한국산 피막이속(Hydrocotyle L.)의 5종과 울릉도에서 새로 발견한 H. sp 그리고 outgroup인 병풀 (Centella asiatica)을 포함하여 총 7분류군을 대상으로 분자계통학적 연구를 수행하여 종의 실체 및 문제점을 검토하고 유연관계를 살펴보았다. 분자계통학적 연구의 marker로는 nrDNA의 ITS 지역과 cpDNA의 trnH-psbA지역을 사용하였다. 한국산 피막이속은 94%의 지지도로 묶였으며, 크게 4개의 분계조를 형성하였다. 선피막이 (H. maritima)와 피막이 (H. sibthorpioides), 제주피막이 (H. yabei)와 큰잎피막이 (H. nepalensis), 큰피막이 (H. ramiflora) 그리고 H. sp가 각각의 분계조를 형성하였다. 그러나 선피막이, 피막이, 제주피막이의 경우 독립된 분계조를 형성하지 않았으며, H. sp의 경우 분자적으로 독립적인 분계조를 형성하고 있어 새로운 종으로써의 가능성을 제시하였다.
한국산 피막이속(Hydrocotyle L.)의 5종과 울릉도에서 새로 발견한 H. sp 그리고 outgroup인 병풀 (Centella asiatica)을 포함하여 총 7분류군을 대상으로 분자계통학적 연구를 수행하여 종의 실체 및 문제점을 검토하고 유연관계를 살펴보았다. 분자계통학적 연구의 marker로는 nrDNA의 ITS 지역과 cpDNA의 trnH-psbA지역을 사용하였다. 한국산 피막이속은 94%의 지지도로 묶였으며, 크게 4개의 분계조를 형성하였다. 선피막이 (H. maritima)와 피막이 (H. sibthorpioides), 제주피막이 (H. yabei)와 큰잎피막이 (H. nepalensis), 큰피막이 (H. ramiflora) 그리고 H. sp가 각각의 분계조를 형성하였다. 그러나 선피막이, 피막이, 제주피막이의 경우 독립된 분계조를 형성하지 않았으며, H. sp의 경우 분자적으로 독립적인 분계조를 형성하고 있어 새로운 종으로써의 가능성을 제시하였다.
Phylogenetic analyses were conducted to evaluate relationships of 5 taxa of Korean Hydrocotyle, H. spp. found in the Ulleung island including one outgroup (Centella asiatica). The molecular phylogenetic methods based on nuclear ribosomal DNA ITS region and cpDNA trnH-psbA region. Centella asiatica w...
Phylogenetic analyses were conducted to evaluate relationships of 5 taxa of Korean Hydrocotyle, H. spp. found in the Ulleung island including one outgroup (Centella asiatica). The molecular phylogenetic methods based on nuclear ribosomal DNA ITS region and cpDNA trnH-psbA region. Centella asiatica was used outgroup for analysis. As the result, genus Korean Hydrocotyle were grouped by 94% bootstrap value. Korean Hydrocotyle was grouped by four clades; Clade I-H. maritima, H. sibthorpides and H. yabei clade Clade II-H. nepalensis clade clade III-H. ramiflora clade clade IV-H. spp. clade. H. maritima, H. sibthorpides and H. yabei was not distinguished, seperately. H. spp. was distinctly distinguished other Korean Hydrocotyle.
Phylogenetic analyses were conducted to evaluate relationships of 5 taxa of Korean Hydrocotyle, H. spp. found in the Ulleung island including one outgroup (Centella asiatica). The molecular phylogenetic methods based on nuclear ribosomal DNA ITS region and cpDNA trnH-psbA region. Centella asiatica was used outgroup for analysis. As the result, genus Korean Hydrocotyle were grouped by 94% bootstrap value. Korean Hydrocotyle was grouped by four clades; Clade I-H. maritima, H. sibthorpides and H. yabei clade Clade II-H. nepalensis clade clade III-H. ramiflora clade clade IV-H. spp. clade. H. maritima, H. sibthorpides and H. yabei was not distinguished, seperately. H. spp. was distinctly distinguished other Korean Hydrocotyle.
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문제 정의
, 1992). 따라서 본 연구는 위와 같이 외부형태학적 형질 중 영양형질로 분류되고 있는 피막이속 종의 실체와 아울러 유연관계를 파악하고자 nrDNA의 ITS지역, cpDNA의 trnH-psbA 지역을 비교 분석하였다.
본 논문은 nrDNA의 ITS지역과 cpDNA의 trnH-psbA지역을 바탕으로 피막이속의 실체파악과 종의 한계 설정 및 유연관계를 확인하고자 하였다. ITS의 염기서열 길이 및 염기 조성은 속내에서 비교하여 큰 차이점을 보여주지는 않았다.
제안 방법
DNA 추출 및 PCR : DNA 추출은 생체 혹은 건조표본을 이용하였다. 야외에서 직접 채집한 생체의 경우 실험실로 운반하여 즉시 잎을 채취하여 –70℃에서 냉동 보관하였다.
표본관에 소장된 석엽 표본에서 절취한 재료의 경우에는 PrecellysⓇ 24 Homogeniser를 이용하여 분쇄시킨 후, Dolye and Doyle(1987)의 CTAB 방법을 수정하여 Loockerman and Jansen(1996)의 방법으로 추출하였다. 추출된 DNA는 1.2% agarose gel 상에서 전기영동 후, EtBr 염색법으로 UV 조명아래서 형광 밝기를 상대 비교하고 흡광도를 측정하여 농도를 확인 하였다. PCR(Polymerase chain reation) 반응 용액의 조성은 다음과 같다.
PCR(Polymerase chain reation) 반응 용액의 조성은 다음과 같다. 주형 DNA 20-50 ng, 10XTaq polymerase reaction buffer 5 ㎕, 각 10mM의 dNTPs mix 1 ㎕, 10pmol 의 primer 각각 2 ㎕, 2.5 unit의 Diastar-Taq DNA polymerase 0.25 ㎕(SolGent Co,)에 total volume이 총 50 ㎕가 되도록 증류수를 조절하여 첨가 하였다.
한국산 피막이속(Hydrocotyle L.)의 5종과 울릉도에서 새로 발견한 H. sp 그리고 outgroup인 병풀 (Centella asiatica)을 포함하여 총 7분류군을 대상으로 분자계통학적 연구를 수행하여 종의 실체 및 문제점을 검토하고 유연관계를 살펴보았다. 분자계통학적 연구의 marker로는 nrDNA의 ITS 지역과 cpDNA의 trnH-psbA지역을 사용하였다.
대상 데이터
본 연구에서 사용된 재료는 2009년 6월부터 2010년 6월까지 6분류군에 대하여 자생지에서 직접 채집하여 사용하였으며, 채집된 재료는 건조 표본으로 제작하여 영남대학교 생명과학과 식물표본관(YNUH)에 확증표본으로 보관하였다. 또한 국내 국립수목원 식물표본관(KH)에 소장된 건조표본들을 연구재료로 사용하였다.
본 연구에서 사용된 재료는 2009년 6월부터 2010년 6월까지 6분류군에 대하여 자생지에서 직접 채집하여 사용하였으며, 채집된 재료는 건조 표본으로 제작하여 영남대학교 생명과학과 식물표본관(YNUH)에 확증표본으로 보관하였다. 또한 국내 국립수목원 식물표본관(KH)에 소장된 건조표본들을 연구재료로 사용하였다. 본 연구에서 사용된 total genomic DNA는 총 6분류군으로 outgroup으로는 산형과(Umbelliferae)에 속하는 병풀(Centella asiatica)를 선정하였다.
sp 그리고 outgroup인 병풀 (Centella asiatica)을 포함하여 총 7분류군을 대상으로 분자계통학적 연구를 수행하여 종의 실체 및 문제점을 검토하고 유연관계를 살펴보았다. 분자계통학적 연구의 marker로는 nrDNA의 ITS 지역과 cpDNA의 trnH-psbA지역을 사용하였다. 한국산 피막이속은 94%의 지지도로 묶였으며, 크게 4개의 분계조를 형성하였다.
데이터처리
염기서열의 정렬 및 자료 분석: 각 염기서열들은 Sequnecher program(Gene Code, USA)으로 조합하여 MacClade 4.0(Sinauer Associates, Inc.)을 사용하여 no gap으로 저장한 후 Clustal X (Thompson et al, 1997)로 정렬하였다. 정렬 결과 발생한 gap은 결여형질(missing character)로 처리하여 모든 형질에는 같은 가중치를 부여하였다.
이론/모형
냉동 보관된 재료를 액체 질소를 이용하여 분쇄시킨 후 Dolye & Dolye(1987)의 CTAB 방법을 수정한 Loockerman & Jansen(1996)의 방법에 따라 추출하였다.
염기서열 간의 유전적 거리(Kimura’s 2 parameter 방법: Kimura, 1980)계산과 Parsimony analysis, Maximum likelihood는 PAUP* ver. 4.0b(Swofford, 2002)를 사용하여 수행하였다, Parsimony analysis는 Heuristic search를 이용하였으며, Heuristic search의 option으로 TBR branch-swapping algorithm을 적용하였다.
4.0b(Swofford, 2002)를 사용하여 수행하였다, Parsimony analysis는 Heuristic search를 이용하였으며, Heuristic search의 option으로 TBR branch-swapping algorithm을 적용하였다. 또한 각 분계도의 지지정도를 알아보기 위하여 Bootstraping(Felsenstain, 1985)과 Jackknifing(Farris et al, 1996)을 이용하였다.
0b(Swofford, 2002)를 사용하여 수행하였다, Parsimony analysis는 Heuristic search를 이용하였으며, Heuristic search의 option으로 TBR branch-swapping algorithm을 적용하였다. 또한 각 분계도의 지지정도를 알아보기 위하여 Bootstraping(Felsenstain, 1985)과 Jackknifing(Farris et al, 1996)을 이용하였다. Maximum-Likelihood analysis는 Modeltest ver 3.
또한 각 분계도의 지지정도를 알아보기 위하여 Bootstraping(Felsenstain, 1985)과 Jackknifing(Farris et al, 1996)을 이용하였다. Maximum-Likelihood analysis는 Modeltest ver 3.7(Posda and Crandall, 1998)을 이용하여 적정 모델을 선정하였으며, hLRTs의 기준을 적용하여 수행하였다. Heuristic search의 option으로 TBR branch-swapping algorithm을 적용하였다.
성능/효과
또한 국내 국립수목원 식물표본관(KH)에 소장된 건조표본들을 연구재료로 사용하였다. 본 연구에서 사용된 total genomic DNA는 총 6분류군으로 outgroup으로는 산형과(Umbelliferae)에 속하는 병풀(Centella asiatica)를 선정하였다. Outgroup의 경우 피막이속에 대한 선행되어온 연구에서 유연관계가 가장 가깝다고 판단된 병풀을 사용하였다(Van De Wiel et al.
12개의 ITS 염기서열을 정렬한 결과 길이는 총 617- 622bp로 나타났으며, ITS1과 2의 길이는 각각 202-205bp, 256bp였으며 5.8S는 161bp로 나타났다. 전체적으로 ITS2 지역이 ITS1 지역보다 길어 다른 피자식물의 경우와는 차이가 있었다(Baldwin et al.
길이 변이는 ITS1 지역이 ITS2 에 비해 더 높게 나타났으나 두 지역 모두 길이의 변이가 심하게 나타나지는 않았다. Ingroup에서 ITS1의 길이가 가장 짧게 나타난 분류군은 큰잎피막이였으며, 제주피막이, 피막이, 선피막이가 가장 긴 길이를 가지는 분류군으로 나타났다. 염기 조성은 평균 A가 18.
Ingroup에서 ITS1의 길이가 가장 짧게 나타난 분류군은 큰잎피막이였으며, 제주피막이, 피막이, 선피막이가 가장 긴 길이를 가지는 분류군으로 나타났다. 염기 조성은 평균 A가 18.2%, C가 29.7%, G가 28.7%, T가 21.8% 였고, DNA의 구조 및 물리적 특성을 결정하는 C+G의 함량은 ITS1 지역에서는 선피막이가 58.7%로 가장 높게 나타났으며, ITS2 지역에서는 H. sp가 62.8-65.2%로 가장 높게 나타났고, 5.8S에서는 피막이와 제주피막이가 67.3%로 가장 높게 나타났다(Table 2). trnH-psbA지역의 경우 큰잎피막이가 275bp로 가장 길게 나타났으며 큰피막이와 H.
그 위로 큰잎피막이(HY26)가 하나의 분계조를 이루고 있으며, 제주피막이(HY16)는 독립되어 분계조를 형성하거나 또는 피막이, 선피막이와 같은 분계조를 형성하며 71% bootstrap value로 지지하고 있다. H. sp, 큰피막이 그리고 큰잎피막이의 경우 확연히 다른 분계조를 이루고 있었으나, 선피막이, 피막이 그리고 제주피막이 한 개체의 경우 71% bootstrap value로 가까운 유연관계에 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 cpDNA marker인 trnH-psbA 지역에서는 크게 4개의 분계조로 나타났다.
선피막이의 경우 화경의 길이가 엽병의 길이보다 짧고, 잎보다 밑에서 꽃이 피며 줄기가 곧추 서고, 피막이와 제주피막이의 경우 외부형태학적으로 화경과 엽병의 길이가 비슷하며 줄기가 기는 것이 공통점이지만 겨울철에 땅 속에서 월동하는 제주피막이와 월동하지 않는 피막이로 두 분류군을 구분하고 있다. ITS, trnH-psbA 그리고 combined data등 3개의 분자적 분석결과, 한 개체의 제주피막이를 제외하고는 71% bootstrap value로 한 분계조를 이루고 있었다. 이는 제주피막이에서 선피막이와 피막이가 분지되었을 가능성을 가지고 있다.
sp의 경우 엽형이 원두형(roundish)과 결각이 심한 중간 형태를 나타내고 있었으며, 잎의 앞, 뒷면에 털이 존재하지 않는 특징을 가지고 있다. 분자적 실험 결과 ITS, trnH-psbA 그리고 combined data등의 모든 tree에서 큰피막이와 H. sp의 경우 별개의 분계조를 형성하고 있어 독립된 분류군으로 처리 하는게 타당하다고 생각된다.
sp만 독립된 분계조를 형성하고 있었으며, 선피막이, 피막이, 제주피막이의 경우 모든 tree에서 매우 가까운 유연관계를 보임에 따라 분류군의 계급설정은 좀 더 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료 된다. 또한 H. sp의 경우 다른 종과는 다르게 잎의 앞, 뒷면, 화경, 엽병에 털이 존재하지 않았으며, 분자적 실험에서도 독립적인 분계조를 나타냄에 따라 새로운 분류군으로써의 가능성을 보여주었다.
sp가 각각의 분계조를 형성하였다. 그러나 선피막이, 피막이, 제주피막이의 경우 독립된 분계조를 형성하지 않았으며, H. sp의 경우 분자적으로 독립적인 분계조를 형성하고 있어 새로운 종으로써의 가능성을 제시하였다.
후속연구
이를 종합적으로 판단하였을 때 국가표준식물목록(Korea National Arboretum and The Plant Taxonomic of Society Korea, 2007)에서 제시되고 있는 선피막이, 피막이, 제주피막이, 큰잎피막이, 큰피막이 5종 중 큰잎피막이, 큰피막이와 H. sp만 독립된 분계조를 형성하고 있었으며, 선피막이, 피막이, 제주피막이의 경우 모든 tree에서 매우 가까운 유연관계를 보임에 따라 분류군의 계급설정은 좀 더 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료 된다. 또한 H.
따라서 본 연구는 nrDNA의 ITS 지역과 cpDNA의 trnH-psbA 지역 염기서열을 비교 분석하여 국부적이지만 한국산 피막이속(Hydrocotyle) 식물의 종내 한계 설정과 유연관계를 파악하고자 하였으며, 피막이, 선피막이, 제주피막이의 경우 확실한 독립된 분계조가 나타나지 않아 많은 개체와 지역별 분석을 실시하여야 할 것이며, 이번 연구에서 나타난 H. sp의 경우 분자적으로 확연히 다른 분계조를 형성함에 따라 추가적인 연구를 통해 결정되어야 한다고 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
큰피막이의 외형상 나타나는 특징은?
외부형태학적으로 피막이와 선피막이의 경우 잎 결각과 잎 상부가 사상하는 것을 선피막이, 그렇지 않은 것을 피막이라 구분하였고, 제주피막이와 선피막이의 경우 상록성이 아니지만 피막이의 경우 상록성이라고 알려져 있다(Lee, 1996). 큰피막이의 경우 화경의 길이가 엽병보다 긴 것이 특징이라고 알려져 있다. 이와 같이, 피막이속의 경우 잎의 결각, 화경과 엽병의 길이 차이, 줄기의 사상 차이 등 생식형질이 아닌 영양형질에 주로 의존하고 있는 실정이다.
피막이속이란 무엇인가?
피막이속(Hydrocotyle L.)은 두릅나무과(Araliaceae), 피막이풀아속(Hydrocotyloideae)에 속하는 식물로 아프리카, 아메리카, 아시아, 유럽의 온대 및 아열대 지역을 중심으로 130여종이 분포하고 있다(Linnaeus, 1753). 피막이속은 잎이 작고 비슷한 형태를 나타내고 있으며, 국내외 분류학적 연구가 미비하고, 종에 대한 확실한 정보가 부족하다.
외부형태학적 분류의 한계점을 해결하기 위해 분자적 자료를 이용한 예시는?
최근 외부형태학적 분류의 한계점을 해결하기 위하여 분자적 자료를 이용한다. ITS 지역은 핵 DNA로 양친 유전성(bioparental inheritance)를 가지며 유전자간의 변이성이 높은 편이어서 종간 또는 속간의 유연관계와 진화경향성 및 유전적 변이 양상을 파악하는데 중요한 자료로 이용되어 왔다(Álvarez and Wendel, 2003; Son et al., 2007). 또한 모성유전을 하는 cpDNA의 non-coding 지역은 coding지역보다 빠르게 진화하며 염기치환과 같은 비율로 삽입과 결실이 축적되므로 유용한 자료로 이용되고 있다(Soltis et al., 1992).
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