선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 리도카인 패치를 무모 흰쥐에 적용한 후 리도카인의 혈중 농도 변화 측정을 위한 분석 방법을 확립하고, 확립한 분석 조건을 검증하였다. 확립한 분석 조건을 이용하여 혈중 농도 변화를 측정해 약물 동력학적 파라미타를 산출하였다.
- 본 연구에서는 리도카인의 혈중 농도 변화 측정을 위한 분석 방법을 확립하고, 확립한 분석 조건을 검증하여 무모 흰쥐에서 리도카인 패치의 혈중 농도 변화를 측정하여 약물 동력학적 파라미타를 구하고자 하였다.
제안 방법
- 3 ml를 동일한 방법으로 채취하였다. 12 hr 경과 후 패치를 제거하고 계속하여 13, 14, 16, 18, 20 hr에 혈액 0.3 ml씩 채취 하였다. 각 시간별로 채취한 혈액은 원심분리하여 얻은 혈장을 분석시까지 -70℃에서 냉동 보관하였다.
- 혈장 중 리도카인의 농도변화 − 상기에서 확립된 LC/MS/MS 분석 조건으로 무모 흰쥐의 혈장을 분석하여 얻어진 피크 면적비를 검량선에 대입하여 계산함으로, 무모 흰쥐의 혈장 중 리도카인의 농도 추이를 알 수 있었다. 12시간 리도카인 패치(리도카인 30 mg)를 적용하였으며, 12시간째에 패치를 제거한 후 계속하여 8시간 동안 즉, 총 20시간 동안 혈장 중 약물의 농도 변화를 측정하였다. Fig.
- 유기용매층을 1ml 취한 뒤 speed-vac에서 증발 건조 시킨 다음, 최종적으로 잔사에 10 mM ammonium acetate : acetonitrile(50 : 50) 100 µl로 재용해하여 그 중 10 µl를 LC/MS/MS에 주입하였다.16) 여기에서 얻은 내부표준물질의 피크 넓이 비에 대한 리도카인의 피크 넓이 비로 검량선을 작성하고 직선성을 검증하였다. 재현성을 구하기 위해 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하고 연속하여 5일간 실험을 행하여 일간 재현성을 구하였다.
- LC/MS/MS 분석 조건 − 혈장중의 리도카인의 함량을 분석하기 위하여15) 다음의 조건으로 LC/MS/MS로 분석하였으며, 본 분석에 사용한 mass 범위는 m/z 100~700이었다.
- 검량선 작성 및 직선성 − 리도카인 표준품과 내부표준물질인 트리메타지딘을 각각 메탄올에 녹여 농도를 1 mg/ml로 만든 후 냉장 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관하였던 blank 혈장으로 희석하여 리도카인의 혈장 중 농도가 각각 10, 20, 50, 100, 200, 500 ng/ml 농도가 되도록 혈장시료를 조제하고 내부표준용액은 용매로 희석하여 최종농도가 5 µg/ml로 조제하였다.
- 냉해동 안정성 실험 − 혈장 중 리도카인을 저농도(20 ng/ml), 고농도(200 ng/ml)의 검체를 준비한 뒤 분석하여 초기값으로 하였다.
- 내부표준물질로 사용한 트리메타지딘은 분자량이 266으로 positive ion mode에서 molecular ion m/z 267이 검출되었으며, LC/MS/MS product ion spectrum에서는 m/z 181이 주요 fragment ion으로 검출되었다. 따라서 peak 검출은 MRM mode로, 리도카인의 molecular ion m/z 235/86을, 그리고 내부표준물질은 molecular ion m/z 267/181을 monitoring하였다(Fig. 1). 상기 LC/MS/MS 조건에서의 리도카인과 내부표준물질은 각각의 머무름 시간 2.
- 리도카인 패치를 무모 흰쥐에 부착시킨 후 얻은 혈장과 패치 제거 후 얻은 혈장중 약물농도-시간 곡선으로부터 최고혈장중농도(Cmax)와 최고혈장중농도 도달시간(Tmax), 혈장중약물농도시간곡선하 면적(AUC), 소실속도정수(Ke), 및 소실반감기(t1/2)는 식품의약품안전청이 제공한 K-BE test를 이용하여 산출하였다.18) 모든 측정치는 평균±표준편차로 나타내었다.
- 무모 흰쥐로부터 일정 간격별로 채취하여 -70℃에 보관했던 혈장 시료를 실온에 방치하여 녹인 후 1분간 진탕한 다음 이 혈장 100 µl를 취하여 시험관에 옮기고 여기에 내부표준용액(트리메타지딘 5 µg/ml) 50 µl를 가한 후 검량선 작성 방법과 동일한 방법으로 전 처리한 후 LC/MS/MS에 주입하였다.
- 무모 흰쥐의 혈장 시료를 분석하여 얻어진 크로마토그램으로부터 리도카인과 트리메타지딘의 피크면적 비를 구하여 미리 작성한 검량선으로부터 혈장 중 리도카인의 농도를 구하였다.
- 분석법 검증 − 분석조건에서 설정된 분석방법에 대한 검증을 국립독성연구원 생체시료분석법 validation에 의하여 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 장기 및 냉해동 안정성을 평가하였다.
- 시료의 전처리 − 무모 흰쥐로부터 각 시간별로 채취하여 -70℃에 보관했던 혈장 시료를 실온에 방치하여 녹인 후 1분간 진탕한 다음 이 혈장 100 µl를 취하여 시험관에 옮기고 여기에 내부 표준용액(트리메타지딘 5 µg/ml) 50 µl를 가한 후 검량선 작성 방법과 동일한 방법으로 전 처리하여 LC/MS/MS에 주입하였다.
- 검체를 24시간 -70℃에서 냉동한 후 실온에서 보조기구 없이 해동하였다. 완전히 녹았으면, 전처리하여 LC/MS/MS용 검액을 조제, 분석(1 cycle)하였다. 이와같은 과정을 2회 더 반복하여 2, 3 cycle 시의 각각의 잔존율을 측정하였다(n=3).
- 검량선 작성 및 직선성 − 무모 흰쥐의 혈장 중 리도카인 농도 범위를 포함하는 10~500 ng/ml에서 양호한 직선성을 나타내었다. 이로부터 검량선 최소 농도인 10 ng/ml를 정량한계농도 (lower limit of quantification, LLOQ)로 설정하여 리도카인 농도를 정량 하였다. 본 실험에 사용한 검량선은 y=0.
- 검량선 작성 및 직선성 − 무모 흰쥐의 혈장 중 리도카인 농도 범위를 포함하는 10~500 ng/ml에서 양호한 직선성을 나타내었다. 이로부터 검량선 최소 농도인 10 ng/ml를 정량한계농도 (lower limit of quantification, LLOQ)로 설정하여 리도카인 농도를 정량 하였다. 본 실험에 사용한 검량선은 y=0.
- 완전히 녹았으면, 전처리하여 LC/MS/MS용 검액을 조제, 분석(1 cycle)하였다. 이와같은 과정을 2회 더 반복하여 2, 3 cycle 시의 각각의 잔존율을 측정하였다(n=3).
- 장기 안정성 실험 − 혈장 중 리도카인을 저농도(20 ng/ml), 고농도(200 ng/ml)가 되도록 각각 6개씩 조제하고 동결하여 4주간 보존 후 분석하였다.
- 16) 여기에서 얻은 내부표준물질의 피크 넓이 비에 대한 리도카인의 피크 넓이 비로 검량선을 작성하고 직선성을 검증하였다. 재현성을 구하기 위해 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하고 연속하여 5일간 실험을 행하여 일간 재현성을 구하였다.
- 정밀성 및 정확성 − 검량선 작성 시와 동일한 농도를 작성하여 5일간 연속 실험하였으며, 일내 5회 연속 실험하여 얻어진 크로마토그램으로부터 리도카인과 내부표준물질의 피크면적 비를 구하였다.
- 정밀성 및 정확성의 검증 − 10(정량한계 농도), 20, 50, 100, 200, 500 ng/ml 6단계 농도의 리도카인 혈장 표준액을 상기의 검체처리방법으로 처리하여 분석한 결과는 Table I에 나타내었다. 정밀성은 리도카인의 피크면적 비의 표준편차를 피크면적 비의 평균값의 백분율(%)로서 구하였다. 본 분석방법의 정밀성 CV%는 일내 정밀성, 일간 정밀성 모두 ±15% 이내였다.
- 특이성 − 혈장 중 리도카인을 분석하기 위하여 turbo ion spray ionization과 triple-quadrupole LC/MS/MS를 이용하여 분석하였다.
- 복부에 리도카인 패치(3×2 cm2, 리도카인 30 mg 상당량)을17) 부착시킨 후 의료용 종이 테이프로 움직이지 않도록 고정시켰다. 패치 부착 후 2, 4, 6, 8, 10, 12 hr 후에 혈액 0.3 ml를 동일한 방법으로 채취하였다. 12 hr 경과 후 패치를 제거하고 계속하여 13, 14, 16, 18, 20 hr에 혈액 0.
- 본 연구에서는 리도카인 패치를 무모 흰쥐에 적용한 후 리도카인의 혈중 농도 변화 측정을 위한 분석 방법을 확립하고, 확립한 분석 조건을 검증하였다. 확립한 분석 조건을 이용하여 혈중 농도 변화를 측정해 약물 동력학적 파라미타를 산출하였다.
대상 데이터
- Co.(St Louis, Mo, U.S.A.)에서 구입하였으며, 내부표준물질로 사용한 트리메타지딘은 Boehringer Ingelheim Korea Ltd.에서 기증 받아 사용하였다.
- 에서 기증 받아 사용하였다. HPLC용 acetonitrile, methanol 및 methylt-buthyl ether는 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구입하였으며, 그 외 시약은 특급시약을 사용하였다. 분석기기는 Agilent Triple Quard LC/MS/MS System을 사용하였다.
- 리도카인 패치(제조번호 10001)는 (주)티디에스팜(서울, 한국)에서 제공받아 사용하였다. 리도카인 표준물질은 Sigma Chem.
- 무모 흰쥐(180∼230 g, male)을 ether로 마취시킨 후 패치 부착전(0 hr)에 심장에서 혈액 0.3 ml를 채취하였다.
- 이로부터 검량선 최소 농도인 10 ng/ml를 정량한계농도 (lower limit of quantification, LLOQ)로 설정하여 리도카인 농도를 정량 하였다. 본 실험에 사용한 검량선은 y=0.001106x+0.006367 (r2=0.983, 가중치 1/x2)(n=9)이었다(y: peak area ratio, x: lidocaine concentration).
- HPLC용 acetonitrile, methanol 및 methylt-buthyl ether는 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구입하였으며, 그 외 시약은 특급시약을 사용하였다. 분석기기는 Agilent Triple Quard LC/MS/MS System을 사용하였다.
- 실험동물로서는 무모 흰쥐(180∼230 g, male, Charles River Lab., U.S.A.)을 구입한 즉시 실험에 사용하였다.
- 이동상으로는 acetonitrile : 10 mM ammonium acetate=80 : 20(v/v %)을 사용하였으며, 유속은 0.25 ml/min, 칼럼은 Capcellpak C18 MG(Shiseido Japan, 2.0×150 mm)를 사용하였다.
데이터처리
- 18) 모든 측정치는 평균±표준편차로 나타내었다.
- 약물동태학적 파라미타 산출 − 무모 흰쥐의 혈장 중 리도카인 농도 분석 결과를 식약청에서 제공한 K-BE test로 분석하였다.
성능/효과
- 7,9,10) 대상포진은 수두를 일으키는 바이러스와 동일한 바이러스에 의해 발병하게 되는데, 인체에 침입한 바이러스가 잠복기를 거친 후 신경을 따라 피부로 이동해 수포를 발생하게 한다.11) 대상포진 발병환자의 약 20% 정도가 대상포진 후 신경통증으로 발전하게 되며, 나이는 대상포진 후 신경통증 발병의 중요한 위험 요소 중의 하나로 50대 이상에서 50%, 80대 이상에서 80%의 환자가 대상포진 발병 후 대상포진 후 신경통증을 경험하게 된다.12)
- 7h으로 보고하였으며, 본 실험에 이용한 무모 흰쥐는 비글 견 및 고양이보다 빠른 배설속도를 나타냄을 알 수 있었다. Tmax 는 비글 견에서는 10.67 h, 또는 9.27 h였으나 무모 흰쥐에서는 6h이었으며, 본 실험결과에 의하면 비글 견 또는 고양이보다 무모 흰쥐에서 빠른 피부 흡수 및 빠른 배설을 나타내는 것으로 해석되었다.
- 검량선 작성 및 직선성 − 무모 흰쥐의 혈장 중 리도카인 농도 범위를 포함하는 10~500 ng/ml에서 양호한 직선성을 나타내었다.
- 냉해동 안정성 실험 결과 − 혈장 중 리도카인 저농도(20 ng/ml)와 고농도(200 ng/ml)의 검체의 분석 결과는 초기검체의 97.27~108.77%에 해당하여 안정한 것으로 사료되었다(Table II).
- 리도카인 패치를 12시간 적용 한 다음 패치를 제거한 후 계속하여 8시간 동안 측정한 결과 즉, 0∼20시간의 약물동력학적 파라미타 AUC0-20h는 2,926.32±335.28 ng · h/ml, Cmax는 256.86±29.63 ng/ml, Tmax는 6.00±2.31h였다(Table III).
- 분석법 validation 결과 혈장 중 리도카인에 대한 LC/MS/MS 분석법은 본 실험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있었다. 혈장 중 리도카인의 장기 안정성 시험 결과 및 냉해동 안정성 시험 결과도 안정한 것으로 사료되었다.
- 1). 상기 LC/MS/MS 조건에서의 리도카인과 내부표준물질은 각각의 머무름 시간 2.2분과 1.5분 부근에서 검출되었고, 위의 검출조건에서 타 물질에 의한 방해 peak는 전혀 나타나지 않았으며, 우수한 selectivity를 나타내었다(Fig. 2)
- 이로부터 혈장 중 리도카인에 대한 상기의 LC/MS/MS 분석법은 본 실험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
- 장기 안정성 실험 결과 − 혈장 중 리도카인 저농도(20 ng/ml)와 고농도(200 ng/ml)의 장기 안정성 시험 결과는 잔존율 89.57~98.62%에 해당하여 안정한 것으로 사료되었다(Table II).
- 특이성의 검증 − 시험방법과 같이 검체를 처리하여 LC/MS/MS로 분석하였을 때 얻어진 크로마토그램은 Fig. 2과 같았으며, 리도카인의 피크의 유지시간은 약 2.2분, 내부표준물질 피크의 유지시간은 약 1.5분으로 크로마토그램 상에서 나타난 바와 같이 신호 대 잡음 비(S/N ratio)를 10 이상으로 한 분석조건에서 리도카인과 내부표준물질은 기타 혈장 성분들과 잘 분리되었다.
- 혈장 중 리도카인의 농도변화 − 상기에서 확립된 LC/MS/MS 분석 조건으로 무모 흰쥐의 혈장을 분석하여 얻어진 피크 면적비를 검량선에 대입하여 계산함으로, 무모 흰쥐의 혈장 중 리도카인의 농도 추이를 알 수 있었다.
- 분석법 validation 결과 혈장 중 리도카인에 대한 LC/MS/MS 분석법은 본 실험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있었다. 혈장 중 리도카인의 장기 안정성 시험 결과 및 냉해동 안정성 시험 결과도 안정한 것으로 사료되었다. 검량선은 y=0.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.