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문제 정의
- 기존 연구들에서 척수손상 환자의 치료를 위한 방법들에 대한 운동기능 평가와 함께 신경영양성인자나 분자생물학적인 부분의 연구가 진행되고 있으나 선행 연구들의 대한 정리와 함께 이론적 틀을 강화하기 위한 다양한 방법의 연구가 필요하다고 생각된다. 따라서 본 연구에서는 실험적으로 불완전척수손상을 유발시킨 흰쥐에게 맥동전자장의 적용이 운동기능의 회복과 함께 신경의 회복과 관련된 신경영양성인자인 GAP-43의 발현 양상을 분석하여 척수손상 환자들에게 맥동전자장의 적용을 위한 기초과학적 근거를 제공하고자 연구를 실시하였다.
- 본 연구는 흰쥐를 대상으로 회복이 가능한 정도의 불완전 척수손상을 유발시킨 후 운동기능의 회복과 신경 연접 및 가소성과 관련된 단백질의 발현과 분자적 변화를 알아보기 위한 면역조직화학적 검사와 western blot analysis를 실시하여 맥동전자장이 불완전 척수손상 흰쥐의 기능적 회복과 척수 재생에 미치는 영향을 확인하였다.
- 본 연구에서는 이러한 선행 연구들의 결과를 기초로 하여 맥동전자장이 손상된 척수의 회복과 재생에 관여할 것이라는 가정 하에 실험적으로 유발된 불완전 척수손상 흰쥐의 전신에 맥동전자장을 적용한 후 결과를 관찰하였다. 그 결과 운동 기능회복을 알아보기 위해 실시한 족적 검사에서 대조군에 비해 유의한 차이를 나타내었고 특히 손상 초기에는 보행 시에 자발적인 체중 부하가 이루어지지 않고 후지의 바닥 전체를 이용하는 보행을 하게 되는데, 실험군의 경우 대조군에 비해 짧은 기간에서 자발적인 보행 양상의 회복을 나타내었다.
제안 방법
- 0.01 M PBS에 10분간 3회 수세한 다음, 1차 항체에 따라 적합한 2차 항체(goat anti-rabbit IgG, Vector,미국)를 90분간 처리하고 0.01 M PBS로 10분간 3회 수세하였다.
- 1차 항체로 4℃에서 하루 동안 배양한 후, goat anti-rabbit IgG나 goat anti-mouse IgG를 이용해서 표지된 표적물질은 ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, 영국)를 사용하여 확인하였다.
- 3차 항체는 ABC-kit(avidine-biotin peroxidase complex, Vector Lab., 미국)로 60분간 처리한 후 0.01 M PBS로 10분간 3회 수세하고 여과된 DAB (3'5'-diaminobenzidine)에 10분간 처리한후 0.01 M PBS에 10분간 3회 수세하고 증류수에 같은 방법으로 수세하였다.
- GAP-43의 단백질 발현 양상 분석을 위해 준비된 척수 조직에 buffer A (137mM NaCl, 8.1mM Na2HPO4, 2.7mM KCl, 1.5mM KH2PO4, 2.5 mM EDTA, 1mM dithiothreitol, 0.1mM PMSF, 10 μg/ml leupeptin [pH 7.5])를 첨가하고 21.1-gauge 주사기를 이용하여 물리적으로 용해시킨 후 1,000g, 4℃에서10분 동안 원심 분리기를 이용하여 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 담아 세포질 분획으로 이용하였다.
- 25mm의 높이에서 낙하시켰다. 그 후 수술 부위를 봉합하고, 봉합 부위 및 제모 전체 부위를 70%의 에탄올과 포비돈 요오드액(povidone-iodine)을 이용하여 소독하였다. 수술 후 감염의 방지를 위해 겐타마이신(gentamycin sulfate, Korea Thumb vet Co.
- 맥동전자장의 적용 변수는 조직 손상으로 인한 운동과 감각의 재생에 효과적이라고 보고된 주파수 27.12㎒, 맥동빈도 초당 300회, 맥동폭 65 ㎲, 순환주기(duty cycle) 1.95%(박은세, 2006)를 직경 20cm의 도자를 이용하여 5cm 거리에서 적용하였다.
- 맥동전자장의 적용이 흰쥐의 운동기능에 미치는 영향을 검사하기 위하여 족적 검사를 실시하였다(Bervar, 2000). 흰쥐의 족저면에 먹물을 묻힌 후, 바닥에 흰색 종이가 깔린 80cm, 폭 7cm, 높이 10cm의 통로를 통해 걷도록 함으로써 족적을 기록하였다.
- 수술 후 감염의 방지를 위해 겐타마이신(gentamycin sulfate, Korea Thumb vet Co., 한국) 0.02㎖/㎏를 투여한 후 온도조절 장치가 부탁된 가열패드(Heating pad) 위에서 회복시켰다.
- 실험군은 맥동전자장 에너지 치료기인 Diapulse (Diapulse Corp., 미국)를 사용하여 맥동전자장을 적용하였다.
- 실험기간 중 먹이와 물을 무제한 공급하고, 사육실의 온도는 25±2℃, 습도는 60±5%를 유지하며, 사육장의 광주기와 암주기를 각각 12시간으로 조절하였다.
- 실험기간 중 먹이와 물을 무제한 공급하고, 사육실의 온도는 25±2℃, 습도는 60±5%를 유지하며, 사육장의 광주기와 암주기를 각각 12시간으로 조절하였다. 실험에 사용될 흰쥐는 무작위 분류를 통해 척수손상 유발 후 아무런 처치도 적용하지 않은 군(대조군, n=10), 척수손상 유발 후 3주간 맥동전자장을 적용한 군(실험군, n=10)으로 구분하여 실험을 실시하였다.
- 실험적 처치를 마친 각 군의 실험동물들은 졸레틸(Zoletil, Virbac Laboratories)과 럼푼(Rompun, 바이엘코리아)을 1:1의 비율로 혼합한 전신 마취제를 복강주사(2㎖/kg)하여 마취한 후 0.9% NaCl을 이용해 심장 관류를 시키고, 4% paraformaldehyde (pH7.4)를 이용하여 조직 전고정을 실시한 후 뇌와 척수를 적출하였다.
- 95%(박은세, 2006)를 직경 20cm의 도자를 이용하여 5cm 거리에서 적용하였다. 이 때 적용 부위의 움직임을 최소화하기 적합한 플라스틱 케이스에 넣은 후, 하루 20분간 주 5회로 총 3주간 실시하였고, 이 때 대조군도 같은 시간동안 동일한 플라스틱 케이스에 넣어두었다.
- 01 M PBS에 10분간 3회 수세하고 증류수에 같은 방법으로 수세하였다. 이후 탈수(dehydration)와 청명과정을 거쳐 보존을 위해 permanent mounting media를 이용하여 덮개 유리(cover glass)로 봉입하였다.
- 흰쥐의 족저면에 먹물을 묻힌 후, 바닥에 흰색 종이가 깔린 80cm, 폭 7cm, 높이 10cm의 통로를 통해 걷도록 함으로써 족적을 기록하였다. 자발적 체중 부하 정도를 나타내는 길이변수인 PL(print length) 중 뒤꿈치에서 세 번째 발가락까지 거리를 채택하여 분석하였고, 손상 측 후지의 PL과 관련하여 같은 쪽 전지를 정상 측 PL로 하여 양쪽의 PLF 값의 평균을 가지고 평가를 실시하였다. 변수의 기록은 다음과 같은 방법으로 실시하였다.
- 척수손상의 유발을 위하여, 졸레틸(Zoletil, Virbac Laboratories)과 럼푼(rompun, 바이엘코리아)을 1:1의 비율로 섞어 제조한 전신마취제를 복강주사(2㎖/㎏)한 후, 흉추 11번의 위치를 찾아서 3×3cm2 정도의 넓이로 제모하고 외과용 블레이드(blade)를 이용해 4cm 정도로 피부를 절개하였다.
- 맥동전자장의 적용이 흰쥐의 운동기능에 미치는 영향을 검사하기 위하여 족적 검사를 실시하였다(Bervar, 2000). 흰쥐의 족저면에 먹물을 묻힌 후, 바닥에 흰색 종이가 깔린 80cm, 폭 7cm, 높이 10cm의 통로를 통해 걷도록 함으로써 족적을 기록하였다. 자발적 체중 부하 정도를 나타내는 길이변수인 PL(print length) 중 뒤꿈치에서 세 번째 발가락까지 거리를 채택하여 분석하였고, 손상 측 후지의 PL과 관련하여 같은 쪽 전지를 정상 측 PL로 하여 양쪽의 PLF 값의 평균을 가지고 평가를 실시하였다.
대상 데이터
- 척수손상의 유발은 대조군과 실험군 모두 동일한 방법으로 실시하였다. 그리고 동일한 척수 손상이 유발된 대상을 선별하기 위해 손상된 후지의 자발적인 움직임이 나타나지 않고, 통증 유발 시에도 정상 가동범위의 50%이하의 움직임만이 유발되는 대상을 선정하여 실험을 실시하였다.
- 본 연구에서는 동일한 조건에서 사육된 생후 8주, 체중 250~300g의 건강하고 신경학적으로 이상이 없는 성숙한 Sprague-Dawley 계 수컷 흰쥐를 사용하였다. 실험기간 중 먹이와 물을 무제한 공급하고, 사육실의 온도는 25±2℃, 습도는 60±5%를 유지하며, 사육장의 광주기와 암주기를 각각 12시간으로 조절하였다.
데이터처리
- 05로 하였다. 기능적 회복 검사, 면역조직화학적 검사의 통계학적 분석을 위해 반복측정 분산분석(RM-ANOVA)을 실시하였고, 적용 시간에 따른 유의성이 있는 경우 대비검정을 실시하였다.
- 면역조직화학적 검사를 위해 광학현미경(OLYMPUS BX50, Japan)을 사용하여 촬영한 이미지를 개인용 컴퓨터로 전송한 뒤, Image-Pro plus(ver 4.0 for windows; Media cybernetics, USA)를 이용하여 pixel unit으로 산정하여 통계학적 분석을 실시하였다. 그리고 Western blot analysis의 분석에는 정량화된 β-actin과 비교하여 대조군과 실험군에서 GAP-43의 단백질 발현 양상을 분석하였다.
이론/모형
- 1-gauge 주사기를 이용하여 물리적으로 용해시킨 후 1,000g, 4℃에서10분 동안 원심 분리기를 이용하여 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 담아 세포질 분획으로 이용하였다. 모든 분획은 Bradford 방법에 준하여 단백질량을 정량화 하였다(Bradford, 1976). 정량된 시료는 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동을 실시하였고, nitrocellulose (NC) 막에 전이시켰다.
성능/효과
- 본 연구에서는 이러한 선행 연구들의 결과를 기초로 하여 맥동전자장이 손상된 척수의 회복과 재생에 관여할 것이라는 가정 하에 실험적으로 유발된 불완전 척수손상 흰쥐의 전신에 맥동전자장을 적용한 후 결과를 관찰하였다. 그 결과 운동 기능회복을 알아보기 위해 실시한 족적 검사에서 대조군에 비해 유의한 차이를 나타내었고 특히 손상 초기에는 보행 시에 자발적인 체중 부하가 이루어지지 않고 후지의 바닥 전체를 이용하는 보행을 하게 되는데, 실험군의 경우 대조군에 비해 짧은 기간에서 자발적인 보행 양상의 회복을 나타내었다. 이러한 결과는 맥동전자장의 적용이 자발적 체중부하와 운동기능의 향상 및 보행 기능의 회복에 긍정적인 영향을 미친 것으로 생각된다.
- 05). 대비검정을 실시한 결과, 적용 1주 후에 비해 2주 후와 3주 후 모두에서 유의한 차이를 나타내었다.
- 본 연구의 결과에서 맥동전자장의 적용은 신체 기능과 관련하여 운동기능의 회복과 신경영양성인자인 GAP-43의 발현에 긍정적인 변화를 유발하고 이는 척수손상 시 기능적 회복과 신경세포의 재생에 효과적임을 알 수 있었다. 따라서 맥동전자장은 불완전 척수손상 후의 신체 기능의 회복과 신경 재생과 관련된 인자의 발현의 유도에 효과적인 치료 방법임을 인식하고 기존의 환자 치료 프로그램에서 맥동전자장을 이용한 치료의 병행은 불완전 척수손상 환자의 회복에 더욱 효과적인 치료 방안으로 제시될 수 있을 것이라 생각된다.
- 이상의 연구 결과를 통해, 불완전 척수손상은 경증의 손상일 경우 맥동전자장의 적용은 운동기능의 회복과 신경회복 및 재생과 관련된 인자인 GAP-43의 발현에 긍정적인 영향을 나타내는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 맥동전자장의 적용이 불완전 척수손상 후의 신체 기능의 회복과 보행 능력의 향상, 신경 재생과 관련된 인자의 발현을 유도할 수 있고, 맥동전자장을 이용한 체계적이고 환자 개개인에게 맞추어진 치료 프로그램이 개발된다면 불완전 척수손상 환자의 회복에 더욱 효과적인 방안으로 제시될 수 있을 것이라 생각된다.
- 그리고 김종오 등(2006)은 당뇨 합병증의 하나인 당뇨병성 신경병증을 streptozotocin으로 유발시킨 흰쥐에서 저강도 트레드밀 운동을 실시한 후 손상된 신경에서의 GAP-43의 발현과 신경 조직의 현미경적 수준에서의 형태학적 변화 및 손상된 신경이 지배하는 근육에서 당수송체 단백질 발현을 관찰한 결과 트레드밀 운동을 실시한 군에 서 GAP-43의 발현이 시간의 변화와 함께 높게 나타났고, GAP-43의 이러한 발현 증가는 축삭의 재생 및 축삭 주변의 빠른 수초화에 따른 결과라고 보고하였다. 이에 본 연구에서는 불완전 척수손상 후 맥동전자장의 적용이 신경 연접 및 가소성과 관련된 단백질인 GAP-43의 발현에 미치는 영향에 대하여 확인한 결과 GAP-43의 경우, 척수손상 후 1주 기간에서는 대조군, 실험군 사이에 유의한 차이가 나타나지 않았지만, 척수손상 후 2주 기간 이후에서는 대조군에 비해 실험군에서 유의한 증가를 나타내었다.
- 적용 시간에 대한 통계적 유의성 검증에서는 유의한 차이를 나타내었고(p<.05), 각 군에 대한 통계적 유의성 검증에서도 유의한 차이를 나타내었다(p.05).
후속연구
- 본 연구의 결과에서 맥동전자장의 적용은 신체 기능과 관련하여 운동기능의 회복과 신경영양성인자인 GAP-43의 발현에 긍정적인 변화를 유발하고 이는 척수손상 시 기능적 회복과 신경세포의 재생에 효과적임을 알 수 있었다. 따라서 맥동전자장은 불완전 척수손상 후의 신체 기능의 회복과 신경 재생과 관련된 인자의 발현의 유도에 효과적인 치료 방법임을 인식하고 기존의 환자 치료 프로그램에서 맥동전자장을 이용한 치료의 병행은 불완전 척수손상 환자의 회복에 더욱 효과적인 치료 방안으로 제시될 수 있을 것이라 생각된다.
- 이상의 연구 결과를 통해, 불완전 척수손상은 경증의 손상일 경우 맥동전자장의 적용은 운동기능의 회복과 신경회복 및 재생과 관련된 인자인 GAP-43의 발현에 긍정적인 영향을 나타내는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 맥동전자장의 적용이 불완전 척수손상 후의 신체 기능의 회복과 보행 능력의 향상, 신경 재생과 관련된 인자의 발현을 유도할 수 있고, 맥동전자장을 이용한 체계적이고 환자 개개인에게 맞추어진 치료 프로그램이 개발된다면 불완전 척수손상 환자의 회복에 더욱 효과적인 방안으로 제시될 수 있을 것이라 생각된다.
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