 하였다.
- 한다. 따라서 본 연구에서는 다양한 조건에서 활성슬러지 반응조들을 운전하여 탈질능과 탈질박테리아의 정량적 관계를 알아보고자 하였다.
- 본 연구는 기존의 탈질능을 연구하였던 공학적인 분석과 탈질 미생물 자체에 대해 연구하였던 분자생물학적인 분석의 괴리를 탈질능과 탈질 미생물의 정량관계를 도출해 냄으로서 다른 학문 분야였던 두 분석방법의 연결고리를 찾았다는 것에 큰 의의가 있다고 할 수 있다.
제안 방법
- 하수처리장에서 채취한 활성슬러 지를 30 1.크기의 MLE 반응조에서 1 SRT (Sludge re-tention time)인 20일간 운전한 뒤, 정상적인 유입수 조건을 부여한 R1 (MLE), R2 (A/O)와질 소원을 주입하지 않은 R3 (A/O)의 세 개의 반응조로 분주하여 비교운전하였다. 세 개의 반응조로 분주를 실시할 때 30 L MLE공정의 MLSS 는 6, 200 mg/L이었으며, 분주 후 각 반응조의 MLSS 농도는 5, 600 ~ 5, 900 mg/L 분포를 보였다.
- 세 개의 반응조로 분주를 실시할 때 30 L MLE공정의 MLSS 는 6, 200 mg/L이었으며, 분주 후 각 반응조의 MLSS 농도는 5, 600 ~ 5, 900 mg/L 분포를 보였다. 이 세 반응조는 24일 동안 운전되었고 운전 기간 동안 탈질능 측정을 위한 배치실험을 8 일에 한번씩 총 3번 실시하였다. Fig.
- 각 슬러지 시료의 탈질능을 측정하기 위한 배치실험은 두 가지 방법으로 실시하였다. 첫번째는 기존 연구자들이 실시했던 no3--n을 주입하는 방법((Katarzyna and Bram, 1999; Chung et al.
- NUR test와 NUiR test를 위해 각 반응조의 호기조에서 활성슬러지를 채취한 뒤 희석하여 1, 500 ~ 2,000 mg MLSS/L로 맞추었다. 슬러지 시료 내 잔존하는 모든 질소성분과 용존 유기물을 제거하기 위해 호기조건으로 1시간 교반하고 다시 혐기상태로 2시간동안 교반하여 DO 농도를 0 mg/L으로 조정하였고, pH는 7에 근접하도록 맞추었다.
- 슬러지 시료 내 잔존하는 모든 질소성분과 용존 유기물을 제거하기 위해 호기조건으로 1시간 교반하고 다시 혐기상태로 2시간동안 교반하여 DO 농도를 0 mg/L으로 조정하였고, pH는 7에 근접하도록 맞추었다. 각각 배치 측정을 위해 500 ml 삼각플라스크 여섯 개를 교반기 위에 올려놓고 N03-—N과 N02-—N을 각각 30 mg/L씩 주입하였고 COD(Glucose)는 150 mg/L를 주입하여 그 후 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 240분 단위로 10 ml씩 실시간 채취하여 GF/C 필터로 거른 뒤 이온 크로마토그래피(DX-500, Dionex, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 슬러지 시료 내 잔존하는 모든 질소성분과 용존 유기물을 제거하기 위해 호기조건으로 1시간 교반하고 다시 혐기상태로 2시간동안 교반하여 DO 농도를 0 mg/L으로 조정하였고, pH는 7에 근접하도록 맞추었다. 각각 배치 측정을 위해 500 ml 삼각플라스크 여섯 개를 교반기 위에 올려놓고 N03-—N과 N02-—N을 각각 30 mg/L씩 주입하였고 COD(Glucose)는 150 mg/L를 주입하여 그 후 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 240분 단위로 10 ml씩 실시간 채취하여 GF/C 필터로 거른 뒤 이온 크로마토그래피(DX-500, Dionex, USA)를 사용하여 측정하였다.(Katarzyna and Bram, 1999; Chung et al.
- 박테리아로 구성된 활성슬러지에서 유전자 물질을 얻기 위해서는 먼저, 활성슬러지 샘플에서 라이소자임(lysozyme)을 사용하여 peptidogly— can층을 제거한 후 상용화된 DNA extration kit(Wizard® Genomic DNA purification kit, Promega, USA)를 사용하여 활성슬러지를 구성하는 박테리아 군집의 전체 genomic DNA 를 얻었고, UV—spectrophotometer (Optizen 2120UV, Mechasys, Korea)를 사용하여 농도를 측정하였다.
- 추출된 DNA를 template로 사용하여 realtime PCR을 수행하였다. 아질산성질소의 환원에 관여하는 탈질유전자인 nirSe- nirK를 타겟으로 하는 primer를 사용하였고 SYBR® Green I분석방법을 사용하였다.
- Real-time PCR 기기는 Bio-rad사의 MyiQ Single-Color real-Time PCR Detection System을 사용하였으며 자세한 운전조건은 Table 4에 나타내었다. 본 실험에서는 일반 PCR과 다르게 마지막 사이클에서 58℃에서 0.5℃씩 증가시키면서 74회 반복하여 특성변성곡선(melting curve)을 얻었다. 증폭된 생성물의 순도를 확인하기 위해 단일 melting curve peak을 확인하였다.
- 5℃씩 증가시키면서 74회 반복하여 특성변성곡선(melting curve)을 얻었다. 증폭된 생성물의 순도를 확인하기 위해 단일 melting curve peak을 확인하였다.
- 3개의 다른 조건의 반응조에서 시료를 채취하여 COD농도는 150 mg/L로 맞추어 NO3--N과 NO2--N를 각각 30 mg/L씩 주입하여 batch 실험을 실시하였다. 반응조별로 대부분 비슷한 경향성을 나타내었고 시간이 지날수록 활성슬러지의 상태가 나빠져 탈질능이 점점 감소하는 경향을 보였다.
- Real-time PCR 분석을 통해 환경샘플에 nirSe- nirK를 가진 target gene들이 각 공정에서 얼마나 존재하는지를 정량적으로 분석하였다.
- 초기 환경샘플(standard sample)의 농도는 nirS와 nirK의 primer로 각각 증폭하여 정제한후 분광계(Optizen 2120UV, Mechasys, Ko- rea)를 사용하여 측정하였고, 환경샘플의 초기 DNA농도는 1.475 ng/uL였다. 그 농도를 토대로 10배씩 6개로 희석하여 각각의 샘플에 nirS 와 nirK의 primer를 적용하여 각각의 standard curve를 도출해냈다.
- 475 ng/uL였다. 그 농도를 토대로 10배씩 6개로 희석하여 각각의 샘플에 nirS 와 nirK의 primer를 적용하여 각각의 standard curve를 도출해냈다.(Fig.
- 모든 샘플을 real-time PCR하여 각각의 Ct 값을 구한 후 standard curve를 통해서 각각의 농도를 산출하였다. 그러나 그때의 nirS와 nirK의 농도는 초기 DNA농도인 1.
- 농도를 산출하였다. 그러나 그때의 nirS와 nirK의 농도는 초기 DNA농도인 1.475 ng/uL 를 기준으로 한 것이므로 샘플들의 원래 DNA농도로 환산하여 정량적인 양을 1 ng/ul의 DNA 당 nirS의 농도, nirK의 농도, 그리고 nirS와 nirK의 양을 합한 농도로 나타내어 Fig. 5에 탈질능과 비교하였다.
- (1) 1차 연속반응조 실험을 통해 3개의 반응조 2차 연속반응조 실험을 통해 6개의 반응조를 운전하여 다양한 활성슬러지를 확보하여 탈질능 실험인 NUR test와 본 연구에서 명명한 NUiR test를 실시하였다. 그 결과 다양한 탈질능의 값을 얻을 수 있었다.
- (2) Real-time PCR를 통해 반응조 운전간 얻어진 모든 샘플의 nirSe- nirK를 가진 탈질 미생물의 양을 정량화 했다. 각각의 샘플의 탈질능과 real-time PCR을 통해 얻어진 정량적 농도와의 관계를 비교하였다.
- 미생물의 양을 정량화 했다. 각각의 샘플의 탈질능과 real-time PCR을 통해 얻어진 정량적 농도와의 관계를 비교하였다. 그 결과 nirS를 가진 탈질 미생물의 경우에는 대부분의 탈질미생물이 가지고 있어 양에 있어서는 주류이나, 탈질능에 영향을 미치는 범위에서는 nirK를 가진 탈질 미생물이 주어진 환경과 조건에 의해 그 양이 영향을 더 많이 받기 때문에 탈질능에 영향을주는 주류라는 것을 확인하였다.
이론/모형
- PCR을 수행하였다. 아질산성질소의 환원에 관여하는 탈질유전자인 nirSe- nirK를 타겟으로 하는 primer를 사용하였고 SYBR® Green I분석방법을 사용하였다. (Table 3 참조) 시약으로 SYBR GreenTM을 포함한 상용화된 iQ SYBR Green Supermix(Bio-rad, USA)를 사용하였다.
성능/효과
- 크기의 MLE 반응조에서 1 SRT (Sludge re-tention time)인 20일간 운전한 뒤, 정상적인 유입수 조건을 부여한 R1 (MLE), R2 (A/O)와질 소원을 주입하지 않은 R3 (A/O)의 세 개의 반응조로 분주하여 비교운전하였다. 세 개의 반응조로 분주를 실시할 때 30 L MLE공정의 MLSS 는 6, 200 mg/L이었으며, 분주 후 각 반응조의 MLSS 농도는 5, 600 ~ 5, 900 mg/L 분포를 보였다. 이 세 반응조는 24일 동안 운전되었고 운전 기간 동안 탈질능 측정을 위한 배치실험을 8 일에 한번씩 총 3번 실시하였다.
- 실시하였다. 반응조별로 대부분 비슷한 경향성을 나타내었고 시간이 지날수록 활성슬러지의 상태가 나빠져 탈질능이 점점 감소하는 경향을 보였다. 그 중 대표성을 보이는 그래프를 Fig.
- 2 를 통해 3개의 다른 조건의 반응조에서 탈질능의 차이를 확인하였다. MLE 공정이 A/O 공정보다 상대적으로 탈질능이 높았고 질소원이 결핍되었던 R3에는 탈질 미생물이 거의 사멸하여 RBCOD에 의한 탈질은 거의 일어나고 있지 않고 내생탈질만이 일어났다.(Katarzyna and Bram, 1999)
- 모든 샘플에 대해 real-time PCR을 적용하여 얻어진 Ct(threshold와 증폭곡선이 교차하는 지점)값을 환경샘플을 통해 얻어진 standard curve에 적용하여 각각의 농도를 산출할 수 있었다. Fig.
- 5(B) 와 (C) 를 보면 주어진 조건에 따라 그 종이나 양의 변화가 커지고 다양해지기 때문에 탈질 미생물의 정량적 농도에 의해 탈질능이 더 영향을 준다고 판단된다. 그러므로 nirK를 가진 탈질 미생물이 탈질능에 영향을 미치는 주류라는 것을 확인할 수 있다.
- 그 결과 다양한 탈질능의 값을 얻을 수 있었다. NUR test와 NUiR test의 결과 MLE 반응조에서의 탈질능이 A/O반응조에서 보다 높았다. 이것은 MLE반응조의 내부반송 때문에 호기조에 있던 no3--n가 무산소 조로 이동하여 탈질이 되기 때문에 탈질 미생물이 더 적합하게 성장하였기 때문으로 판단된다.
- 각각의 샘플의 탈질능과 real-time PCR을 통해 얻어진 정량적 농도와의 관계를 비교하였다. 그 결과 nirS를 가진 탈질 미생물의 경우에는 대부분의 탈질미생물이 가지고 있어 양에 있어서는 주류이나, 탈질능에 영향을 미치는 범위에서는 nirK를 가진 탈질 미생물이 주어진 환경과 조건에 의해 그 양이 영향을 더 많이 받기 때문에 탈질능에 영향을주는 주류라는 것을 확인하였다.
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