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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 반하가 다낭성 난소 증후군에 미치는 영향을 알아보고자 다낭성 난소 증후군을 유발한 흰쥐에 반하 추출물을 투여하여 흰쥐 난소의 무게, 조직병리학적 소견, IGFR 발현 양상 등을 관찰하였다.
- 이에 저자는 반하(Pinelliae Rhizoma, PR)가 다낭성 난소 증후군이 유발된 흰쥐의 난소에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 흰쥐에 다낭성 난소 증후군을 유발하고, PR이 함유된 식이를 투여한 다음, 체중과 난소 무게를 측정하고, 조직을 염색하여 난소의 유발 양상과 Insulin like Growth Factor Receptor(IGFR) 발현 양상을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- . 4 ㎛ 두께의 조직을 자일렌과 알콜, 증류수를 차례로 이용하여 파라핀을 제거한 다음, 인산완충액으로 수세하였다. 준비된 조직 절편은 IGFR 검출을 용이하게 하기 위하여 0.
- EV에 의해 다낭성 난소 증후군이 유발된 흰쥐에 PR을 경구 투여하고, 체중, 식이량 및 음수량의 변화, 난소 외형의 육안적 소견과 무게, 난소 조직의 조직 병리학적 소견과 IGFR 발현 정도를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 정상군은 다낭성 난소 증후군을 유발하지 않고, 5주간 정상 식이를 투여하였고, 대조군은 다낭성 난소 증후군을 유발시킨 후, 5주간 정상 식이를 투여하였다. PR 투여군은 다낭성 난소 증후군을 유발시킨 후, PR 추출물을 1 g/kg으로 고형 사료에 섞어 투여하였다.
- 는 月經不調의 원인을 血虛, 濕痰, 腎虛, 血熱, 瘀血 등으로 보고 補血調經, 健脾化濕, 補腎養陰, 淸火滋陰, 活血化瘀하는 치법으로 人蔘養榮湯, 蒼莎導痰湯, 固陰煎, 加減一陰煎, 少腹逐瘀湯 등을 사용하였다. 不姙에 있어서는 血虛, 經水不調, 子宮虛冷을 치료하기 위해 百子附歸丸, 調經種玉湯, 溫經湯 등을 사용하였고, 腎虛에는 毓麟珠, 八味丸, 血瘀에는少腹逐瘀湯 등을 사용하였다.
- 0)를 첨가한 후 microwave oven에서 600W로 5분간 2회에 걸쳐 가 열되었다. 가열이 끝난 후 peroxidase를 불활성화 시키기 위하여 3 % 과산화수소를 첨가하고 비특이적 결합을 방지하기 위해 5 % goat serum(0.1 % BSA)를 처리하였다. Blocking이 끝난 조직에 IGFR 항체(1:500, Millipore, USA)를 처리하고 4℃에서 다음날까지 배양하였다.
- 6%), 사람보다 10배 이상 빠른 흰쥐의 대사 속도를 감안하여 흰쥐 1마리당 1일 투여 용량을 계산한 결과 10～15 ㎎/day로 계산되었다. 계산된 PR 추출물을 흰쥐의 1일 고형 사료 섭취량(15 g)에 골고루 섞어서 실험 식이를 제작하였으며, 고형 사료 1 ㎏당 PR 추출물 1.5 g이 포함된 것은 사람의 1일 투여 용량(g/kg)의 10배에 해당한다. 자세한 고형 사료의 조성은 Table 1과 같다(Table 1).
- 구입, 정선한 PR 100 g을 증류수 1,000㎖과 함께 전기약탕기를 이용하여 3시간 동안 전탕한 후, 거즈로 걸러 전탕액을 얻었다. 얻어진 전탕액을 5,000 g에서 10분간 원심분리하여 찌꺼기는 버리고 상청액을 얻은 다음 감압 농축하고, 동결 건조기를 이용하여 동결건조 분말을 조제 하였다.
- 이렇게 하여 얻어진 EV 용액을 20㎎/㎏의 분량으로 1회 근육 주사하였고, 정상군은 동일한 양의 Sesame oil을 근육 주사하였다. 근육 주사 후 2일간 관찰한 다음, 5주간 약물을 투여하였다.
- 실험 식이가 제공되는 5주간 주 1회 체중 변화를 관찰하였다. 난소 무게의 측정은 실험 마지막 날, 전자저울을 이용하여 실시하였다. 난소의 적출을 위하여 흰쥐를 희생시킨 후, 복강 정중선을 따라 절개하여 복강을 개방하고 측, 후면의 난소를 드러낸 다음, 난소 하부를 절단하고 지방 조직을 조심스럽게 제거한 후 좌, 우측의 난소 무게를 각각 측정 하였다.
- 난소 무게의 측정은 실험 마지막 날, 전자저울을 이용하여 실시하였다. 난소의 적출을 위하여 흰쥐를 희생시킨 후, 복강 정중선을 따라 절개하여 복강을 개방하고 측, 후면의 난소를 드러낸 다음, 난소 하부를 절단하고 지방 조직을 조심스럽게 제거한 후 좌, 우측의 난소 무게를 각각 측정 하였다.
- 다낭성 난소 증후군을 유발을 위하여 ß-Estradiol 17-Valerate(EV, Sigma, USA)를 사용하였고, 조직 염색과 관찰을 위하여 rabbit polyclonal antibody for IGFR (1:500, Millipore, Billerica, MA, USA), Vetastain ABC elite kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 등을 사용하였다.
- 정상군(Normal group, NOR, n=8)은 EV를 녹이지 않은 Sesame oil 200 ㎕를 대퇴부에 근육 주사하였다. 대조군(Control group, CTL, n=8)과 실험군(PR group, PR, n=8)은 EV를 Sesame oil에 20 ㎎/㎏의 분량으로 녹여 마리당 200 ㎕씩 대퇴부에 근육 주사하였다.
- Blocking이 끝난 조직에 IGFR 항체(1:500, Millipore, USA)를 처리하고 4℃에서 다음날까지 배양하였다. 면역조직화학염색은 Vetastain ABC elite kit를 이용하여 avidin-biotin peroxidase complex 방법으로 시행되었으며, 제작자가 제시한 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였다. IGFR 염색과 대조염색을 위하여 핵을 파란색으로 염색할 수 있는 hematoxylin을 이용하였다.
- 측정 단위는 24시간으로 전일 오후 2시에 고형 사료와 음용수를 공여한 후, 다음 날 2시에 남은 사료와 음용수의 양을 측정하여 그 차이를 하루 동안의 식이량 및 음수량으로 계산하였다. 모든 측정은 cage단위로 이루어졌으며, 측정된 값을 cage에 사육된 마리수인 4로 나누어 개체당 식이량 및 음수량으로 제시하였다.
- 흰쥐로부터 얻어진 난소를 10 % 포르말린에 고정하여 파라핀에 고정한 후 미세절단기를 이용하여 고정된 조직을 4㎛ 두께로 잘라 슬라이드 글라스 위에 부착하였다. 부착된 조직으로부터 파라핀을 제거하고 hematoxylin과 eosin을 이용하여 염색한 후 광학현미경으로 관찰 하였다.
- 실험 시작일부터 5주간 식이량 및 음수량 변화를 관찰하였다. 측정 단위는 24시간으로 전일 오후 2시에 고형 사료와 음용수를 공여한 후, 다음 날 2시에 남은 사료와 음용수의 양을 측정하여 그 차이를 하루 동안의 식이량 및 음수량으로 계산하였다.
- 실험 식이가 제공되는 5주간 주 1회 체중 변화를 관찰하였다. 난소 무게의 측정은 실험 마지막 날, 전자저울을 이용하여 실시하였다.
- 구입, 정선한 PR 100 g을 증류수 1,000㎖과 함께 전기약탕기를 이용하여 3시간 동안 전탕한 후, 거즈로 걸러 전탕액을 얻었다. 얻어진 전탕액을 5,000 g에서 10분간 원심분리하여 찌꺼기는 버리고 상청액을 얻은 다음 감압 농축하고, 동결 건조기를 이용하여 동결건조 분말을 조제 하였다. 얻어진 추출물은 3.
- 45 mm Syringe Filter(Whatman, Springfield, UK)로 걸러 줌으로써 멸균을 대신하였다. 이렇게 하여 얻어진 EV 용액을 20㎎/㎏의 분량으로 1회 근육 주사하였고, 정상군은 동일한 양의 Sesame oil을 근육 주사하였다. 근육 주사 후 2일간 관찰한 다음, 5주간 약물을 투여하였다.
-
3) 실험군의 선정
정상군(Normal group, NOR, n=8)은 EV를 녹이지 않은 Sesame oil 200 ㎕를 대퇴부에 근육 주사하였다. 대조군(Control group, CTL, n=8)과 실험군(PR group, PR, n=8)은 EV를 Sesame oil에 20 ㎎/㎏의 분량으로 녹여 마리당 200 ㎕씩 대퇴부에 근육 주사하였다.
- 정상군은 다낭성 난소 증후군을 유발하지 않고, 5주간 정상 식이를 투여하였고, 대조군은 다낭성 난소 증후군을 유발시킨 후, 5주간 정상 식이를 투여하였다. PR 투여군은 다낭성 난소 증후군을 유발시킨 후, PR 추출물을 1 g/kg으로 고형 사료에 섞어 투여하였다.
- 시료 조제를 위하여 전기약탕기(대웅, 한국), 감압농축기(EYELA, Japan), 동결건조기(Labconco, Missouri, USA), 강제순환건조기(제이오텍, 한국)를 사용하였고, 체중 및 난소 무게의 측정을 위하여 전자저울(한성, 한국)을 사용하였다. 조직 관찰을 위하여 미세절단기(Microtome, Leica, Wetzlar, Germany), 광학현미경(Olympus, Japan) 등을 사용하였다.
- 실험 시작일부터 5주간 식이량 및 음수량 변화를 관찰하였다. 측정 단위는 24시간으로 전일 오후 2시에 고형 사료와 음용수를 공여한 후, 다음 날 2시에 남은 사료와 음용수의 양을 측정하여 그 차이를 하루 동안의 식이량 및 음수량으로 계산하였다. 모든 측정은 cage단위로 이루어졌으며, 측정된 값을 cage에 사육된 마리수인 4로 나누어 개체당 식이량 및 음수량으로 제시하였다.
- 흰쥐로부터 얻어진 난소를 10 % 포르말린에 고정하여 파라핀에 고정한 후 미세절단기를 이용하여 고정된 조직을 4㎛ 두께로 잘라 슬라이드 글라스 위에 부착하였다. 부착된 조직으로부터 파라핀을 제거하고 hematoxylin과 eosin을 이용하여 염색한 후 광학현미경으로 관찰 하였다.
대상 데이터
- 실험 동물은 160～180 g의 S/D계 암컷 백서를 샘타코(인천, 한국)로부터 구입하여 사용하였다. 1주일 이상, 고형 사료(삼양 배합 사료 실험 동물용, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경에 충분히 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험실 환경은 온도 22±2℃를 유지하면서 12시간 단위로 낮과 밤이 계속되는 상황을 실험 종료 시까지 유지하였다.
- 면역조직화학염색은 Vetastain ABC elite kit를 이용하여 avidin-biotin peroxidase complex 방법으로 시행되었으며, 제작자가 제시한 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였다. IGFR 염색과 대조염색을 위하여 핵을 파란색으로 염색할 수 있는 hematoxylin을 이용하였다.
- 半夏(Pinelliae Rhizoma, PR)는 천남성과(天南星科)에 속한 다년생 초본인 끼무릇(Pinellia ternata Breitenbach)의 코르크층을 제거한 塊莖을 건조한 것으로 동신대학교 목동한방병원을 통하여 구입, 정선하여 사용하였다.
- 시료 조제를 위하여 전기약탕기(대웅, 한국), 감압농축기(EYELA, Japan), 동결건조기(Labconco, Missouri, USA), 강제순환건조기(제이오텍, 한국)를 사용하였고, 체중 및 난소 무게의 측정을 위하여 전자저울(한성, 한국)을 사용하였다. 조직 관찰을 위하여 미세절단기(Microtome, Leica, Wetzlar, Germany), 광학현미경(Olympus, Japan) 등을 사용하였다.
- 실험 동물은 160～180 g의 S/D계 암컷 백서를 샘타코(인천, 한국)로부터 구입하여 사용하였다. 1주일 이상, 고형 사료(삼양 배합 사료 실험 동물용, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경에 충분히 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 결과의 차이를 검정할 때에는 Student’s t-test로 검정하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 Sigma plot(Sigma plot for Windows, ver. 9.0, USA)를 이용하였다.
이론/모형
- EV의 1회 근육 주사법17)을 이용하여 다낭성 난소 증후군을 유발하였다. Sesame oil(Sigma, USA)에 EV를 녹인 후, 0.
- Histo-pathological changes of ovary were observed using haematoxylin and eosin stain methods. (A) NOR, (B) CTL, (C) PR.
- IGFR의 발현 양상은 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry)을 이용하여 관찰하였다18). 4 ㎛ 두께의 조직을 자일렌과 알콜, 증류수를 차례로 이용하여 파라핀을 제거한 다음, 인산완충액으로 수세하였다.
성능/효과
- 1. 대조군에서 나타나는 체중 증가 억제에는 특별한 영향을 미치지 않았다.
- 2. 식이량 및 음수량에는 특별한 영향을 미치지 않았다.
- 3. 육안적 관찰에서 난소의 비정상적인 팽대가 감소하는 경향을 보였다.
- 4. 대조군에서 관찰된 난소 크기 감소를 유의한 수준으로 억제하였다.
- 5. 대조군에서 보이던 낭성 난포의 형성을 억제하였다.
- 5주간의 약물 투여 기간 동안 식이량 및 음수량 변화를 관찰한 결과 모든 군에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Table 2).
- 6. 증가된 IGFR 발현 양에는 특별한 영향을 미치지 않았다.
- 2 g/㎖로 증류수에 희석하여 상기한 비율의 고형 사료와 섞어 실험 식이를 제작하였다. PR 추출물의 투여 용량은 사람(60 ㎏)의 1일 투여 용량을 9～12 g으로 하였을 때, 흰쥐와 사람의 무게비(1/300), 시료 추출 수율(3.6%), 사람보다 10배 이상 빠른 흰쥐의 대사 속도를 감안하여 흰쥐 1마리당 1일 투여 용량을 계산한 결과 10～15 ㎎/day로 계산되었다. 계산된 PR 추출물을 흰쥐의 1일 고형 사료 섭취량(15 g)에 골고루 섞어서 실험 식이를 제작하였으며, 고형 사료 1 ㎏당 PR 추출물 1.
- 3A). 각 군 간에 체중 차이가 있어 체중에 대한 난소 무게의 비율을 계산한 결과 역시 PR 투여에 의하여 난소의 무게비가 유의하게 증가함을 알 수 있었다 (Fig. 3B). 난소 무게 감소를 억제하는 경향을 보인 것은 PR이 난소의 실질에 어느 정도 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
- 난소/체중비를 계산한 결과 대조군에서 정상군에 비하여 유의한(p<0.05) 난소/체중비의 감소가 관찰되었고, PR 투여군에서는 대조군과 비교하여 유의한(p<0.05) 수준의 난소/체중비 회복이 관찰되었다(Fig. 3B).
- 2C). 난소의 무게를 측정한 결과, 대조군의 난소 무게는 정상군에 비하여 유의한 수준으로 감소하였고, PR 투여군에서는 난소 무게 감소가 유의한 수준으로 억제되었다(Fig. 3A). 각 군 간에 체중 차이가 있어 체중에 대한 난소 무게의 비율을 계산한 결과 역시 PR 투여에 의하여 난소의 무게비가 유의하게 증가함을 알 수 있었다 (Fig.
- 다낭성 난소 증후군을 유발하고 5주간 PR 식이를 투여하면서 체중 변화를 관찰한 결과 정상군에서 보이는 정상적인 체중 증가가 대조군에서는 억제되는 경향을 보였으며, PR 투여군은 이러한 체중 증가율 감소에 유의한 영향을 미치지 않았다(Fig. 1).
- 인슐린 저항성은 다낭성 난소 증후군의 절대적인 요소는 아니지만, 유전적 요인, 대사성 요인 및 환경적 요인과 결합하여 상당 부분 연관이 있다는 이론이 있으며23), 최근 연구에 의하면 다낭성 난소 증후군이 발생한 인간의 난소 조직에서 IGFR의 mRNA가 증가함이 알려져있다39). 본 연구 결과에서 정상군에 비하여 대조군에서 IGFR의 발현이 증가하는 경향을 보였으며, PR 투여군에서는 대조군과 유사한 양상을 보였다(Fig. 5A). 이러한 결과에서 PR의 다낭성 난소 증후군 형성 억제 작용이 인슐린 저항성 등과 같은 요인에 기인할 가능성 보다는 염증 억제 등과 같은 다른 기전에 의해 이루어질 가능성이 더 높음을 유추할 수 있다.
- . 본 연구 결과에서 정상군의 난소는 정상적인 형태를 보였으며 붉게 충혈 되어 있었고(Fig. 2A), 대조군의 난소는 비정상적으로 팽창된 형태를 보였고, 크기도 작았다(Fig. 2B).
- . 본 연구에서 정상군의 난소는 초기 난포와 2차 난포 등이 보이는 정상 상태를 보인데 반해(Fig 4A), 대조군의 난소는 대형 낭성 난포가 관찰되는 등 다낭성 난소 증후군의 전형적인 특징을 보였으며(Fig. 4B), PR 투여군에서는 정상군에서 보이던 초기 난포와 2차 난포가 보이고, 낭성 난포의 크기는 감소하는 경향을 보였다(Fig. 4C). 이러한 결과는 PR이 낭성 난포의 형성을 억제할 가능성이 있는 것으로 해석된다.
- . 본 연구의 결과에서 5주간의 EV 투여는 정상군에 비하여 유의한 수준으로 체중 증가 억제 경향을 보였으며, PR 투여는 이러한 경향에 특별한 영향을 미치지 않았다(Fig. 1).
- 실험 마지막 날, 흰쥐의 난소를 적출하여 좌, 우 난소의 무게를 측정한 결과 대조군에서 정상군에 비하여 유의한(p<0.05) 난소 무게 감소가 관찰되었고, PR 투여군에서는 대조군과 비교하여 유의한(p<0.05) 수준의 난소 무게 회복이 관찰되었다(Fig. 3A).
- 이상을 정리해 보면 PR은 다낭성 난소 증후군이 유발된 흰쥐에서 체중, 식이량, 음수량에는 특별한 영향을 미치지 않으면서, 난소의 크기 감소를 유의한 수준으로 억제하였으며, 낭성 난포 형성을 억제하였다. 이러한 결과를 볼 때 PR은 다낭성 난소 증후군에서 발생하는 낭성 난포 형성, 난소 무게 감소 등에 효과가 있는 것을 알 수 있다. 이러한 경과는 추후 다낭성 난소 증후군 환자의 치료에 참고할 수 있을 것이며, 아울러 이의 명확한 기전 탐구를 위한 후속 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 5A). 이러한 결과에서 PR의 다낭성 난소 증후군 형성 억제 작용이 인슐린 저항성 등과 같은 요인에 기인할 가능성 보다는 염증 억제 등과 같은 다른 기전에 의해 이루어질 가능성이 더 높음을 유추할 수 있다.
- 이상을 정리해 보면 PR은 다낭성 난소 증후군이 유발된 흰쥐에서 체중, 식이량, 음수량에는 특별한 영향을 미치지 않으면서, 난소의 크기 감소를 유의한 수준으로 억제하였으며, 낭성 난포 형성을 억제하였다. 이러한 결과를 볼 때 PR은 다낭성 난소 증후군에서 발생하는 낭성 난포 형성, 난소 무게 감소 등에 효과가 있는 것을 알 수 있다.
후속연구
- 이러한 결과를 볼 때 PR은 다낭성 난소 증후군에서 발생하는 낭성 난포 형성, 난소 무게 감소 등에 효과가 있는 것을 알 수 있다. 이러한 경과는 추후 다낭성 난소 증후군 환자의 치료에 참고할 수 있을 것이며, 아울러 이의 명확한 기전 탐구를 위한 후속 연구가 진행되어야 할 것이다.
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