Purpose: The purpose of this study was to evaluate the expression of osteogenic genes associated with bone regeneration on anodizing titanium surface. Methods: $20{\times}20{\times}1$ (mm) commercially pure titanium plate was made, one group was pure titanium, second group was punched, an...
Purpose: The purpose of this study was to evaluate the expression of osteogenic genes associated with bone regeneration on anodizing titanium surface. Methods: $20{\times}20{\times}1$ (mm) commercially pure titanium plate was made, one group was pure titanium, second group was punched, and last group was punched and anodized by electrochemical method. Through the osteogenic cell culture model, the expression of extracellular matrix proteins, such as bone morphogenetic protein-2, bone sialoprotein, aggrecan, osteocalcin, Alkaline phosphatase, collagen I had been evaluated by Real-time polymerase chain reaction, and the morphology of growing cells was evaluated by scanning electron microscopy. Results: The attachment of mesenchymal stem cell was even and well-oriented on all Ti surfaces. The osteogene expression was increased on punching groups but, decreased on anodizing surfaces in 3 week samples. Conclusion: Punched anodizing Ti has possibility be using as a dental implant material, but further in vivo study would be needed.
Purpose: The purpose of this study was to evaluate the expression of osteogenic genes associated with bone regeneration on anodizing titanium surface. Methods: $20{\times}20{\times}1$ (mm) commercially pure titanium plate was made, one group was pure titanium, second group was punched, and last group was punched and anodized by electrochemical method. Through the osteogenic cell culture model, the expression of extracellular matrix proteins, such as bone morphogenetic protein-2, bone sialoprotein, aggrecan, osteocalcin, Alkaline phosphatase, collagen I had been evaluated by Real-time polymerase chain reaction, and the morphology of growing cells was evaluated by scanning electron microscopy. Results: The attachment of mesenchymal stem cell was even and well-oriented on all Ti surfaces. The osteogene expression was increased on punching groups but, decreased on anodizing surfaces in 3 week samples. Conclusion: Punched anodizing Ti has possibility be using as a dental implant material, but further in vivo study would be needed.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구에서는 임플란트와 골조직 사이에 완충재(buffer)를 삽입하는 방법인 완충 고정술을 적용한 치과 임프란트의 개발을 위한 기본 연구를 시행하였다. 완충 고정형 임프란트의 재료로 사용하기 위하여 순수 타이타늄의 양극산화 처리를 시행하고 표면에서 간엽 줄기세포를 배양하고 이를 골모세포로 분화시키면서 주사 전자현미경을 통하여 세포의 부착 양상을 관찰하고 골 형성 유전자의 발현을 분석하였는데 양극 산화막은 타이타늄 표면에 나노 사이즈의 pore를 갖는 구조의 피막을 형성하는 대표적인 방법인데 일반적으로 자연적인 순수 타이타늄에서는 산화 타이타늄 피막이 2∼5 nm 두께로 생성이 된다.
이러한 성체 줄기 세포는 치수, 치근막 등에 널리 분포하고 있으며 그 중 치수 줄기세포는 상아질과 치수 등을 구성하는 조직의 재생을 유도하여 odontoblast, 혈관 및 치수의 섬유조직과 유사한 상태로의 조직재생이 보고되고 있다[14,15]. 위의 연구 결과를 토대로 치수 줄기세포 등은 골수 줄기세포, 지방 줄기세포나 골막 줄기세포와 유사하게 골 형성 유도 배양액에 투여하여 배양하면 골모세포로 분화가 유도되고 이에 따라 골조직의 재생에 이용이 가능하리라 생각하여 본 연구에 적용해 보았다.
이에 본 연구에서는 완충 고정형 치과 임플란트의 제조에 이용할 예정인 기공을 가진 양극산화(anodizing) 처리된 타이타늄 표면에서의 간엽 줄기세포의 배양, 골모세포로의 분화 과정에서의 세포의 부착 및 성장을 주사전자 현미경을 통하여 분석하고 이에 따른 골 형성 유전자의 발현을 연구하여 성공적인 치과 임플란트의 개발에 기본이 되는 연구를 시행하고자 하였다.
제안 방법
1×103개의 치수 줄기세포를 타이타늄 plate에 loading하고 10% FBS, penicillin/streptomycin을 포함한 DMEM과 0.1 M dexamethasone, 0.05 mM ascorbic acid-2-phosphate 및 10 mM ß-glycerophosphate 등의 골 형성 유도 양액에 투여하여 3주 동안 배양하면서 각 1주, 2주, 3주에 Tri-reagent (Sigma)를 이용하여 Chomczynski와 Sacchi[3]의 single-step method에 따라 total RNA를 추출하고 UV spectrophotometry (Phamacia, Gene Quant, LKB Biochrom, England)를 사용하여 농도를 측정하고 RNA를 추출하여 bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), bone sialo protein (BSP), Aggrecan (AG), osteocalcin, Alkaline phosphatase (ALP), collagen I 등의 골 형성 단백질 Real time PCR을 이용하여 측정하였다.
4개의 표본 중 나머지 1개의 sample로는 SEM을 통해 관찰하여 표면에서의 세포의 부착 등을 분석하였는데 타이타늄 plate를 PBS로 세척하고 4% paraformaldehyde에 고정하여 증류수로 세척한 후 0.1 M sodium cacodylate의 1% osmium tetroxide에 30분 처리한 뒤 hexamethydisilazane으로 24시간 동안 critical point drying을 시행하고 90초간 gold, palladium sputter coating을 시행하였다. 이후 15 kvp에서 SEM (S-2250N, Hitachi, Japan)을 이용하여 이를 촬영하고 분석하였다.
Runx2 등의 전사조절인자들이 관심을 끌고 있지만 runx2 단독으로 조절작용을 하는지 다른 전사 조절인자와 복합적으로 조절하는지는 명확히 밝혀지지 않은 상태이다[16]. 본 연구에서는 성체 간엽줄기세포가 골모세포로 분화되는 것을 BMP-2, BSP, AG, osteocalcin, ALP, collagen I 등의 골형성 단백질의 Real time PCR을 이용하여 평가하였다. 1주에서는 양극산화 처리를 시행한 C군에서 runx2가 현격하게 증가되었고, 2주 소견에서는 pore 유무나 양극산화 유무에 큰 영향을 받지 않는 결과를 보이고 있었지만 3주 소견에서는 pore군에서는 runx2 증가가 뚜렷하였으나 양극산화 처리를 시행한 C군에서는 runx2가 전체적으로 감소하는 결과를 얻었다.
본 연구에서는 순수 타이타늄 plate나 구멍 낸 plate, 양극산화처리를 시행한 punched plate 등 3가지 표본을 이용하여 3주간 치수 줄기세포를 배양하고 골모세포로의 분화를 유도하면서 관찰하였다. 주사 전자 현미경 소견에서는 세 군 모두에서 1주부터 3주까지 기간이 경과하면서 세포의 부착이 균일하고 그 수가 증가되어 가는 양상으로 양호한 세포 부착을 보이고 있었다.
순수 타이타늄 plate (A군)와 구멍 가공이 된 타이타늄 plate (B군), 구멍 가공 후 양극산화 처리를 한 타이타늄 plate (C군), 이렇게 3가지 군에 대해 1주, 2주, 3주간의 연구를 시행하였다. 제작된 plate의 크기는 20×20×1 (mm)이며 각 군에 한 주당 표본을 4개씩 제작하여 총 36개의 표본을 제작하였다.
제작된 plate의 크기는 20×20×1 (mm)이며 각 군에 한 주당 표본을 4개씩 제작하여 총 36개의 표본을 제작하였다. 양극산화처리를 위하여 acetone에 담근 후 3분간 초음파 세척하여 유기물을 제거하고, 불산 수용액에 1분간 담가 두어 자연 산화된 피막과 불순물을 제거하였고, electrolyte solution으로는 1 M 농도의 황산 용액을 사용하였고 DC power supply를 이용하여 120V의 전압을 5분간 걸어주어 양극산화 처리를 시행하였다.
1 M sodium cacodylate의 1% osmium tetroxide에 30분 처리한 뒤 hexamethydisilazane으로 24시간 동안 critical point drying을 시행하고 90초간 gold, palladium sputter coating을 시행하였다. 이후 15 kvp에서 SEM (S-2250N, Hitachi, Japan)을 이용하여 이를 촬영하고 분석하였다.
채취된 치수조직을 collagenase를 이용하여 digestion을 시행하고 분리된 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)을 포함한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)으로 culture flask에서 세포배양을 시행하고 배양세포가 거의 confluent해지면 0.05% Trypsin/0.25 mM EDTA를 이용하여 계대배양을 시행하였다.
제작된 plate의 크기는 20×20×1(mm)이며 각 군에 한 주당 표본을 4개씩 제작하여 총 36개의 표본을 제작하였다. 한 주의 실험이 끝나고 각 군에서 나오는 4개의 표본에서 3개는 SYBR real time PCR 방법을 통한 RNA 분석을 시행하였다. 이때 사용한 primer의 design은 Table 1과 같다.
15세 남자 환자의 하악 제3 대구치 발치 시 얻어지는 치수조직을 이용하여 줄기세포를 추출하였다. 환자의 동의 아래 하악 매복지치 발거 시 절단된 지치의 치수조직을 치주 큐렛을 이용하여 치수 줄기세포를 채취하였다. 채취된 치수조직을 collagenase를 이용하여 digestion을 시행하고 분리된 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)을 포함한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)으로 culture flask에서 세포배양을 시행하고 배양세포가 거의 confluent해지면 0.
대상 데이터
15세 남자 환자의 하악 제3 대구치 발치 시 얻어지는 치수조직을 이용하여 줄기세포를 추출하였다. 환자의 동의 아래 하악 매복지치 발거 시 절단된 지치의 치수조직을 치주 큐렛을 이용하여 치수 줄기세포를 채취하였다.
제작된 plate의 크기는 20×20×1 (mm)이며 각 군에 한 주당 표본을 4개씩 제작하여 총 36개의 표본을 제작하였다.
제작된 plate의 크기는 20×20×1(mm)이며 각 군에 한 주당 표본을 4개씩 제작하여 총 36개의 표본을 제작하였다.
성능/효과
본 연구에서는 성체 간엽줄기세포가 골모세포로 분화되는 것을 BMP-2, BSP, AG, osteocalcin, ALP, collagen I 등의 골형성 단백질의 Real time PCR을 이용하여 평가하였다. 1주에서는 양극산화 처리를 시행한 C군에서 runx2가 현격하게 증가되었고, 2주 소견에서는 pore 유무나 양극산화 유무에 큰 영향을 받지 않는 결과를 보이고 있었지만 3주 소견에서는 pore군에서는 runx2 증가가 뚜렷하였으나 양극산화 처리를 시행한 C군에서는 runx2가 전체적으로 감소하는 결과를 얻었다. 이것은 표본이 3개씩으로 전체 n수가 다소 부족한 본 연구의 한계점으로 향후 더 많은 연구를 통하여 이를 판단해야 할 것으로 생각한다.
BMP-2, BSP, AG, osteocalcin, ALP, collagen I 등의 골형성 단백질의 발현을 Real time PCR을 이용하여 분석한 결과 1주에서는 양극산화 처리를 시행하였을 때, 골 형성 유전자의 발현이 현격하게 증가되었다. 2주 소견에서는 pore 유무나 양극산화 유무에 큰 영향을 받지 않는 결과를 보이고 있었다.
치과 임플란트에 사용할 수 있는 나노 pore 양극산화 타이타늄에서 세포를 이용한 in vitro 연구를 시행하여 대부분의 경우에서 양호한 세포의 부착은 관찰되었다. 골 형성 유전자의 발현은 전반적으로는 양호하였으나, 다만 양극산화 처리를 시행한 군의 3주 소견에서 감소하는 결과를 보이고 있었다. 추후 골 형성 유전자의 발현에 대한 반복적인 추가 연구가 필요하고 in vivo 실험 등 더 많은 연구를 통해 개선되어야 할 점이 많이 있다고 생각된다.
후속연구
1주에서는 양극산화 처리를 시행한 C군에서 runx2가 현격하게 증가되었고, 2주 소견에서는 pore 유무나 양극산화 유무에 큰 영향을 받지 않는 결과를 보이고 있었지만 3주 소견에서는 pore군에서는 runx2 증가가 뚜렷하였으나 양극산화 처리를 시행한 C군에서는 runx2가 전체적으로 감소하는 결과를 얻었다. 이것은 표본이 3개씩으로 전체 n수가 다소 부족한 본 연구의 한계점으로 향후 더 많은 연구를 통하여 이를 판단해야 할 것으로 생각한다.
골 형성 유전자의 발현은 전반적으로는 양호하였으나, 다만 양극산화 처리를 시행한 군의 3주 소견에서 감소하는 결과를 보이고 있었다. 추후 골 형성 유전자의 발현에 대한 반복적인 추가 연구가 필요하고 in vivo 실험 등 더 많은 연구를 통해 개선되어야 할 점이 많이 있다고 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
골 유착성 치과용 임플란트의 기능은 무엇입니까?
골 유착성 치과용 임플란트는 상실된 치아를 대체 하는 구조물을 악골에 식립하여 치아의 역할을 하는 기능을 한다. 치과용 임플란트는 1983년 Brånemark[4]에 의해서 골 유착 개념이 도입되고 발전하여 현재 치아 손상 시 우선 고려되는 치료 방법으로 널리 각광받고 있다.
현재 사용되는 임플란트가 제한적인 수명을 가지고 있는 가장 큰 이유는 무엇입니까?
현재 사용되고 있는 임플란트가 제한적인 수명을 가지고 있는 가장 큰 이유는 주위 골 조직과 임플란트 사이의 계면의 결합이 지속되지 못하는 데 있다. 기존 연구에 따르면 골 조직과 임플란트의 계면 사이에 응력 집중과 차단에 의한 골 용해, 미세입자나 세균의 침투 및 계면에서의 미세 상대 움직임 등으로 인해 계면에서 골 유착(osseointegration)이 제대로 이루어지지 않는다고 알려져 있다[1,2].
참고문헌 (16)
Berglundh T, Lindhe J, Jonsson K, Ericsson I. The topography of the vascular systems in the periodontal and peri-implant tissues in the dog. J Clin Periodontol 1994;21: 189-93.
Zarb GA, Schmitt A. The longitudinal clinical effectiveness of osseointegrated dental implants in anterior partially edentulous patients. Int J Prosthodont 1993;6:180-8.
Henry PJ, Laney WR, Jemt T, et al. Osseointegrated implants for single-tooth replacement: a prospective 5-year multicenter study. Int J Oral Maxillofac Implants 1996;11: 450-5.
Kemppainen P, Eskola S, Ylipaavalniemi P. A comparative prospective clinical study of two single-tooth implants: a preliminary report of 102 implants. J Prosthet Dent 1997; 77:382-7.
Buser D, Schenk RK, Steinemann S, Fiorellini JP, Fox CH, Stich H. Influence of surface characteristics on bone integration of titanium implants. A histomorphometric study in miniature pigs. J Biomed Mater Res 1991;25:889-902.
Kido H, Schulz EE, Kumar A, Lozada J, Saha S. Implant diameter and bone density: effect on initial stability and pull-out resistance. J Oral Implantol 1997;23:163-9.
Blatz MB, Strub JR, Glaser R, Gebhardt W. Use of wide-diameter and standard-diameter implants to replace single molars: two case presentations. Int J Prosthodont 1998;11:356-63.
Zhu X, Chen J, Scheideler L, Reichl R, Geis-Gerstorfer J. Effects of topography and composition of titanium surface oxides on osteoblast responses. Biomaterials 2004;25:4087-103.
Boyne PJ. Application of bone morphogenetic proteins in the treatment of clinical oral and maxillofacial osseous defects. J Bone Joint Surg Am 2001;83-A Suppl 1:S146-50.
Khan SN, Lane JM. The use of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) in orthopaedic applications. Expert Opin Biol Ther 2004;4:741-8.
Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan AI, Bruder SP. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem 1997;64:295-312.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.