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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 제주흑우의 유전자원 보존뿐만 아니라 토종 가축의 육성 및 대량 증식을 위한 안정적인 동결정액 제조법을 수립하기 위하여 제주흑우의 동결정액 제조시 항산화제로서 taruine, hypotaurine 그리고 trehalose의 첨가가 동결 융해 후 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성, 첨체막 온전성 및 정자의 난자내 침투 능력에 미치는 영향에 대하여 연구하고자 수행하였다.
- 본 연구는 제주흑우 정액의 동결정액 제조시 동결보존액에 taurine, hypotaurine 그리고 trehalose를 첨가하여 제주흑우 동결정자의 운동성, 생존성, 정자막 온전성, 첨체막 변화 양상 그리고 정자의 난자내 침투 능력을 개선하고자 수행하였다. 현재 사용되고 있는 동결정액 제조 방법은 성공적인 상업적 이용이 되고 있으나, 정자는 동결 융해 과정 동안에 큰 손상을 입게 되며 (Liu 등, 2004; Aisen 등, 2005; Gillan 등, 1997), 이러한 손상은 인공수정 후 정자의 운동성과 수정능력을 감소시키게 된다.
제안 방법
- 0.9% NaCl 용액에 0.5% Eosin-Y를 용해한 후 10 μl의 정액을 slide glass 위에 올린 다음 동량의 염색액을 섞어 도말하여 cover glass를 덮고 MicroLux 현미경(X 70, Olympus, Japan)하에서 관찰하였다.
- 5% Eosin-Y를 용해한 후 10 μl의 정액을 slide glass 위에 올린 다음 동량의 염색액을 섞어 도말하여 cover glass를 덮고 MicroLux 현미경(X 70, Olympus, Japan)하에서 관찰하였다. 100 배율에서 염색 상태를 관찰하여 표본 1개당 200개의 정자를 카운트하였으며, 붉게 염색된 죽은 정자의 비율을 계산하여 개체 당 2개의 표본을 만들어 총 400개의 정자를 카운트, 생존율을 평가하였다.
- 10주~15주령 사이의 햄스터에 PMSG 30 IU를 복강내 주사하고 48시간 후 hCG 30 IU를 복강 주사하여 배란을 유도하였다. hCG 주사 15시간 후 개복하여 난관을 채취하여 난관내 배란된 난자를 회수하였다.
- 10주~15주령 사이의 햄스터에 PMSG 30 IU를 복강내 주사하고 48시간 후 hCG 30 IU를 복강 주사하여 배란을 유도하였다. hCG 주사 15시간 후 개복하여 난관을 채취하여 난관내 배란된 난자를 회수하였다. 회수된 난자는 0.
- 5시간 후 공배양 된 난자를 2~3회 세척하여 slide glass위에 올려 mounting 한 다음 methanol : acetic acid (3:1, v/v) 용액에서 24시간동안 고정시켰다. 고정된 난자는 1% lacmoid를 이용하여 염색한 후 위상차 현미경을 이용하여 침투된 정자의 변화를 관찰하였다 (X 400 magnification).
- 45% NaCl 용액) 1 ml에 정자 샘플 100 μl를 혼합하여 37℃에서 5분간 정치시킨 후 slide glass에 도말하였다. 도말한 표본은 개체당 2개의 slide를 만들어 표본당 200개의 정자를 카운트하여 정자막의 온전성을 평가하였다.
- 동결 융해된 정자를 PBS를 이용하여 400 gX, 2회 원심분리하여 동결보존액을 제거한 다음, 10 μg/ml의 heparin이 포함된 TALP 배양액을 이용하여 39℃, 5% CO2 배양기에서 10분간 수정능획득을 유도하였다.
- 동결된 정액은 LN2 tank에서 보관하였으며 필요 시 융해하여 사용하였다. 동결정액은 공기중에서 약 10초간 정치하여 37℃ 온수에 20초간 침지시켜 융해한 후 정자의 생존율 및 정자 양상을 조사하였다.
- 본 실험에 이용된 보존액의 조성은 Table 1과 같으며, 대조구로서 7%의 glycerol을 동결보호제로 사용하였으며 실험구로 7%의 glycerol이 포함된 희석제에 20 mM의 taurine, hypotaurine 그리고 trehalose를 첨가하였다. 채취된 정액은 즉시 실험실로 운반하고, 원정액을 Tris-Egg yolk extender과 1:1로 희석하여 냉각을 시작하여 5단계를 거쳐 총 2시간동안 냉각시켰다.
- 5% glutaradehyde를 혼합하여 4℃에서 보관하였다. 염색후 24시간 이내에 판독하였으며, 정자 첨체막 양상의 판독 기준은 Fraser (1995)의 분류를 따라 정자 두부가 전체적으로 형광 발광을 할 경우 수정능획득이 일어나지 않은 F pattern으로, 적도면 부분에 띠가 형성되어 첨체 아랫부분에서 형광 발광을 할 경우 수정능획득이 일어난 B pattern으로 구분하였으며, 마지막으로 정자 두부가 형광 발광을 하지 않거나, 얼룩덜룩한 발광을 할 경우 첨체반응이 일어난 AR pattern으로 구분하였다.
- 정액 채취는 인공질(Model 66000-D, Nasco, FHK, 일본)을 사용하여 채취하였다. 정액 채취를 위하여 암컷을 안전하게 정액 채취실 보정틀에 고정시킨 후, 제주흑우 수컷을 2~3회 암컷의 주위를 맴돌게 하여 흥분을 유도하였다. 승가가 이루어지면 수컷의 penis 를 인공질에 삽입하여 정액을 채취하였다.
- 정액의 운동성 평가는 MicroLux 현미경(X 70, Olympus, Japan)하에서 정자의 활력을 평가하였다. 혈구계산판에 5 μl의 정액을 놓고 cover glass로 덮은 후 100배율에서 정자의 운동성을 평가하였다.
- 정자막 온전성을 측정하기 위하여 Jeyendran 등(1984)의 방법을 변형하여 저삼투압 용액을 이용한 정자 미부의 팽창형태를 분석 하였다(Hypo-Osmetic Swelling Test: HOST). 37℃의 저장액 (150 mOsm/kg, 0.
- 혈구계산판에 5 μl의 정액을 놓고 cover glass로 덮은 후 100배율에서 정자의 운동성을 평가하였다.
- 혈구계산판에 5 μl의 정액을 놓고 cover glass로 덮은 후 100배율에서 정자의 운동성을 평가하였다. 혈구계산판의 격자 2군데를 반복적으로 관찰하여 거의 모든 정자들이 소용돌이 치며 활발하게 움직이는 것을 90% 이상으로, 생존 정자들을 격자 별로 100개 가량을 관찰하여 활발하게 움직이는 정자들이 80개 이상일 때 80%로, 70개 이상일 때 70%로 판단하고 움직이는 정도가 전진 운동 또는 느리게 전진 운동하는 수준일 때 50%, 느리게 전진운동 하거나 진자 운동 혹은 미동 하는 수준일 때 30%로 평가하였다.
대상 데이터
- 정액채취에 이용된 흑우는 3세 이상의 수컷 6두를 선발하여 별도 공간에서 자유 급식하여 사육하였으며, 월 4회 정액을 채취하였다. 정액 채취는 인공질(Model 66000-D, Nasco, FHK, 일본)을 사용하여 채취하였다. 정액 채취를 위하여 암컷을 안전하게 정액 채취실 보정틀에 고정시킨 후, 제주흑우 수컷을 2~3회 암컷의 주위를 맴돌게 하여 흥분을 유도하였다.
- 정액채취에 이용된 흑우는 3세 이상의 수컷 6두를 선발하여 별도 공간에서 자유 급식하여 사육하였으며, 월 4회 정액을 채취하였다. 정액 채취는 인공질(Model 66000-D, Nasco, FHK, 일본)을 사용하여 채취하였다.
데이터처리
- 통계 분석은 통계분석프로그램(SPSS version 18.0)을 이용하였으며, 항산화제의 첨가가 동결 융해 후 정자의 성상에 미치는 영향에 대한 결과는 ANOVA를 이용하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 정자의 난자내 침투 능력의 평가는 Oh 등의 방법(2010)을 이용하여 계산하였다.
- 정자의 생존성은 Eosin-Y 염색법을 이용하여 생존율을 평가하였다. 0.
- 첨체막의 변화 양상을 측정하기 위하여 Chlortetracyclin (CTC) 염색법을 사용하였으며, 이 방법으로 정자의 첨체막 변화 양상을 조사하였다. 정액을 400 Xg에서 2분간 원심분리하여 세척한 다음 500μl의 CTC 용액(750 μM CTC, 130 mM NaCl, 5 mM cystein in 20 mM Tris buffer; pH 7.
성능/효과
- HOST를 통한 정자막 온전성 검사에 있어서는 taurine, hypotaurine 그리고 trehalose 의 첨가가 대조구에 비하여 유의적으로 높게(p<0.05) 나타났다(Table 3).
- Taurine, hypotaurine 그리고 trehalose의 첨가는 대조구에 비하여 유의적으로 높은 정자의 PN 형성과 SIF를 나타냈다(p<0.05).
- Taurine과 hypotaurine의 첨가는 유의적으로 높은 운동성, 생존성을 보였으며(p<0.05), 특히 hypotaurine은 다른 실험구에 비하여 유의적으로 높은 정자막 온전성을 나타냈다(p<0.05).
- Taurine과 trehalose의 첨가는 F pattern과 B pattern 모두 대조구와 비슷한 수준의 비율을 나타내었으나, AR pattern의 비율에 있어서 대조구에 비하여 유의적으로 낮은 수준을 나타냈다(p<0.05).
- Trehalose의 첨가는 운동성과 생존율이 대조구와 유의적 차이를 보이지 않은 반면에 정자막 온전성에 있어서는 대조구에 비하여 유의적으로 높은 결과를 나타냈다 (p<0.05).
- 본 연구에서는 taurine, hypotaurine 그리고 trehalose를 첨가한 모든 실험구에서 대조구보다 유의적으로 높은 (p<0.05) 웅성 전핵 형성율과 SFI를 나타냈다(Table 4).
- 본 연구의 결과 taurine, hypotaurine 그리고 trehalose의 첨가가 동결 융해 후 조기 첨체반응의 발생을 감소시켜 AR pattern의 비율이 대조구에 비하여 유의적으로 감소하였으나(p<0.05), 수정능획득을 나타내는 B pattern의 비율은 hypotaurine에서만 유의적으로 감소하였으며 (p<0.05), 또한 수정능획득 반응이 나타나지 않은 F pattern의 비율도 hypotaurine 첨가에서만이 유의적으로 높은 결과(p<0.05)를나타냈다(Fig. 1).
- 이러한 결과는 앞서 설명된 taurine, hypotaurine 그리고 trehalose가 정자의 동결 과정에서 발생하는 세포의 손상으로부터 정자를 보호하여 정자의 운동성, 생존성, 정자막 온전성, 첨체막 온전성을 개선시키고, 최종적으로 정자의 수정능력을 보호한다는 보고들과 일치한다. 본 연구의 결과 제주흑우의 동결 정액 제조에 있어 항산화제로서 taurine, hypotaurine 그리고 trehalose의 첨가는 동결 융해 과정에서 발생되는 손상으로부터 정자를 보호하여 정자의 운동성, 생존성, 정자막 온전성, 첨체막 온전성 및 수정능력을 유의적으로 개선시킴을 보여주고 있다.
- 뿐만 아니라, hypotaurine은 유의적으로 높은 F pattern 비율을 유지하였으며(p<0.05), 이들 항산화물질을 첨가한 실험구에서는 대조구에 비하여 유의적으로 낮은 AR pattern을 나타내어(p<0.05) 동결로 기인된 수정능획득 유사 상태 정자의 비율을 유의적으로 감소시켜 조기 첨체반응 비율을 감소시켰다.
- 1). 이러한 결과는 항산화제로서 taurine, hypotaurine 그리고 trehalose의 첨가가 동결 융해 후 정자를 보호하여 동결로 인해 발생한 수정능획득 상태의 정자를 보호하여 조기 첨체 반응을 방지하는 것으로 판단된다.
- 05) 동결로 기인된 수정능획득 유사 상태 정자의 비율을 유의적으로 감소시켜 조기 첨체반응 비율을 감소시켰다. 정자의 난자내 침투능력에 있어서 모든 처리구에서 대조구보다 높은 웅성전핵 형성율과 SFI를 나타냈으며, hypotaurine의 처리는 가장 높은 침투능력을 나타냈으나 처리구간의 유의적 차이는 나타나지 않았다. 본 연구결과는 멸실위험의 토종가축 생식세포 및 유전자원 보존과 토종가축 육성을 위한 번식 증대를 위한 제주흑우 동결정액 제조에 중요한 이용 방법이 될 것이며, 동결 융해 후 정자의 기능 개선을 위한 다양한 희석제 및 첨가제를 활용한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 정자의 운동성 및 생존율의 결과와 마찬가지로 taurine과 hypotaurine을 첨가한 실험구에서 유의적으로 높은(p<0.05) 정자막 온전성을 나타냈다(Table 3).
- 제주흑우의 동결 정액 제조시 동결 보존액에 첨가한 taurine과 hypotaurine은 동결 융해 후 정자의 운동성, 생존성 그리고 정자막 온전성을 개선시키는 것을 알 수 있었다. Taurine과 hypotaurine의 첨가는 유의적으로 높은 운동성, 생존성을 보였으며(p<0.
후속연구
- 정자의 난자내 침투능력에 있어서 모든 처리구에서 대조구보다 높은 웅성전핵 형성율과 SFI를 나타냈으며, hypotaurine의 처리는 가장 높은 침투능력을 나타냈으나 처리구간의 유의적 차이는 나타나지 않았다. 본 연구결과는 멸실위험의 토종가축 생식세포 및 유전자원 보존과 토종가축 육성을 위한 번식 증대를 위한 제주흑우 동결정액 제조에 중요한 이용 방법이 될 것이며, 동결 융해 후 정자의 기능 개선을 위한 다양한 희석제 및 첨가제를 활용한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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