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문제 정의
- 이러한 긴 펩타이드의 경우는 화학적 합성이 어려우므로, 생물학적 방법을 통하여 생산이 가능하다. 이 논문에서는 이러한 펩타이드 유전자 전달체에 대하여 기술하고, 더불어 유전자 클로닝 기법을 이용하여 이들을 생산하는 방법을 실례를 들어 설명하고자 한다.
제안 방법
- 고정된 양의 siRNA에 무게비를 달리하여 HMGB-1A를 추가하였다. 20분간 상온에서 방치하여 복합체 형성을 유도한 후, agarose gel에서 전기영동을 통하여 분석하였다.
- TAT-HMGB-1A는 유전자를 좀더 효율적으로 세포 안으로 전달할 수 있어서, 유전자 전달의 효율을 개선할 수 있다.25 이렇듯 유전자 재조합 기술을 통하여 다양한 기능성 펩타이드를 HMGB-1A에 연결할 수 있는데, 본 연구실에서는 artery wall binding peptide(AWBP) 또는 VEGF receptor binding peptide(VRBP)가 연결된 HMGB-1A를 제조하였다.4,6 AWBP-HMGB-1A는 혈관내피세포에 높은 효율로 유전자를 전달하였으며, VRBP-HMGB-1A는 허혈성 혈관내피세포에 정상 혈관내피세포로 보다 높은 효율로 유전자를 전달하였다.
- 그림 6. Cytotoxicity assay: HMGB1 A와 TAT-HMGB-1A의 독성을 측정하기 위해서 MTT assay를 수행하였다. 그 결과 HMGB -1A와 TAT-HMGB-1A는 Raw264.
- Forward primer: 5’-CCGGAATTCATGGGCAAAG GAGATCCTAAG-3’, backward primer: 5’-CCCAAGCTTTTTTGTCTCCCCTTTGGG-3’. Forward primer는 앞서 사용된 forward primer와 동일하며, 유전자 클로닝의 편의성을 위하여 EcoRI과 HinDIII 자리(밑줄)를 각각의 primer에 도입하였다. PCR결과 얻어진 DNA 조각은 단백질 발현벡터인 pET21a에 삽입되었다(그림 2).
- 그러나 HMGB-1A의 경우 일부 다른 단백질이 같이 정제되므로, 두번째 chromatography 를 실시하였다. HMGB-1A의 양이온성에 근거하여, CM sepharose cationic exchange chromatography를 실시하였다. NaCl gradient를 이용하여 resin에 결합된 단백질을 분리하였으며 HMGB-1A는 450 mM NaCl 용액으로 용출되었다.
- HMGB-1A의 정제를 위하여, 본 연구실에서는 3단계의 chromatography를 실시하였다(그림 3). 각각 affinity chromatography, cationic exchange chromatography, polymixin B chromatography이다.
- A box 와 B box, 그리고 음전하를 가지고 있는 acidic c-말단부분이다. HMGB2를 유전자 전달체로서 이용하기 위하여 유전자 클로닝 기법을 통해 HMGB-2의 A box, B box(1번~186번 아미노산) 부분을 발현하여 정제하였다.26 이 HMGB-2186은 DNA에 결합하여 안정된 복합체를 형성할 수 있으며, 이 복합체는 세포표면과의 높은 정전기적 친화성을 가지고 있어, 유전자 전달체로서의 기본 능력을 충족하였다.
- 유전자 클로닝의 편의성을 위하여, EcoRI과 HinDIII 자리(밑줄)를 각각의 primer에 도입하였다. RT-PCR 결과 얻어진 약 500 bp의 cDNA 조각을 pET21a 벡터의 EcoRI과 HinDIII 자리에 삽입한 후, pET21a-HMGB1AB를 제조하였다. pET21a-HMGB1AB는 DNA sequencing을 실시하여 얻어진 cDNA를 염기서열을 확인하였다.
- 따라서, 펩타이드의 최적화된 발현 조건을 찾기 위하여 위의 조건들을 스크리닝 하여야 한다. pET21a- HMGB1A의 최적화된 발현을 위하여, 박테리아는 0.6-0.8 optical density(260 nm)까지 배양하였으며, 이후 500 mM의 농도로 IPTG를 첨가하였다. 이후, 37 ℃에서 6시간 동안 배양하여 펩타이드의 과발현을 유도하였다.
- RT-PCR 결과 얻어진 약 500 bp의 cDNA 조각을 pET21a 벡터의 EcoRI과 HinDIII 자리에 삽입한 후, pET21a-HMGB1AB를 제조하였다. pET21a-HMGB1AB는 DNA sequencing을 실시하여 얻어진 cDNA를 염기서열을 확인하였다. 이 HMGB1AB cDNA는 A box와 B box를 모두 포함한 것으로서, 유전자 전달효과가 PLL보다 우수하였다.
- Gel retardation assay는 DNA의 음전하가 결합된 양이온성 분자에 의해 가려지므로, DNA의 이동성이 gel electrophoresis에서 감소하게 된다. 결국 gel의 출발점에서 DNA가 전혀 이동하지 않게 되는데, 이러한 특성을 이용하여 DNA와 펩타이드의 결합능력을 평가한다(그림 5). Heparin competition assay는 DNA와 펩타이드의 복합체에 음전하를 갖고 있는 heparin을 가하여 실시하는데, heparin의 가해진 양이 증가함에 따라 점차 DNA를 대신하여 펩타이드에 결합하게 된다.
- Gel retardation assay: siRNA/HMGB-1A 복합체는 ethidium bromide가 들어있는 3% agarose gel에서 분석되었다. 고정된 양의 siRNA에 무게비를 달리하여 HMGB-1A를 추가하였다. 20분간 상온에서 방치하여 복합체 형성을 유도한 후, agarose gel에서 전기영동을 통하여 분석하였다.
- 많은 경우, affinity chromatography 만으로 높은 순도의 단백질을 얻을 수 있다. 그러나 HMGB-1A의 경우 일부 다른 단백질이 같이 정제되므로, 두번째 chromatography 를 실시하였다. HMGB-1A의 양이온성에 근거하여, CM sepharose cationic exchange chromatography를 실시하였다.
- 앞서 설명한 바와 같이 B box는 염증을 유발할 수 있는 도메인으로서 유전자 전달체로서의 안전성에 문제가 있다. 따라서, 본 연구실에서는 A box만을 얻기 위하여, PCR을 실시하였다. 이 때 사용된 primer는 다음과 같은 염기서열을 가지고 있다.
- 목적 cDNA의 확보는 cDNA 라이브러리 스크리닝 등을 통하여 할 수 있으나, 이미 염기서열 정보를 알고 있는 cDNA는 reverse transcriptionpolymerase chain reaction(RT-PCR)을 통하여 간단히 확보할 수 있다. 본 연구실에서는 HMGB-1AB cDNA를 확보하기 위하여 mRNA에 해당하는 특정 primer를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR은 human embryonic kidney 293(HEK293) 세포에서 얻어진 total RNA를 template로 이용하여 수행되었다.
- 본 연구실에서는 추가적으로 PTD인 TAT를 HMGB-1A에 연결하여, DNA 재조합법으로 TAT-HMGB-1A를 생산하였다. TAT-HMGB-1A는 유전자를 좀더 효율적으로 세포 안으로 전달할 수 있어서, 유전자 전달의 효율을 개선할 수 있다.
- Forward primer: 5’-CCGGAATTCATGGGCAAAGGAGATCCTAAG-3’, backward primer: 5’-CCCAAGCTTGATGTAGGTTTTCATTTCTCTTTC-3’. 유전자 클로닝의 편의성을 위하여, EcoRI과 HinDIII 자리(밑줄)를 각각의 primer에 도입하였다. RT-PCR 결과 얻어진 약 500 bp의 cDNA 조각을 pET21a 벡터의 EcoRI과 HinDIII 자리에 삽입한 후, pET21a-HMGB1AB를 제조하였다.
- 그러므로 HMGB-1A의 생산에서 endotoxin의 제거는 매우 중요하다고 할 수 있다. 이를 위하여 polymixin B chromatography를 실시하여 endotoxin을 제거하였다. 최종적으로 polymixin B column에서 순수한 물로 펩타이드를 용출하였다.
- 정제된 펩타이드는 SDS-PAGE를 실시하여 단백질의 순도 및 정제 정도를 확인한다(그림 4). 이후 펩타이드의 유전자 전달 능력 검증은 일반 양이온성 고분자와 동일한 방법으로 실시한다.
이론/모형
- 이후 펩타이드의 유전자 전달 능력 검증은 일반 양이온성 고분자와 동일한 방법으로 실시한다. DNA와 HMGB-1A의 결합능력은 gel retardation assay, heparin competition assay 등을 이용하여 평가한다. Gel retardation assay는 DNA의 음전하가 결합된 양이온성 분자에 의해 가려지므로, DNA의 이동성이 gel electrophoresis에서 감소하게 된다.
성능/효과
- 13 또한, 세포 밖으로 HMGB-1이 분비되었을 경우에는, proinflammatory cytokine으로 작용하여 염증반응을 유발시키는 것으로 알려졌다.14 HMGB-1은 패혈증, 류마티스 등의 염증성 질병에서 염증을 유발하는 주된 인자로 확인되었으며, 뇌졸중, 심근허혈 등의 허혈성 질병에서도 염증 반응을 유발하는 인자로 알려졌다.15-18 특히, 허혈성 질병에서는 괴사된 세포로부터 유출된 HMGB-1이 Toll-like receptor(TLR) 및 receptor for advanced glycation end product(RAGE)에 결합하여, 염증 반응을 유도한다.
- 25 이렇듯 유전자 재조합 기술을 통하여 다양한 기능성 펩타이드를 HMGB-1A에 연결할 수 있는데, 본 연구실에서는 artery wall binding peptide(AWBP) 또는 VEGF receptor binding peptide(VRBP)가 연결된 HMGB-1A를 제조하였다.4,6 AWBP-HMGB-1A는 혈관내피세포에 높은 효율로 유전자를 전달하였으며, VRBP-HMGB-1A는 허혈성 혈관내피세포에 정상 혈관내피세포로 보다 높은 효율로 유전자를 전달하였다. 이렇듯 유전자 재조합 방법을 이용하여 이러한 특정 리간드를 붙여서 클로닝을 함으로써, 복잡한 서열의 펩타이드도 효율적으로 생산할 수 있다.
- HMGB-2186은 기본적으로 lipofectamine보다 우수한 유전자 전달효율을 보여준다. HMGB-1과 마찬가지로, PTD인 TAT를 유전자 재조합을 통하여 HMGB-2에 접합하였을 때, 세포 내로의 이입효과가 증가하여 유전자 전달 효율을 개선할 수 있었다. HMGB-2도 HMGB-1과 유사하게 A box와 B box에 NLS 부분을 포함하고 있다.
- Cytotoxicity assay: HMGB1 A와 TAT-HMGB-1A의 독성을 측정하기 위해서 MTT assay를 수행하였다. 그 결과 HMGB -1A와 TAT-HMGB-1A는 Raw264.7 cell에서 독성을 보이지 않았으나 PLL은 높은 독성을 보였다.
- 셋째, DNA 재조합기술을 이용하여 타겟 단백질에 융합 단백질 또는 기능성 펩타이드를 접합하여 효율이 개선된 유전자 전달체를 만들어 낼 수 있다. 넷째, 핵으로부터 유래한 핵 단백질들은 자체적으로 NLS를 가지고 있다. 따라서, 세포핵 내 전달 효율을 높임으로서 유전자 발현을 증가시킬 수 있다.
- 11 이러한 양이온성에 기인하여 전달될 핵산과 안정된 복합체를 형성할 수 있다. 둘째, 세포 유래 단백질로서, 합성 고분자에 비해 독성이 적을 뿐만 아니라 면역반응을 유발하지 않는다. 셋째, DNA 재조합기술을 이용하여 타겟 단백질에 융합 단백질 또는 기능성 펩타이드를 접합하여 효율이 개선된 유전자 전달체를 만들어 낼 수 있다.
- 첫째, 펩타이드 전달체의 경우 핵산과 전기적 인력을 통하여 복합체를 형성하고, 핵산을 응축하여 작은 크기의 입자를 만들어 낼 수 있다. 둘째, 펩타이드 전달체에 수용체 특이적 리간드를 접합하면, 수용체에 특이적으로 결합하여 수용체 특이적 엔도사이토시스를 통해 효율적으로 유전자를 세포 내로 전달할 수 있다.4-6 셋째, protein transduction domain(PTD)로부터 유래한 펩타이드 서열은 핵산-전달체 복합체가 엔도좀에서 라이소좀으로 가는 경로를 통해 복합체가 분해되는 것으로부터 벗어날 수 있도록 하여 유전자 전달 효율을 높인다.
- 본 연구실에서는 HMGB-1A를 유전자 재조합 방법을 이용하여 생산하였으며, 이를 이용하여 대식세포에서 TNF-α의 분비를 억제할 수 있음을 확인하였다.
- 둘째, 세포 유래 단백질로서, 합성 고분자에 비해 독성이 적을 뿐만 아니라 면역반응을 유발하지 않는다. 셋째, DNA 재조합기술을 이용하여 타겟 단백질에 융합 단백질 또는 기능성 펩타이드를 접합하여 효율이 개선된 유전자 전달체를 만들어 낼 수 있다. 넷째, 핵으로부터 유래한 핵 단백질들은 자체적으로 NLS를 가지고 있다.
- pET21a-HMGB1AB는 DNA sequencing을 실시하여 얻어진 cDNA를 염기서열을 확인하였다. 이 HMGB1AB cDNA는 A box와 B box를 모두 포함한 것으로서, 유전자 전달효과가 PLL보다 우수하였다. 앞서 설명한 바와 같이 B box는 염증을 유발할 수 있는 도메인으로서 유전자 전달체로서의 안전성에 문제가 있다.
- 따라서 HMGB-1을 유전자 전달체로 이용하기 위해서는 c-말단 부분을 제거할 필요가 있다. 이렇게 c-말단을 제거하여 만들어진 HMGB-1 box A and B(HMGB-1AB)는 플라스미드 DNA와 안정한 복합체를 형성할 수 있었으며, poly-L-lysine과 유사한 유전자 전달 효율을 보였다.20
- 양이온성 펩타이드를 유전자 전달체로서 사용할 경우 다음과 같은 장점을 가지고 있다. 첫째, 펩타이드 전달체의 경우 핵산과 전기적 인력을 통하여 복합체를 형성하고, 핵산을 응축하여 작은 크기의 입자를 만들어 낼 수 있다. 둘째, 펩타이드 전달체에 수용체 특이적 리간드를 접합하면, 수용체에 특이적으로 결합하여 수용체 특이적 엔도사이토시스를 통해 효율적으로 유전자를 세포 내로 전달할 수 있다.
- 따라서 소량의 endotoxin도 항염증 효과를 교란하여 문제를 일으킬 수 있기 때문에 endotoxin의 제거는 매우 중요하다. 특히, 이 연구에서 개발된 HMGB-1A는 직접 뇌졸증 동물 모델에서 항염증 효과를 통하여 뇌경색의 완화에도 이용되었다. 그러므로 HMGB-1A의 생산에서 endotoxin의 제거는 매우 중요하다고 할 수 있다.
후속연구
- 이와 같이 유전자 클로닝 기법은 다양하고 복잡한 기능의 유전자 전달용 펩타이드의 생산을 가능하게 한다. 따라서, 유전자 클로닝 기법은 앞으로의 지속적 연구를 통하여 보다 기능이 개선된 유전자 전달용 펩타이드의 개발에 기여할 것으로 기대된다.
- 유전자 클로닝 기법은 이러한 단백질의 대량생산을 가능하게 한다. 이렇듯 유전자 클로닝 기법에 의해 생산된 세포유래의 유전자 전달용 펩타이드 들은 그 자체로 DNA와 결합하여 유전자를 전달하는데 이용될 수 있을 뿐만 아니라, NLS 등을 포함하고 있는 특성 때문에 다른 고분자 및 리포좀과 연계하여 이들의 유전자 전달 효율을 개선하는 데에도 이용될 수 있다.30
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