The scanning electron microscopy is an ideal technique for examining plant surface at high resolution. Most hydrate samples, however, must be fix and dehydrate for observation in the scanning electron microscope. Because the microscopes operate under high vacuum, most specimens, especially biologica...
The scanning electron microscopy is an ideal technique for examining plant surface at high resolution. Most hydrate samples, however, must be fix and dehydrate for observation in the scanning electron microscope. Because the microscopes operate under high vacuum, most specimens, especially biological samples, cannot withstand water removal by the vacuum system without morphological distortion. Cryo-techniques can observe in their original morphology and structure without various artifacts from conventional sample preparation. Rapid cooling is the method of choice for preparing plant samples for scanning electron microscopy in a defined physiological state. As one of cryo-technique, high-pressure freezing allows for fixation of native non-pretreated samples up to $200{\mu}M$ thick and 2 mm wide with minimal or no ice crystal damage for the freezing procedure. In this study, we could design to optimize structural preservation and imaging by comparing cryo-SEM and convention SEM preparation, and observe a fine, well preserved Arabidopsis stem's inner ultrastructure using HPF and cryo-SEM. These results would suggest a useful method of cryo-preparation and cryo-SEM for plant tissues, especially intratubule and vacuole rich structure.
The scanning electron microscopy is an ideal technique for examining plant surface at high resolution. Most hydrate samples, however, must be fix and dehydrate for observation in the scanning electron microscope. Because the microscopes operate under high vacuum, most specimens, especially biological samples, cannot withstand water removal by the vacuum system without morphological distortion. Cryo-techniques can observe in their original morphology and structure without various artifacts from conventional sample preparation. Rapid cooling is the method of choice for preparing plant samples for scanning electron microscopy in a defined physiological state. As one of cryo-technique, high-pressure freezing allows for fixation of native non-pretreated samples up to $200{\mu}M$ thick and 2 mm wide with minimal or no ice crystal damage for the freezing procedure. In this study, we could design to optimize structural preservation and imaging by comparing cryo-SEM and convention SEM preparation, and observe a fine, well preserved Arabidopsis stem's inner ultrastructure using HPF and cryo-SEM. These results would suggest a useful method of cryo-preparation and cryo-SEM for plant tissues, especially intratubule and vacuole rich structure.
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문제 정의
본 연구는 화학고정 및 일반 SEM 분석에서 발생할 수 있는 구조적 손상을 최소화 하기 위하여 HPF와 freeze fracture 기법을 이용한 cryo-SEM시료 제작법을 소개하고 이를 통한 cryo-SEM 관찰의 우수성을 확인하였다. 따라서 HPF와 freeze fracture 기법은 식물의 다양한 관상 구조와 액포 등의 미세구조 관찰을 위한 cryo-SEM 분석에 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
본 연구에서는 HPF를 이용한 cryo-SEM 기법과 일반적인 SEM 시료 제작법을 각각 이용하여 애기장대(Arabidopsis thaliana) 줄기의 단면을 비교 분석함으로써 식물의 관상구조 연구를 위한 효과적인 SEM 전처리 기법을 확립하고자 하였다.
제안 방법
시료는 100% 에탄올 혹은 초음파 세척기를 사용하여 세척한 지정된 HPF용 carrier에 넣을 수 있도록 최대 직경이 2 mm, 그리고 최대 두께가 200 μm가 되도록 준비하였다. 단면 채취한 애기장대 줄기를 각각 20% dextran (Sigma)과 1-hexadecene (Sigma)을 이용하여 종 방향으로 세운 후 carrier와 시료 사이의 빈 공간은 20% dextran과 1-hexadecene으로 채우고 다른 carrier를 이용하여 덮어주었다. 모든 준비가 완료된 시료는 HPF의 specimen holder로 옮겨 specimen pressure chamber에 넣고 동결 고정을 실시하였다.
생물 시료의 경우 전자선 손상을 최소화 하는 것이 중요한데 cryo-SEM에서는 전자선에 큰 영향을 받지 않고, 다만 파쇄시킨 시편이기 때문에 백금 도포를 고르게 하지 못하거나 너무 얇게 하게 될 경우 charging effect로 인해 양질의 이미지를 얻을 수 없다. 따라서 백금 도포의 조건을 시료에 따라 다양하게 변화시키면서 관찰하였다. 이상의 실험 방법은 Fig.
Etching은 동결된 시료의 내부 구조 및 표면 구조를 분명하게 볼 수 있도록 하는 효과가 있으며 수분을 함유한 생물시료의 경우 -80℃에서 재결정이 일어나는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 식물체 내 수분의 재결정화를 방지하고 승화의 효과를 극대화하기 위하여 최적 조건을 시험하여 etching의 시간을 단축시킨 상기 온도 조건을 적용하였다. Etching을 통해 드러난 표면 위에 전도성을 주기 위하여 백금을 도포하였다(1.
본 실험을 위하여 대표적 모델 식물인 애기장대를 사용하였으며 물관과 체관이 관통하는 줄기 부분을 vibratome 이용하여 200 μm 이내의 HPF 허용 두께로 정단면 채취하여 사용하였다. 이들 시료는 각각 일반적인 시료 제작과 동결 시료 제작을 위하여 Fig. 1과 같이 처리한 후 그 결과를 비교 분석하였다.
5% glutaraldehyde 고정액에 2시간 고정 후, 인산 완충용액(phosphate buffer, PB)에 15분씩 2회 세척하고 1% 오스뮴산(OsO4)에 1시간 동안 고정과 탈수 과정을 거친 후, hexamethyldisilazane (HMDS, SAMCHUN Pure Chemical) 용액으로 12시간 동안 치환하여 사용하였다. 화학고정을 거친 후 일반적인 SEM 관찰법과 동일하게 금(Au) 코팅을 한 후 LEO 1455VP (Carl Zeiss. Germany)에 장착한 후 가속전압 20 kV에서 이미지를 관찰하였다.
대상 데이터
본 실험을 위하여 대표적 모델 식물인 애기장대를 사용하였으며 물관과 체관이 관통하는 줄기 부분을 vibratome 이용하여 200 μm 이내의 HPF 허용 두께로 정단면 채취하여 사용하였다.
시료는 100% 에탄올 혹은 초음파 세척기를 사용하여 세척한 지정된 HPF용 carrier에 넣을 수 있도록 최대 직경이 2 mm, 그리고 최대 두께가 200 μm가 되도록 준비하였다.
이론/모형
Scanning electron microscopy (SEM) of Arabidopsis stem cross sections. Samples were prepared by (A and B) convention method, (C and D) cryo-prearation method using dextran, and (E and F) cryo-preparation method using hexadecene. A and B.
동결 시료의 경우 애기장대 줄기의 고정을 위하여 rapid cooling 법으로 알려진, HPF 장치(HPM010, Leica, Austria)를 이용하였다. 시료는 100% 에탄올 혹은 초음파 세척기를 사용하여 세척한 지정된 HPF용 carrier에 넣을 수 있도록 최대 직경이 2 mm, 그리고 최대 두께가 200 μm가 되도록 준비하였다.
성능/효과
따라서 시료에 맞추어 적절한 cryo-protectant를 사용하는 것이 중요하다. 본 연구를 통하여 1-hexadecene은 식물의 관상 구조를 관찰하기 위하여 적합하지 않음을 확인하였다. 추가적으로 고정 방법과 상관없이 ice crystal 생성 및 charging effect는 HPF를 이용한 cryo-SEM 관찰 시 매우 중요한 영향을 미친다.
애기장대 줄기의 미세구조를 일반 시료 제작법에 의해 관찰한 결과, 전처리 과정 중 발생한 것으로 보이는 구조적 수축과 변형 현상을 쉽게 확인할 수 있었다. 줄기의 기본 조직인 피층에서 나타난 구조적 변형으로 인하여 관상 구조물들의 내부 형태의 관찰이 불가능할 뿐만 아니라 피질 및 물관, 체관과 같은 다양한 관상 구조 안의 함유물들 또한 대부분 소실되어 있었고 엽록체 등 세포내 미세 구조물들은 전혀 관찰할 수가 없었다(Fig.
2c-f). 즉, 표피층 및 피질 부분의 관상 구조가 구조적 변형 없이 분명하게 관찰 되었고, 물관 및 체관 등의 내부 구조와 엽록체 그리고 미토콘드리아와 녹말 등의 미세구조를 확인할 수 있었다. 특히 HPF를 이용한 동결 고정시 동결 보호제로써 20% dextran을 사용하였을 경우 애기장대 줄기의 내부 구조 보전 효과가 뛰어나 세포내 엽록체와 미토콘드리아 등 미세구조의 판독이 용이하였으며 액포나 세포질 등의 보전 능력이 뛰어났다(Fig.
특히 HPF를 이용한 동결 고정시 동결 보호제로써 20% dextran을 사용하였을 경우 애기장대 줄기의 내부 구조 보전 효과가 뛰어나 세포내 엽록체와 미토콘드리아 등 미세구조의 판독이 용이하였으며 액포나 세포질 등의 보전 능력이 뛰어났다(Fig. 2c & d).
후속연구
본 연구는 화학고정 및 일반 SEM 분석에서 발생할 수 있는 구조적 손상을 최소화 하기 위하여 HPF와 freeze fracture 기법을 이용한 cryo-SEM시료 제작법을 소개하고 이를 통한 cryo-SEM 관찰의 우수성을 확인하였다. 따라서 HPF와 freeze fracture 기법은 식물의 다양한 관상 구조와 액포 등의 미세구조 관찰을 위한 cryo-SEM 분석에 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
1-hexadecene의 특징은?
이러한 HPF 처리 시 시료의 열전도 효율 증강과 물리적 손상으로부터의 보호 목적으로 사용하는 cryo protectant에는 1-hexadecene과 dextran이 보편적으로 사용되고 있다. 1-hexadecene은 transmission fluid로 표면장력이 낮고 liquid나 solid 상태에서 열전도율이 좋은 특징이 있다. 또한 dextran은 anti-freezing agents로 보통 20% 농도로 사용되며, cryo-section 시 1-hexadecene보다 더 잘 잘리는 것으로 알려져 있다.
cryo protectant의 사용목적은?
특히 시료의 내외에 함유된 수분과 공기 등은 급속 동결 시 결정화를 유발하므로 이를 방지하기 위하여 열전도를 최적화하고 시료에 대한 결정화를 억제할 수 있도록 세포내 수분 및 공기 등을 extra-cellular fluid로 치환할 필요가 있다. 이러한 HPF 처리 시 시료의 열전도 효율 증강과 물리적 손상으로부터의 보호 목적으로 사용하는 cryo protectant에는 1-hexadecene과 dextran이 보편적으로 사용되고 있다. 1-hexadecene은 transmission fluid로 표면장력이 낮고 liquid나 solid 상태에서 열전도율이 좋은 특징이 있다.
백금 도포의 조건을 시료에 따라 다양하게 변화를 주면서 실험한 이유는?
Cryo-SEM은 -100℃ 이하의 온도를 유지하면서 관찰하였다. 생물 시료의 경우 전자선 손상을 최소화 하는 것이 중요한데 cryo-SEM에서는 전자선에 큰 영향을 받지 않고, 다만 파쇄시킨 시편이기 때문에 백금 도포를 고르게 하지 못하거나 너무 얇게 하게 될 경우 charging effect로 인해 양질의 이미지를 얻을 수 없다. 따라서 백금 도포의 조건을 시료에 따라 다양하게 변화시키면서 관찰하였다.
참고문헌 (6)
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Boyde A: Biological specimen preparation for the scanning electron microscope: an overview. Proceedings of the Fifth Annual Electron Microscopy Symposium, Chicago, 1972.
Echlin P, Taylor SE: The preparation and X-ray microanalysis of bulk frozen hydrated vacuolated plant tissue. J Microsc 141 : 329-348, 1986.
Lee E-J, Moon Y-J, Oh H-W, Kim S-J, Chung Y-H, Kweon H-S, Kim Y-J: Observations of the Cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 using cryo-methods and cryo-SEM. Kor J Microsc 39 : 65-72, 2009.
Sargent JA: Low temperature scanning electron microscopy: advantages and applications. Scanning Microsc 2 : 835-849, 1988.
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