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문제 정의
- 이전의 연구 결과 STC에 의해 세라마이드가 형성되었고 이러한 세라마이드가 STC에 의한 세포사멸 유도에 중요하다는 것을 알 수 있었다[25]. 따라서 본 연구에서는 STC와 구조 유사체인 STD도 세라마이드를 생성하는지를 면역형광염색법 으로 살펴보았다. Fig.
- 또한 이전의 연구에서 Thelenota anax로부터 분리한 STC가 Fas 및 caspase-8 활성에 의한 산성 SMase의 활성화와 glutathione 고갈에 의한 중성 SMase의 활성화를 통해 세라마이드를 형성하여 백혈병 세포의 세포사멸을 유도하며 HL-60 세포의 이종 이식 종양 모델에서도 항암작용을 나타낸다는 것을 알 수 있었다[25]. 따라서 본 연구에서는 STC와 구조가 유사한 STD를 사용하여 백혈병 세포의 세포사멸 유도 및 이의 분자적 기전을 규명하여 STC와의 작용 및 기전과 비교하여 보다 효과적인 해양 트리테르펜 글리코시드의 구조적특징을 살펴보고자 하였다. STC와 STD를 K562 세포에 처리 하여 세포 사멸을 확인한 결과 시간과 농도 의존적으로 세포 사멸이 일어남을 확인할 수 있었다.
- 따라서 본 연구에서는 세라마이드 생성을 증가시켜 세포 사멸을 유도하는 STC와 구조가 유사한 STD (glucose를 함유 하는 hexaoside, Fig. 1A)를 사용하여 백혈병 세포에서 STC와 같은 세포사멸 유도 및 항암작용이 있는지와 이의 분자적 기전을 규명하여 구조적 차이에 의한 작용이나 기전에 차이가 있는지를 조사하고자 한다.
- 4B). 이러한 결과를 바탕으로 STC와 STD에 의한 세라마이드의 생성을 관찰하기 위하여, 세라마이드 항체에는 FITC를 붙이고, 산성과 중성 SMase 항체에는 각각 PE를 붙여 면역형광염색법으로 확인해 보았다. 그 결과, 앞서 확인한 바와 같이 STC에 의한 산성과 중성 SMase의 활성화를 관찰할 수 있었으나 예상한 바와 같이 FB1에 의해서는 이들 활성화에 변함이 없었다.
제안 방법
- 0.1% DMSO와 0.5 μM STC 및 1.0 μM STD 혹은 다른 시약을 첨가하여 반응시킨 세포를 수확하여 PBS 완충용액으로 세척한 후, 20 mM Tris (pH 8.0), 137 mM NaCl, 10% glycerol, 1% NP-40, 10 mM EDTA, 100 mM NaF, 1 mM PMSF 그리고 10 mg/ml leupeptin이 포함된 세포용해 완충용액을 첨가한 다음 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 단백질을 추출하고, Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad Lab., Richmond, CA)를 사용하여 단백질 양을 측정한 다음 8% 또는 10% SDS-PAGE로 단백질을 분리하고, PVDF membrane (Amersham Life Science, Inc., Piscataway, NJ)에 분리된 단백질을 전사한 후, 5% skim milk가 첨가된 PBS-T로 상온에서 1시간 동안 배양하였다.
- 0.1% DMSO와 0.5 μM STC 및 1.0 μM STD를 첨가하여 반응시킨 세포를 수확하여 PBS 완충용액으로 세척한 후, 1 M NaCl, 10 mM NaH2PO4, 100 mM Na2 HPO4, 100 mM EDTA, 1 M sucrose, 6.15 mg/ml digitonin 그리고 25× cocktail이 포함된 완충용액을 첨가한 다음 잘 섞어주고, 상온에서 30분간 배양하였다.
- 0.1% DMSO와 0.5 μM STC 및 1.0 μM STD를 첨가하여 반응시킨 세포를 수확하여 PBS 완충용액으로 세척한 후, 50 nM DiOC6를 처리한 RPMI1640 배지를 1 ml 가하여 빛을 차단하고 30분 동안 37℃에 반응 후 세포를 수확하여 유세포 분석기(FACScan, Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 분석하였다[19].
- In vivo에서 STD에 의한 항암 효과를 확인하기 위하여 면역결핍 생쥐에 HL-60 세포를 이종 이식하여 종양 모델을 만들었다. HL-60 세포를 면역결핍 생쥐의 옆구리 피하에 주사하여 종양을 만든 후 종양이 어느 정도 자랐을 때 STC와 STD를 면역결핍 생쥐의 꼬리에 3일 마다 주사하여 종양의 크기를 관찰하였다. STC 또는 STD를 주사하지 않은 대조군에서는 종양의 크기가 빨리 증가하였으나 STC 또는 STD를 주사한 실험군에서는 종양의 성장이 크게 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- In vivo 상에서 STC 및 STD의 항암 효과를 알아보기 위해 2×107개의 HL-60 세포를 100 μl의 PBS에 부유시켜 6∼7주령의 면역결핍 생쥐의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다[19].
- In vivo에서 STD에 의한 항암 효과를 확인하기 위하여 면역결핍 생쥐에 HL-60 세포를 이종 이식하여 종양 모델을 만들었다. HL-60 세포를 면역결핍 생쥐의 옆구리 피하에 주사하여 종양을 만든 후 종양이 어느 정도 자랐을 때 STC와 STD를 면역결핍 생쥐의 꼬리에 3일 마다 주사하여 종양의 크기를 관찰하였다.
- STD가 세포사멸을 유도하는 데 어떠한 경로를 경유하는지를 살펴보기 위하여 K562 세포에 0.5 μM STC와 1.0 μM STD를각각 2, 4, 6시간 처리하고, Western blot을 이용하여 여러 가지 caspase들의 활성을 관찰하였다.
- 만성 골수성 백혈병 세포주인 K562 세포에 대한 STD의 세포 성장에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 농도별 및 시간별로 STD를 첨가하여 배양시킨 후, annexin V/PI 염색법을 사용 하여 세포 사멸 정도를 관찰하였다. STD는 K562 세포의 세포 사멸을 농도 및 시간 의존적으로 유도하였다(Fig. 1B와 1C). 이러한 STD의 세포 사멸 유도 효과가 K562 세포에만 국한되는지를 살펴보기 위하여 다른 백혈병 세포주인 HL-60 세포에 미치는 영향을 관찰한 결과 정도의 차이는 있으나 HL-60 세포 에서도 역시 STD에 의한 세포사멸이 관찰되었다(Fig.
- 각 세포를 6 well plates에 세포 수가 3×105/ml이 되도록 분주하여 0.1% DMSO (대조군) 및 다양한 농도의 STC와 STD 를 첨가하여 2, 4, 및 6시간 배양하였고 또한 여러 가지 저해제의 영향을 살펴보기 위하여 0.5 μM STC와 1.0 μM STD를 처리하기 1시간 전에 저해제들을 처리하여 배양하였다.
- 배양 후, 배양된 세포들을 수확하여 200 μl의 annexin V binding buffer를 넣은 후, annexin V-FITC와 PI를 5 μl 첨가하고, 빛을 차단하여 37 C에서 15분간 반응한 후, 유세포 분석기(FACScan, Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 세포 10,000개 당 apoptotic cell의 수를 측정하였다[19]. 각 실험은 3회 반복하여 시행하였다.
- 1% Triton X-100을 사용하여 permeabilization한다. 다시 PBS 완충용액으로 3회 세척한 후, 일차 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고, PBS 완충용액으로 3회 세척한 후, FITC 또는 PE-conjugated anti-rabbit IgG나 anti-mouse IgG로 1시간 동안 상온에서 반응시키고, PBS 완충용액으로 3회 세척하여 mount 용액을 떨어뜨린 후, 커버 유리로 덮어 Zeiss LSM 510 confocal microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)를 사용하여 이미지를 얻었다[2].
- 또한 STC와 STD에 의해 미토콘드리아 경로가 활성화되는지를 확인하기 위하여 MMP (Δψm)를 측정하고 세포질과 미토콘드리아 분획을 분리하여 단백질 발현을 Western blot을 이용하여 확인하였다.
- 또한 STD에 의한 항암 효과를 in vivo에서 확인하기 위해면역결핍 생쥐에 HL-60 세포를 이종 이식하여 종양을 만든 후 STC 또는 STD를 주사하여 종양 크기를 측정하였다. STC와 STD를 주사하지 않은 대조군에 비해 STC 또는 STD를 주사한 실험군에서는 종양의 성장이 크게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한, STD에 의한 세라마이드 형성이 STD에 의한 세포사멸에 중요한지와 세라마이드 합성효소의 활성에 의한 것인지를 관찰하기 위하여 세라마이드 합성효소 저해제인 fumonisin B1 (FB1)을 STC와 STD를 처리하기 1시간 전에 첨가하여 배양하였다. STC에 의한 세포사멸은 FB1에 의해서 저해되지 않았고 STD에 의한 세포사멸은 FB1에 의해서 부분적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 만성 골수성 백혈병 세포주인 K562 세포에 대한 STD의 세포 성장에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 농도별 및 시간별로 STD를 첨가하여 배양시킨 후, annexin V/PI 염색법을 사용 하여 세포 사멸 정도를 관찰하였다. STD는 K562 세포의 세포 사멸을 농도 및 시간 의존적으로 유도하였다(Fig.
- 배양 후, 배양된 세포들을 수확하여 200 μl의 annexin V binding buffer를 넣은 후, annexin V-FITC와 PI를 5 μl 첨가하고, 빛을 차단하여 37 C에서 15분간 반응한 후, 유세포 분석기(FACScan, Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 세포 10,000개 당 apoptotic cell의 수를 측정하였다[19].
- 3A에서 보는 바와 같이 STD에 의해서도 STC에서처럼 세라마이드가 생성됨을 알 수 있었다. 이러한 STD에 의한 세라마이드 생성이 STD에 의한 세포 사멸에 중요한지와 STC에서처럼 산성 SMase의 활성과 중성 SMase의 활성에 의한 것인지를 확인하기 위하여 산성 SMase의 저해제인 desipramine과 중성 SMase의 저해제인 GW4869를 각각 STC와 STD를 처리하기 1시간 전에 첨가하여 배양하였다. STC에 의한 세포 사멸이 desipramine과 GW4869에 의해서 부분적으로 억제되는 것을 관찰하였으나, STD에 의한 세포 사멸은 desipramine과 GW4869에 의해서 억제되지 않음을 알 수 있었다 (Fig.
- 1B와 1C). 이러한 STD의 세포사멸 유도 효과를 비교하기 위하여 양성 대조군으로 STC를 사용하였다. Fig.
- 3B, 3C). 이러한 결과를 바탕으로 STC와 STD에 의한 세라마이드의 생성이 산성 및 중성 SMase의 활성화에 의한 것인 지를 관찰하기 위하여, 세라마이드 항체에는 FITC를 붙이고, 산성과 중성 SMase 항체에는 각각 PE를 붙여 면역형광염색법 으로 확인해 보았다. 그 결과, STC에 의한 산성과 중성 SMase의 활성화를 육안으로 관찰할 수 있었고 또한 세라마이드의 생성도 확인할 수 있었다.
- 795 μg/kg의 STD를 생쥐의 꼬리에 3일에 1번씩 주사하였으며, 종양의 크기는 측경 양각기(Caliper)를 사용하여 측정하였다. 일정 시간이 지난 후에 마우스의 종양을 떼어 무게를 측정하고, 구획을 나눠 냉동시키거나 파라핀으로 고정시켜 면역조직화학염색(Immunohistochemistry)을 시행하였다.
- 종양의 크기가 60∼100 mm3 정도 되었을 때, 대조군에는 PBS 완충용액을, 실험군에는 7.19 μg/kg의 STC와 21.795 μg/kg의 STD를 생쥐의 꼬리에 3일에 1번씩 주사하였으며, 종양의 크기는 측경 양각기(Caliper)를 사용하여 측정하였다.
- , Piscataway, NJ)에 분리된 단백질을 전사한 후, 5% skim milk가 첨가된 PBS-T로 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 측정하고자 하는 단백질에 대한 일차 항체로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음 membrane을 PBS-T로 세 번 세척한 후, 이차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG나 anti-mouse IgG로 2시간 동안 상온에서 반응시키고, 역시 PBS-T로 세 번 세척한 다음 ECL detection kit (Amersham, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 현상하였다. 그리고 anti-β-actin antibody (Sigma, St Louis, MO, USA)를 internal control로 사용하였다.
- 파라핀으로 고정시킨 종양 조직을 얇게 썰어 슬라이드 유리 위에 고정시키고 탈 파라핀 과정을 거친 후, 종양 조직을 헤마톡실린과 에오신을 사용하여 염색하고[19] 일차 항체인 anti-ceramide antibody (1:10)를 상온에서 1시간 반응시킨 다음 이차 항체를 반응시키고 PBS 완충용액으로 세척한 다음 mount 용액을 떨어뜨려 커버 유리로 덮어 ScanScope (Aperio Technologies Inc., Park Center Dr. Vista, CA, USA)를 사용하여 이미지를 얻었다.
대상 데이터
- 3, 3'-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC 6 )는 Molecular Probes (Eugene, OR)사로부터 구입하였으며, anti-cytochrome c 그리고 anti-β-actin antibodies는 Sigma (St Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였고, anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 및 anti-AIF, anti-Smac/DIABLO antibodies는 Cell Signaling사의 제품을 사용하였으며, an- ti-procaspase 3, anti-COX Ⅳ (cytochrome oxidase IV)는 Santa-Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사의 제품을 사용하였고, anti-procaspase 8, anti-procaspase-9 antibodies는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)사의 제품을 사용하였으며, anti-ceramide antibody는 Alexis Biochemicals (San Diego, CA, USA)사의 제품을 사용하였다.
- 3, 3'-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC 6 )는 Molecular Probes (Eugene, OR)사로부터 구입하였으며, anti-cytochrome c 그리고 anti-β-actin antibodies는 Sigma (St Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였고, anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 및 anti-AIF, anti-Smac/DIABLO antibodies는 Cell Signaling사의 제품을 사용하였으며, an- ti-procaspase 3, anti-COX Ⅳ (cytochrome oxidase IV)는 Santa-Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사의 제품을 사용하였고, anti-procaspase 8, anti-procaspase-9 antibodies는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)사의 제품을 사용하였으며, anti-ceramide antibody는 Alexis Biochemicals (San Diego, CA, USA)사의 제품을 사용하였다. Caspase-8 저해제인 Z-Ile-Glu-Thr-Asp-fluoromethyl ketone (Z-IETDFMK), caspase-9 저해제인 Z-Leu-Glu-His-Asp-fluoromethyl ketone (Z-LEHD-FMK), pan-caspase 저해제인 Z-Val-AlaAsp-fluoromethyl ketone (Z-VAD-FMK)와 caspase-3 저해제인 Z-Asp (OCH3)-Glu (OCH3)-Val-Asp (OCH3)-fluoromethyl ketone (Z-DEVD-FMK)는 Sigma (St Louis, MO, USA)사로부터 구입하였으며, Annexin V-FITC apoptosis detection kit는 BD pharmingen (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)사의 제품을 사용하였다. 그 외의 모든 시약은 Sigma (St Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다.
- STC와 STD는 정제된 가루의 형태로 러시아의 Stonik 교수 (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry)로부터 받아서 사용하였다[20]. 3, 3'-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC 6 )는 Molecular Probes (Eugene, OR)사로부터 구입하였으며, anti-cytochrome c 그리고 anti-β-actin antibodies는 Sigma (St Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였고, anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 및 anti-AIF, anti-Smac/DIABLO antibodies는 Cell Signaling사의 제품을 사용하였으며, an- ti-procaspase 3, anti-COX Ⅳ (cytochrome oxidase IV)는 Santa-Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사의 제품을 사용하였고, anti-procaspase 8, anti-procaspase-9 antibodies는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)사의 제품을 사용하였으며, anti-ceramide antibody는 Alexis Biochemicals (San Diego, CA, USA)사의 제품을 사용하였다.
- 백혈병 세포주인 HL-60와 K562 세포는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하였고, 10% 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, GIBCO, Grand Island, NY)과 100 μg/mL의 페니실린과 스트렙토마이신(GIBCO, Grand Island, NY)이 첨가된 RPMI1640 배지(GIBCO, Grand Island, NY)를 사용하여 37℃, 5% CO2, 완전 습윤 상태의 배양기에서 배양하였다.
데이터처리
- 대조군 세포와 여러 가지 농도의 STC 및 STD를 처리한 세포 사이의 생존율에 차이가 있는지를 알아보기 위하여 일원 배치 분산분석 (ANOVA test)과 Student's t-test를 사용하여 분석하였다.
- 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다.
성능/효과
- HL-60 세포를 면역결핍 생쥐의 옆구리 피하에 주사하여 종양을 만든 후 종양이 어느 정도 자랐을 때 STC와 STD를 면역결핍 생쥐의 꼬리에 3일 마다 주사하여 종양의 크기를 관찰하였다. STC 또는 STD를 주사하지 않은 대조군에서는 종양의 크기가 빨리 증가하였으나 STC 또는 STD를 주사한 실험군에서는 종양의 성장이 크게 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 5A). STD의 경우 STC 용량의 3배를 주입하였을 때 종양의 성장이 현저하게 억제 되었고(Fig.
- STC에 의한 세라마이드의 생성은 TNF-α에 의한 세포사멸[3]과 유사하게 산성과 중성 SMase의 활성화에 의해 일어남을 알 수 있었다.
- 이러한 STD에 의한 세라마이드 생성이 STD에 의한 세포 사멸에 중요한지와 STC에서처럼 산성 SMase의 활성과 중성 SMase의 활성에 의한 것인지를 확인하기 위하여 산성 SMase의 저해제인 desipramine과 중성 SMase의 저해제인 GW4869를 각각 STC와 STD를 처리하기 1시간 전에 첨가하여 배양하였다. STC에 의한 세포 사멸이 desipramine과 GW4869에 의해서 부분적으로 억제되는 것을 관찰하였으나, STD에 의한 세포 사멸은 desipramine과 GW4869에 의해서 억제되지 않음을 알 수 있었다 (Fig. 3B, 3C). 이러한 결과를 바탕으로 STC와 STD에 의한 세라마이드의 생성이 산성 및 중성 SMase의 활성화에 의한 것인 지를 관찰하기 위하여, 세라마이드 항체에는 FITC를 붙이고, 산성과 중성 SMase 항체에는 각각 PE를 붙여 면역형광염색법 으로 확인해 보았다.
- 또한, STD에 의한 세라마이드 형성이 STD에 의한 세포사멸에 중요한지와 세라마이드 합성효소의 활성에 의한 것인지를 관찰하기 위하여 세라마이드 합성효소 저해제인 fumonisin B1 (FB1)을 STC와 STD를 처리하기 1시간 전에 첨가하여 배양하였다. STC에 의한 세포사멸은 FB1에 의해서 저해되지 않았고 STD에 의한 세포사멸은 FB1에 의해서 부분적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 4A, 4B). 그리고, STC에 의한 caspase-9, caspase-3와 caspase-8의 활성은 FB1에 의해 억제되지 않았으며, STD에 의한 caspase-9과 caspase-3의 활성은 FB1에 의해 억제되었고, caspase-8의 활성은 부분적으로 억제되었다(Fig.
- 따라서 본 연구에서는 STC와 구조가 유사한 STD를 사용하여 백혈병 세포의 세포사멸 유도 및 이의 분자적 기전을 규명하여 STC와의 작용 및 기전과 비교하여 보다 효과적인 해양 트리테르펜 글리코시드의 구조적특징을 살펴보고자 하였다. STC와 STD를 K562 세포에 처리 하여 세포 사멸을 확인한 결과 시간과 농도 의존적으로 세포 사멸이 일어남을 확인할 수 있었다. 그리고 다른 백혈병 세포 주인 HL-60 세포에서도 STC와 STD에 의해 세포사멸이 유도된다는 것을 알 수 있었다.
- 또한 STD에 의한 항암 효과를 in vivo에서 확인하기 위해면역결핍 생쥐에 HL-60 세포를 이종 이식하여 종양을 만든 후 STC 또는 STD를 주사하여 종양 크기를 측정하였다. STC와 STD를 주사하지 않은 대조군에 비해 STC 또는 STD를 주사한 실험군에서는 종양의 성장이 크게 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 STC 또는 STD를 주사한 실험군의 종양을 떼어 조직을 확인한 결과 세포사멸 및 염증세포의 침윤을 관찰할 수 있었고 세라마이드 역시 증가해 있음을 알 수 있었다(Fig.
- 5A). STD의 경우 STC 용량의 3배를 주입하였을 때 종양의 성장이 현저하게 억제 되었고(Fig. 5A), STC와 동량의 STD를 주입했을 때는 종양의 성장 억제 효과가 나타나지 않았다(data not shown). 이러한 결과는 정도의 차이는 있지만 in vitro에서의 작용과 유사하였다.
- 0 μM STD를각각 2, 4, 6시간 처리하고, Western blot을 이용하여 여러 가지 caspase들의 활성을 관찰하였다. 그 결과 STC와 STD 모두 시간 의존적으로 caspase-8, caspase-9, 및 caspase-3가 활성화되며, caspase-3의 기질인 PARP가 분해됨을 관찰하였다(Fig. 2A). 또한 caspase의 활성이 STD에 의한 세포 사멸에 중요한 역할을 하는지 확인하기 위하여 pan-caspase 저해제인 Z-VAD-FMK와 caspase-3 저해제인 Z-DEVD-FMK, caspase-8 저해제인 Z-IETD-FMK, 및 caspase-9 저해제인 Z-LEHD-FMK 를 각각 50, 50, 25, 및 25 μM 농도로 1시간 처리한 후, 0.
- 또한 STC와 STD에 의해 미토콘드리아 경로가 활성화되는지를 확인하기 위하여 MMP (Δψm)를 측정하고 세포질과 미토콘드리아 분획을 분리하여 단백질 발현을 Western blot을 이용하여 확인하였다. 그 결과 STC와 STD에 의해 MMP가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 더욱이 STC와 비교하여 STD에 의한 MMP의 감소율이 더 높은 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2C). 또한, MMP의 감소로 인해 미토콘드리아에서 세포질로 cytochrome c와 Smac/DIABLO 및 AIF가 방출됨을 관찰하였다 (Fig.
- 이러한 결과를 바탕으로 STC와 STD에 의한 세라마이드의 생성이 산성 및 중성 SMase의 활성화에 의한 것인 지를 관찰하기 위하여, 세라마이드 항체에는 FITC를 붙이고, 산성과 중성 SMase 항체에는 각각 PE를 붙여 면역형광염색법 으로 확인해 보았다. 그 결과, STC에 의한 산성과 중성 SMase의 활성화를 육안으로 관찰할 수 있었고 또한 세라마이드의 생성도 확인할 수 있었다. 반면에 STD에 의해서는 산성과 중성 SMase 활성은 관찰되지 않았으나 STC와 마찬가지로 세라마이드의 생성은 확인할 수 있었다(Fig.
- STC에 의한 세라마이드의 생성은 TNF-α에 의한 세포사멸[3]과 유사하게 산성과 중성 SMase의 활성화에 의해 일어남을 알 수 있었다. 그러나 백혈병 세포주에서 STD에 의한 세포사멸 유도에 있어 세라마이드가 중요한지는 밝혀져 있지 않아 본 연구에서 살펴본 결과 STD에 의한 세포 사멸 유도에는 세라마이드의 생성이 중요하 지만 생성 기전은 STC와는 다르다는 것을 알 수 있었다. 즉, 세라마이드 합성효소 저해제인 FB1을 전처리하여 STD에 의한 세라마이드의 생성과 세포 사멸이 부분적으로 억제된다는 것을 관찰함으로써 STD에 의한 세라마이드 생성은 세라마이드 합성효소의 활성에 의해 일어나며 STD에 의한 세포 사멸에 중요하다는 것을 알 수 있었다.
- 반면에 STD에 의한 산성과 중성 SMase의 활성은 관찰할 수 없었고, FB1에 의한 영향도 없었다. 그리고 세라마이드의 생성은 FB1에 의해 부분적으로 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 4C, 4D). 이러한 결과로부터 STC에 의한 세라마이드의 생성은 산성과 중성 SMase의 활성화에 기인한 것이고 STD에 의한 세라마이드의 생성은 세라마이드 합성 효소의 활성화에 기인한 것임을 확인할 수 있었다.
- 5B). 그리고 이 종양조직에서 면역조직화학염색법을 이용하여 세라마이드를 관찰한 결과 STC 또는 STD를 주사하지 않은 대조군에서는 세라마이드가 약하게 염색된 반면 STC 또는 STD를 주사한 실험군에서는 세라마이드가 증가됨을 확인할 수 있었다(Fig. 5B). 이러한 결과는 in vitro에서의 결과와 유사하였으며 STC와 STD에 의한 세라마이드 생성이 세포 사멸과 종양 억제에 있어 중요하다는 것을 알 수 있었다.
- 4A, 4B). 그리고, STC에 의한 caspase-9, caspase-3와 caspase-8의 활성은 FB1에 의해 억제되지 않았으며, STD에 의한 caspase-9과 caspase-3의 활성은 FB1에 의해 억제되었고, caspase-8의 활성은 부분적으로 억제되었다(Fig. 4B). 이러한 결과를 바탕으로 STC와 STD에 의한 세라마이드의 생성을 관찰하기 위하여, 세라마이드 항체에는 FITC를 붙이고, 산성과 중성 SMase 항체에는 각각 PE를 붙여 면역형광염색법으로 확인해 보았다.
- 이러한 결과는 정도의 차이는 있지만 in vitro에서의 작용과 유사하였다. 따라서 in vivo에서도 STC의 항암작용이 STD보다 강하다는 것을 알 수 있었다. 또한 종양을 떼어 낸 후 얇게 썰어 조직을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 관찰한 결과 종양세포가 있음을 확인할 수 있었으며 STC 또는 STD를 주사한 실험군의 종양인 경우 세포 사멸이 일어난 부분을 관찰하였다(Fig.
- STC와 STD를 주사하지 않은 대조군에 비해 STC 또는 STD를 주사한 실험군에서는 종양의 성장이 크게 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 STC 또는 STD를 주사한 실험군의 종양을 떼어 조직을 확인한 결과 세포사멸 및 염증세포의 침윤을 관찰할 수 있었고 세라마이드 역시 증가해 있음을 알 수 있었다(Fig. 5B). 이러한 in vivo 효과는 in vitro에서의 결과와 유사함을 알 수 있었고, 본 연구에 사용된 STC와 STD는 간독성을 비롯한 약물의 독성이 없는 안전한 약물임을 알 수 있었다(data not shown).
- 그리고 다른 백혈병 세포 주인 HL-60 세포에서도 STC와 STD에 의해 세포사멸이 유도된다는 것을 알 수 있었다. 또한 STC에 의한 세포사멸 유도에 Fas 활성화를 통한 외인성 경로와 미토콘드리아 손상을 통한 내인성 경로가 관련한다는 것을 알 수 있었고, STD 역시 외인성 경로와 미토콘드리아 손상을 통한 내인성 경로가 관련한다는 것을 확인하였다.
- 이러한 결과로부터 STC에 의한 세라마이드의 생성은 산성과 중성 SMase의 활성화에 기인한 것이고 STD에 의한 세라마이드의 생성은 세라마이드 합성 효소의 활성화에 기인한 것임을 확인할 수 있었다. 또한 STC와 STD에 의해 세라마이드가 생성되는 분자적 기전은 다르지만 이들에 의한 세포사멸 유도에는 세라마이드의 생성이 중요하다는 것을 알 수 있었다.
- 이러한 결과들로부터 해삼 독소로부터 추출한 STC와 STD는 세포사멸을 유도하는 정도와 분자적 기전은 다소 차이가 나지만 모두 백혈병의 치료물질로 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 또한 STC와 STD의 분자 내에 있는 aglycone의 구조는 동일하나 여기에 결합하고 있는 당 사슬의 당이 다르므로 인해 이들 작용의 강도와 분자적 기전이 차이가 있다는 것을 알 수 있었다. 본 연구 결과 산성 SMase나 중성 SMase가 결핍된 백혈병 세포에는 STC 보다는 STD가 더 효율적인 항암제로 사용될 수 있을 것이며 세라마이드 합성효소가 결핍된 백혈병 세포에는 STC가 더 효과적인 항암제로 사용될 수 있을 가능성을 제시하였다.
- 또한 caspase의 활성이 STD에 의한 세포 사멸에 중요한 역할을 하는지 확인하기 위하여 pan-caspase 저해제인 Z-VAD-FMK와 caspase-3 저해제인 Z-DEVD-FMK, caspase-8 저해제인 Z-IETD-FMK, 및 caspase-9 저해제인 Z-LEHD-FMK 를 각각 50, 50, 25, 및 25 μM 농도로 1시간 처리한 후, 0.5 μM STC와 1.0 μM STD를 처리하여 6시간 동안 배양하고 세포 사멸 정도를 확인한 결과 Z-VAD-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-IETD-FMK 및 Z-LEHD-FMK를 전 처리한 경우 STC와 STD 에 의한 세포 사멸이 부분적으로 억제됨을 알 수 있었다(Fig. 2B).
- 따라서 in vivo에서도 STC의 항암작용이 STD보다 강하다는 것을 알 수 있었다. 또한 종양을 떼어 낸 후 얇게 썰어 조직을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 관찰한 결과 종양세포가 있음을 확인할 수 있었으며 STC 또는 STD를 주사한 실험군의 종양인 경우 세포 사멸이 일어난 부분을 관찰하였다(Fig. 5B). 그리고 이 종양조직에서 면역조직화학염색법을 이용하여 세라마이드를 관찰한 결과 STC 또는 STD를 주사하지 않은 대조군에서는 세라마이드가 약하게 염색된 반면 STC 또는 STD를 주사한 실험군에서는 세라마이드가 증가됨을 확인할 수 있었다(Fig.
- 2C). 또한, MMP의 감소로 인해 미토콘드리아에서 세포질로 cytochrome c와 Smac/DIABLO 및 AIF가 방출됨을 관찰하였다 (Fig. 2D). 이러한 결과로부터 STC와 STD에 의한 K562 세포의 세포 사멸은 미토콘드리아를 경유하는 내인성 경로와 세포 사멸 수용체의 활성화를 통한 외인성 경로를 통하여 일어남을알 수 있었다.
- 또한 STC와 STD의 분자 내에 있는 aglycone의 구조는 동일하나 여기에 결합하고 있는 당 사슬의 당이 다르므로 인해 이들 작용의 강도와 분자적 기전이 차이가 있다는 것을 알 수 있었다. 본 연구 결과 산성 SMase나 중성 SMase가 결핍된 백혈병 세포에는 STC 보다는 STD가 더 효율적인 항암제로 사용될 수 있을 것이며 세라마이드 합성효소가 결핍된 백혈병 세포에는 STC가 더 효과적인 항암제로 사용될 수 있을 가능성을 제시하였다. 향후 이들 작용의 차이에 대한 더 자세한 분자적 기전을 규명한다면 암세포에 존재하는 효소의 특성에 따라 보다 효과적인 항암제 개발에 필요한 정보를 제공할 수 있을 것이라 생각된다.
- 5B). 이러한 in vivo 효과는 in vitro에서의 결과와 유사함을 알 수 있었고, 본 연구에 사용된 STC와 STD는 간독성을 비롯한 약물의 독성이 없는 안전한 약물임을 알 수 있었다(data not shown). 이러한 결과들로부터 해삼 독소로부터 추출한 STC와 STD는 세포사멸을 유도하는 정도와 분자적 기전은 다소 차이가 나지만 모두 백혈병의 치료물질로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
- 5B). 이러한 결과는 in vitro에서의 결과와 유사하였으며 STC와 STD에 의한 세라마이드 생성이 세포 사멸과 종양 억제에 있어 중요하다는 것을 알 수 있었다.
- 이러한 in vivo 효과는 in vitro에서의 결과와 유사함을 알 수 있었고, 본 연구에 사용된 STC와 STD는 간독성을 비롯한 약물의 독성이 없는 안전한 약물임을 알 수 있었다(data not shown). 이러한 결과들로부터 해삼 독소로부터 추출한 STC와 STD는 세포사멸을 유도하는 정도와 분자적 기전은 다소 차이가 나지만 모두 백혈병의 치료물질로 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 또한 STC와 STD의 분자 내에 있는 aglycone의 구조는 동일하나 여기에 결합하고 있는 당 사슬의 당이 다르므로 인해 이들 작용의 강도와 분자적 기전이 차이가 있다는 것을 알 수 있었다.
- 3D, 3E). 이러한 결과로부터 STC에 의한 세라마이드 형성은 산성 및 중성 SMase의 활성에 의해 일어나는 것이고, STD는 그렇지 않다는 것을 알 수 있었다.
- 4C, 4D). 이러한 결과로부터 STC에 의한 세라마이드의 생성은 산성과 중성 SMase의 활성화에 기인한 것이고 STD에 의한 세라마이드의 생성은 세라마이드 합성 효소의 활성화에 기인한 것임을 확인할 수 있었다. 또한 STC와 STD에 의해 세라마이드가 생성되는 분자적 기전은 다르지만 이들에 의한 세포사멸 유도에는 세라마이드의 생성이 중요하다는 것을 알 수 있었다.
- 2D). 이러한 결과로부터 STC와 STD에 의한 K562 세포의 세포 사멸은 미토콘드리아를 경유하는 내인성 경로와 세포 사멸 수용체의 활성화를 통한 외인성 경로를 통하여 일어남을알 수 있었다.
- 2B). 이러한 결과로부터 STC와 STD에 의한 세포 사멸이 부분 적으로는 caspase 의존적으로 일어남을 알 수 있었다. 또한 STC와 STD에 의해 미토콘드리아 경로가 활성화되는지를 확인하기 위하여 MMP (Δψm)를 측정하고 세포질과 미토콘드리아 분획을 분리하여 단백질 발현을 Western blot을 이용하여 확인하였다.
- 그러나 백혈병 세포주에서 STD에 의한 세포사멸 유도에 있어 세라마이드가 중요한지는 밝혀져 있지 않아 본 연구에서 살펴본 결과 STD에 의한 세포 사멸 유도에는 세라마이드의 생성이 중요하 지만 생성 기전은 STC와는 다르다는 것을 알 수 있었다. 즉, 세라마이드 합성효소 저해제인 FB1을 전처리하여 STD에 의한 세라마이드의 생성과 세포 사멸이 부분적으로 억제된다는 것을 관찰함으로써 STD에 의한 세라마이드 생성은 세라마이드 합성효소의 활성에 의해 일어나며 STD에 의한 세포 사멸에 중요하다는 것을 알 수 있었다. 그러나 STD에 의해 세라마이드 합성효소가 활성화되는 기전은 아직 알 수 없었고 향후 이에 대한 연구가 필요하다고 생각된다.
- 해양 트리테르펜 글리코시드(marine triterpene glycosides)는 해삼 (Holothurians)이나 일부 해면류(sponges)에서 분리한 천연물질로서 항 진균 작용, 세포독성, 용혈작용과 세포증식을 억제하는 효과 등 여러 가지 생물학적 활성들을 가지고 있는 것으로 알려져 있다[21,22]. 특히, 이전의 연구 결과 Thelenota anax에서 추출한 stichoposide C (STC) (quinovose 를 함유하는 hexaoside, Fig. 1A)는 HL-60 및 K562 세포와 같은 백혈병 세포에서 산성 스핑고마이엘리나제(acid sphingomyelinase; acid SMase)와 중성 스핑고마이엘리나아제(neutral sphingomyelinase; neutral SMase)를 활성화시켜 세라마이드(ceramide)를 생성하고 이러한 세라마이드가 STC에 의한 세포사멸 유도와 항암 작용에 중요하다는 것을 알 수 있었다. 또한 STC에 의한 산성 SMase 활성화는 세포사멸 수용체인 Fas 활성에 의해 caspase-8이 활성화되어 나타났으며 중성 SMase 활성화는 glutathione 고갈에 의해 활성화된다는 것을 알 수 있었다[25].
후속연구
- 즉, 세라마이드 합성효소 저해제인 FB1을 전처리하여 STD에 의한 세라마이드의 생성과 세포 사멸이 부분적으로 억제된다는 것을 관찰함으로써 STD에 의한 세라마이드 생성은 세라마이드 합성효소의 활성에 의해 일어나며 STD에 의한 세포 사멸에 중요하다는 것을 알 수 있었다. 그러나 STD에 의해 세라마이드 합성효소가 활성화되는 기전은 아직 알 수 없었고 향후 이에 대한 연구가 필요하다고 생각된다.
- 본 연구 결과 산성 SMase나 중성 SMase가 결핍된 백혈병 세포에는 STC 보다는 STD가 더 효율적인 항암제로 사용될 수 있을 것이며 세라마이드 합성효소가 결핍된 백혈병 세포에는 STC가 더 효과적인 항암제로 사용될 수 있을 가능성을 제시하였다. 향후 이들 작용의 차이에 대한 더 자세한 분자적 기전을 규명한다면 암세포에 존재하는 효소의 특성에 따라 보다 효과적인 항암제 개발에 필요한 정보를 제공할 수 있을 것이라 생각된다.
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