형광입자의 크기와 수에 따라 형광 신호의 상관함수 변화를 측정하는 형광상관분광법을 이용하여 용액 내에서 확산 운동하는 나노크기 형광 입자들의 농도와 유체역학적 반지름을 비교하였다. 시료에 사용된 나노크기 형광 입자들은 Alexa Fluor 647, 양자점, 형광 bead이고, 증류수에서 1/10, 1/100로 입자들이 들어있는 용액을 희석하여 각 입자들에 대해 3가지의 다른 농도의 시료를 준비하였다. Alex Fluor 647의 알려져 있는 확산시간을 이용하여 형광상관분광장치의 유효초점 부피를 구하고, 각 입자들의 확산계수, 크기, 희석에 따른 농도 변화를 측정할 수 있었다. 본 연구를 통해, 자체 제작된 형광상관분광장치로 임의적으로 희석된 시료들의 농도를 약 0.1 nM ~ 10 nM의 범위에서 측정할 수 있었고, 양자점의 확산계수를 $27{\pm}1{\mu}m^2/s$로 결정할 수 있었다.
형광입자의 크기와 수에 따라 형광 신호의 상관함수 변화를 측정하는 형광상관분광법을 이용하여 용액 내에서 확산 운동하는 나노크기 형광 입자들의 농도와 유체역학적 반지름을 비교하였다. 시료에 사용된 나노크기 형광 입자들은 Alexa Fluor 647, 양자점, 형광 bead이고, 증류수에서 1/10, 1/100로 입자들이 들어있는 용액을 희석하여 각 입자들에 대해 3가지의 다른 농도의 시료를 준비하였다. Alex Fluor 647의 알려져 있는 확산시간을 이용하여 형광상관분광장치의 유효초점 부피를 구하고, 각 입자들의 확산계수, 크기, 희석에 따른 농도 변화를 측정할 수 있었다. 본 연구를 통해, 자체 제작된 형광상관분광장치로 임의적으로 희석된 시료들의 농도를 약 0.1 nM ~ 10 nM의 범위에서 측정할 수 있었고, 양자점의 확산계수를 $27{\pm}1{\mu}m^2/s$로 결정할 수 있었다.
The concentration and hydrodynamic radius of nano-sized fluorescence particles diffusing in solution were compared by using fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which can measure the variation of the correlation function of a fluorescence signal by size and number of particles. The used nano...
The concentration and hydrodynamic radius of nano-sized fluorescence particles diffusing in solution were compared by using fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which can measure the variation of the correlation function of a fluorescence signal by size and number of particles. The used nano-sized fluorescence particles are Alex Fluor 647, quantum dots, and fluorescence beads, and three kinds of sample solutions with different concentrations were prepared by dilution to 1/10 and 1/100 with distilled water for each kind of particles. The effective focal volumes were calculated by using the known diffusion coefficient of Alexa Fluor 647 particles, and the diffusion time, number of particles in focal volume, and variation of concentration according to the dilution could be measured by the FCS system. Through this study, we determined that the concentrations of arbitrarily diluted sample solutions can be measured by a home-built FCS setup in the range of 0.1 nM ~ 10 nM and that the diffusion coefficient of the quantum dot was $27{\pm}1{\mu}m^2/s$.
The concentration and hydrodynamic radius of nano-sized fluorescence particles diffusing in solution were compared by using fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which can measure the variation of the correlation function of a fluorescence signal by size and number of particles. The used nano-sized fluorescence particles are Alex Fluor 647, quantum dots, and fluorescence beads, and three kinds of sample solutions with different concentrations were prepared by dilution to 1/10 and 1/100 with distilled water for each kind of particles. The effective focal volumes were calculated by using the known diffusion coefficient of Alexa Fluor 647 particles, and the diffusion time, number of particles in focal volume, and variation of concentration according to the dilution could be measured by the FCS system. Through this study, we determined that the concentrations of arbitrarily diluted sample solutions can be measured by a home-built FCS setup in the range of 0.1 nM ~ 10 nM and that the diffusion coefficient of the quantum dot was $27{\pm}1{\mu}m^2/s$.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
가설 설정
그림 1(a)를 통해 초점의 형태를 타원형으로 가정하면 유효 초점 부피는 Veff =(4/3)πzw2으로 나타낼 수 있다. 형광 분자들은 유효 초점 부피를 출입하면 그림 1의 그래프와 같이 시간에 따른 형광 세기 요동을 일으키는데, 분자의 크기가 작거나 용액의 점성도가 낮으면 (a)와 같이 시간에 따라 형광 변동의 주기 T가 짧고, 분자의 크기가 크거나 용액의 점성도가 높으면 (b)와 같이 변동의 주기 T가 길다. 그리고, 관측 부피를 동일한 시간에 출입하는 분자의 수가 적으면 (c)와 같이 평균 형광 세기 F에 대해 형광 변동의 진폭 δF가 크고, 개수가 많으면 (d)와 같이 평균 형광 세기 F에 대해 형광 변동의 진폭 δF가 작다.
제안 방법
광원과 이색성 거울 사이에 neutral density filter를 두어 Cover glass를 통과한 레이저의 세기가 공기 중에서 400 µW가 되도록 조정하였다.
본 연구에서는 실험실에서 제작된 FCS 장치를 이용하여 증류수에서 크기가 다른 세 입자 Alexa Fluor 647, 양자점(quantum dot) 그리고 형광 bead에 의해 발생하는 형광세기의 요동을 통해 형광 신호의 자기상관함수를 측정하고, 입자 들의 농도와 유체역학적 크기를 비교하였다.
본 연구에서는 증류수에 희석된 Alexa Fluor 647, 양자점, 형광 bead에 대해 농도별로 형광신호를 측정하여 상관함수를 획득하였다. 상온에서 40초씩 20회 반복 측정된 결과들에 대해 그림 4와 같이 평균하여 나타낼 수 있었다.
본 연구에서는 크기가 다른 세 입자 Alexa Fluor 647, 양자점, 형광 bead를 증류수에 희석하여 632.8 nm의 파장을 가지는 He-Ne 레이저 광원으로 구성된 공초점 현미경에서 초점 내에 존재하는 평균적인 입자의 수와 확산 시간을 측정하고, 확산계수, 입자의 유체역학적 반지름과 용액의 농도를 구하였다. 양자점의 확산계수와 유체역학적 반지름을 27±1 µm2/s, 9±0.
그림 2는 본 연구에서 구성한 FCS 장치도를 나타낸 것이다. 빔 크기가 0.8 mm인 He-Ne레이저(Thorlab, 5 mW)는 이색성 거울(SEMOROCK, FF545/650-Di03)에서 반사된 후 대물렌즈(Olympus, NA/1.2, 60X)로 입사하였고, 대물렌즈를 통과한 광은 immersion water와 0.17 mm 두께의 cover glass를 통과하고 시료 용액 내부에 미소한 부피를 가지는 초점을 형성한다. 초점 내부를 통과하는 형광 입자들은 형광을 방출하였다.
상용 형광 현미경(Olympus IX71)을 이용하여, 공초점 현미경을 간단하게 구성하였다. 그림 2는 본 연구에서 구성한 FCS 장치도를 나타낸 것이다.
이 시료에 대해 1/10, 1/100로 희석된 시료까지 3가지 농도의 시료를 준비하였다. 양자점과 Alexa Fluor 647은 뭉침 현상이 거의 없었기 때문에 수십 nM 농도에 대해 증류수로 1/10, 1/100로 희석하여 각각 3가지 농도의 시료를 준비하였다.
연속 발진 레이저를 광원으로 사용하는 one-photon excitation 에 기초하여 FCS 장치 광학계를 구성하고, 소프트웨어 상관기를 이용하여 자기상관함수를 계산하였다.
평형 상태에서의 형광 신호 요동에 대한 자기상관함수 분석은 확산 계수(D)에 대한 정보를 제공한다. 분자가 용액 속에 있을 때 병진 확산에 대한 확산 계수 D는 Stokes-Einstein 식으로 나타낼 수 있다[6].
대상 데이터
형광 bead는 bead들끼리 뭉침을 최소화하기 위해 15분 동안의 초음파 분쇄와 5,000 RPM으로 3분간의 원심분리과정 후에 가라앉지 않은 bead 들을 사용하였다. 이 시료에 대해 1/10, 1/100로 희석된 시료까지 3가지 농도의 시료를 준비하였다. 양자점과 Alexa Fluor 647은 뭉침 현상이 거의 없었기 때문에 수십 nM 농도에 대해 증류수로 1/10, 1/100로 희석하여 각각 3가지 농도의 시료를 준비하였다.
데이터처리
각 시료들의 확산 계수는 식 (4) 의 확산계수와 확산 시간의 관계를 이용하여 확산계수가 알려져 있는 Alexa Fluor 647 (D=280 µm2/s)의 확산시간에 대한 다른 입자들의 확산 시간 비율로 확산 계수를 구하였다[12].
성능/효과
모든 결과에 대한 최적맞춤에서 z/w는 입자의 크기가 가장 작은 것으로 알려진 Alexa Fluor 647의 최적 맞춤에서 얻어진 파라미터값 10으로 고정하였다. 각각의 결과에서 초기 진폭 G(0)는 no-dilution, 1/10 dilution, 1/100 dilution 순으로 증류수에 많이 희석할수록 진폭이 높아지는 결과를 보였다. 식 (2)에서 τ=0 일 때, 초기 진폭이 입자 개수의 역수라는 것을 고려하면 희석에 의해 농도가 낮아짐을 반영한 결과라고 할수 있다.
검출기로 들어가는 광자수만큼 발생되는 pulse signal은 PCI-6602(National Instrument) 장비와 LabVIEW program에 의해 40초 동안 측정되고 그 결과가 10 µs ~ 8 s 범위에서 상관함수로 나타났다.
1 nm로 결정할 수 있었지만, 비드의 경우 불규칙적 뭉침에 의해 단일 bead의 확산계수와 유체역학적 반지름을 결정하는 것이 불가능하였다. 그리고, 12.56 fL의 유효 초점부피를 통해 본 FCS 장치에서 0.1 ~ 10 nM 농도 범위에서 입자의 확산 운동을 분석할 수 있음을 확인하였다. 본 연구를 통해, FCS 장치가 형광입자들을 많이 활용하는 생물학적 연구에 있어서 세포 내에 존재하는 매우 낮은 농도의 특정 단백질이나 DNA들의 변화를 짧은 시간에 측정할 수 있게 하는 도구로 활용될 수 있음을 확인하였다.
1 ~ 10 nM 농도 범위에서 입자의 확산 운동을 분석할 수 있음을 확인하였다. 본 연구를 통해, FCS 장치가 형광입자들을 많이 활용하는 생물학적 연구에 있어서 세포 내에 존재하는 매우 낮은 농도의 특정 단백질이나 DNA들의 변화를 짧은 시간에 측정할 수 있게 하는 도구로 활용될 수 있음을 확인하였다.
본 연구에서 사용된 Alexa Fluor 647과 bead는 pH 7인증류수에 보관되었고, 양자점은 pH 9인 borate에 보관되었다. 세 시료들은 증류수로 농도를 희석하여 사용하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
일반적으로 분자의 크기 및 동적 특성 등을 분석하는데 이용하는 것은 무엇인가?
일반적으로 분자의 크기 및 동적 특성 등을 분석하기 위해 Gel Chromatograph 또는Gel Electrophoresis(전기영동) 등이 이용되지만, 정보의 획득 과정에 시간이 많이 소요되고, 단계적인 처리 과정이 필요하다는 단점이 있다. 하지만 FCS 의 경우 수 micro-liter의 소량의 시료로 복잡한 처리 과정 없이 짧은 시간에 여러 가지 정보를 얻을 수 있는 장점을 가지고 있다[7].
형광상관분광법이란?
형광상관분광법(FCS : Fluorescence correlation spectroscopy) 은 미소영역에서 형광 분자들의 움직임에 따라 방출되는 형광 세기 변화를 측정하여 형광 분자의 속도나 크기, 분자의 수, 주변 분자들과의 상호작용을 정량적으로 분석하는 기술로서[1, 2], 1970년대에 FCS가 Webb과 Rigler에 의해 개발되었지만[3-5]최근 광학 기술의 발달과 함께 생물물리학 분야에서 매우 유용한 기술로 자리잡고 있다[6].
형광상관분광법의 장점은?
일반적으로 분자의 크기 및 동적 특성 등을 분석하기 위해 Gel Chromatograph 또는Gel Electrophoresis(전기영동) 등이 이용되지만, 정보의 획득 과정에 시간이 많이 소요되고, 단계적인 처리 과정이 필요하다는 단점이 있다. 하지만 FCS 의 경우 수 micro-liter의 소량의 시료로 복잡한 처리 과정 없이 짧은 시간에 여러 가지 정보를 얻을 수 있는 장점을 가지고 있다[7].
참고문헌 (13)
S. H. Kim, T. Shin, and D. Kim, "Particles size measurement of silole nano-clusters by fluorescence correlation spectroscopy," J. Korean Phys. Soc. 56, 1264-1268 (2010).
P. Schwille, U. Haupts, S. Maiti, and W. W. Webb, "Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation," Biophys. J. 77, 2251-2265 (1999).
A. Einstein, "On the movement of small particles suspended in a stationary liquid demanded by the molecular kinetic theory of heat," Ann. Phys. 17, 549-560 (1905).
J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. (Springer Science+Business Media, New York, USA, 2006), Chapter 24.
P. Kask, P. Piksarv, M. Pooga, T. Mets, and E. Lippmaa, "Separation of the rotational contribution in fluorescence correlation experiments," Biophys. J. 55, 213-220 (1989).
R. Rieger, C. Rocker, and G. U. Nienhaus, "Fluctuation correlation spectroscopy for the advanced physics laboratory," Am. J. Phys. 73, 1129-1134 (2005).
P. Zhang, L. Li, C. Dong, H. Qian, and J. Ren, "Sizes of water-soluble luminescent quantum dots measured by fluorescence correlation spectroscopy," Analytica Chimica Acta 546, 46-51 (2005).
K. Wang, X. Qiu, C. Dong, and J. Ren, "Single-molecule technology for rapid detection of DNA hybridization based on resonance light scattering of gold nanoparticles," ChemBioChem 8, 1126-1129 (2007).
J. Enderlein, I. Gregor, D. Patra, T. Dertinger, and U. B. Kaupp, "Performance of fluorescence correlation spectroscopy for measuring diffusion and concentration," ChemPhysChem 6, 2324-2336 (2005).
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.