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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 아직 연구가 되지 않은 枳實과 枳殼을 cerulein으로 유도한 급성췌장염 모델에서 효과를 알아보기 위해, 생쥐 몸무게에 대한 췌장무게 비율과 조직학적 관찰, 호중구 침윤 정도, 혈청 amylase와 lipase 활성을 조사하고 효능을 비교하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이와 같이 枳實과 枳殼의 胸腹脹滿, 胸痞, 痺痛, 痰積 등의 증상이 현대의학에서 급성췌장염 증상과 유사하므로 췌장염 치료에 효과가 있을 것으로 사료되어 본 실험을 착수하게 되었다.
제안 방법
- Cerulein 최초투여 6 시간 후에 췌장을 절취한 후 pancreas weight/body weight 계산식을 통하여 체중에 대한 췌장의 중량 비율을 측정하였다.
- 대조군은 약물 대신에 생리 식염수를 복강 투여하고 췌장염을 유발시키기 위해 cerulein (50 ㎍/kg)을 1시간 간격으로 6번 복강 투여하였다. Cerulein을 마지막으로 투여하고 나서 6시간 후에 개복하여 혈액과 췌장 및 폐 조직을 채취하였다.
- 枳實과 枳殼 추출물을 각각 급성 췌장염 유발 1시간 전에 복강 투여하였고, 유발군에는 주입 1시간 후 cerulein을 1시간마다 6번 복강 투여하여 급성 췌장염을 유발하였다. 마지막 주사 후 6 시간 뒤에 췌장을 분리하였다.
- 枳實과 枳殼 추출물을 각각 급성 췌장염 유발 1시간 전에 복강 투여하였다. 유발군에는 주입 1시간 후 cerulein을 1시 마다 6번 복강 투여하여 급성 췌장염을 유발하였다.
- . 그러므로 본 실험에서는 췌장조직의 염증뿐만 아니라 폐조직의 염증도 더불어 관찰하였다. 광학현미경으로 관찰한 결과, cerulein으로 유도한 급성췌장염 유발군에서 폐조직에 염증이 발생되어 있음을 알 수 있었다.
- 급성 췌장염을 유발시킨 6시간 후 췌장 중량에 대한 체중 비율 변화를 측정하였다. 대조군(5.
- 췌장염을 유발하기 위해 모든 실험군을 16시간 동안 금식시킨 다음 枳實, 枳殼 추출물을 각각 복강 투여하고 1 시간 후에 cerulein (50 ㎍/kg)을 1시간 간격으로 6번 복강 투여하였다. 대조군은 약물 대신에 생리 식염수를 복강 투여하고 췌장염을 유발시키기 위해 cerulein (50 ㎍/kg)을 1시간 간격으로 6번 복강 투여하였다. Cerulein을 마지막으로 투여하고 나서 6시간 후에 개복하여 혈액과 췌장 및 폐 조직을 채취하였다.
- 마지막 주사 후 6 시간 뒤에 폐를 분리하였으며 H & E 염색을 통해 조직의 손상 및 염증 정도를 관찰하였다.
- . 본 실험에서는 급성췌장염을 유발하기 1시간 전에 枳實과 枳殼 추출물을 각각 복강 투여하였으며, 그 후 cerulin을 1시간 간격으로 6번 투여하여 급성췌장염을 유발하였다. 투여 결과, 枳實투여군은 유의성 있게 췌장의 염증 및 부종을 억제하였으나, 枳殼투여군은 감소하는 경향은 보이나 유의성은 없었다(Fig.
- 본 실험은 cerulein으로 유도한 급성췌장염 모델에서 枳實 과 枳殼의 췌장염 효과를 비교하기 위해서 조직학적 관찰, 췌장의 중량 비율, 혈청 amylase와 lipase의 농도, 호중구 침윤을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- Syringe를 이용하여 심장에서 혈액을 채취했으며 혈액은 3,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 혈청만 분리하였다. 분리한 혈청으로 소화효소인 amylase, lipase를 정량하였다.
- 枳實과 枳殼 추출물을 각각 급성 췌장염 유발 1시간 전에 복강 투여하였고, 유발군에는 주입 1시간 후 cerulein을 1시간마다 6번 복강 투여하여 급성 췌장염을 유발하였다. 마지막 주사 후 6 시간 뒤에 췌장을 분리하였다.
- 이로써 본 연구에서 급성췌장염을 유도하기 전에 생쥐에枳實과 枳殼 추출물을 각각 복강 투여하여 그 효과를 비교 분석하였다.
- 췌장 조직을 적출하고 10% formalin 용액을 사용하여 고정시킨 다음, 일반적인 조직 표본 제작 방법으로 Hematoxylin & Eosin 염색을 시행하였다.
- 췌장과 폐에서의 호중구 침윤(neutrophil infiltration)은 조직의 MPO 활성도를 측정하여 검사하였다. 50 mM phosphate buffer (pH 6.
- 췌장염을 유발하기 위해 모든 실험군을 16시간 동안 금식시킨 다음 枳實, 枳殼 추출물을 각각 복강 투여하고 1 시간 후에 cerulein (50 ㎍/kg)을 1시간 간격으로 6번 복강 투여하였다. 대조군은 약물 대신에 생리 식염수를 복강 투여하고 췌장염을 유발시키기 위해 cerulein (50 ㎍/kg)을 1시간 간격으로 6번 복강 투여하였다.
- 췌장은 포르말린를 이용하여 고정한 후, H & E 염색을 통해 조직의 손상 및 염증 정도를 관찰하였다.
- 췌장 조직을 적출하고 10% formalin 용액을 사용하여 고정시킨 다음, 일반적인 조직 표본 제작 방법으로 Hematoxylin & Eosin 염색을 시행하였다. 카메라 부착 광학현미경(Olympus BX51, Japan)으로 관찰한 후 사진을 촬영하였다.
- 혈청 amylase의 측정은 ADIVA 1650 (BAYER, USA) system 으로 하였고 혈청 lipase의 측정은 Cobas-mira (Rochs, USA) system 으로 하였다.
대상 데이터
- 枳實(PT)과 枳殼(CA)은 Omniherb (영천, 대한민국)에서 구입한 후 원광대학교 한의과대학 본초학교실에서 同定한 후 시료로 사용하였다.
- 모든 실험동물은 원광대학교에서 정해놓은 동물관리규정에 따라 관리되었다. 본 실험에 사용한 C57BL/6 Mouse (체중 15-20g, female)는 오리엔트 바이오 (성남, 경기도)에서 구입하였다. 실험동물은 원광대학교 한의과대학 동물사육실에서 일정한 조건 (온도:21±2℃.
- 실험동물은 원광대학교 한의과대학 동물사육실에서 일정한 조건 (온도:21±2℃. 습도:50~60%. 명암: 12시간 주기)에서 일반 고형사료 (오리엔트 바이오, 성남)와 물을 충분히 공급하면서 환경 적응을 위해 일주일 동안 적응시킨 후 실험하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 Mean ± SE로 표시하였고, 대조군과 실험군의 차이를 검정할 때에는 one way ANOVA로 검정하여 P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- 1. 췌장과 폐를 조직학적으로 측정한 결과, 枳實 투여군은 췌장과 폐의 손상을 유의성 있게 억제한 반면에, 枳殼 투여 군은 유의성 있게 억제하지 못하였다.
- 2. 체중에 대한 췌장 비율에 미치는 영향을 실험한 결과, 급성췌장염 유발군에 비해 枳實 실험군만 유의성 있게 감소하였고, 枳殼 실험군은 감소는 보이나 유의성 있는 결과를 얻지 못하였다.
- 3. 혈중 amylase 와 lipase활성에 미치는 영향을 측정한 결과, 혈중 amylase의 경우에서는 급성췌장염 유발군에 비해 枳實, 枳殼 투여군에서 모두 유의성 있게 감소하였다. 그러나 혈중 lipase는 급성췌장염 유발군에 비해 枳實, 枳殼 투여군에서 감소는 하였으나 유의성은 없었다.
- 4. 호중구 침윤정도 측정에 미치는 영향을 실험한 결과, 췌장 침윤정도에서는 枳實 실험군에서만 유의성 있게 감소하였으나, 폐 침윤정도에서는 枳實, 枳殼 투여군에서 모두 유의성 있게 감소하였다.
- 그러므로 본 실험에서는 췌장조직의 염증뿐만 아니라 폐조직의 염증도 더불어 관찰하였다. 광학현미경으로 관찰한 결과, cerulein으로 유도한 급성췌장염 유발군에서 폐조직에 염증이 발생되어 있음을 알 수 있었다. 실험군인 枳實투여군에서 폐의 염증을 유의성 있게 억제하였으나, 枳殼투여군은 감소하는 경향은 보이나 유의성은 없었다(Fig.
- 위 실험결과를 종합해 보면, 枳實 추출물을 투여한 군에서 급성췌장염 유발군에 비해 췌장 중량/체중 비율, 호중구 침윤, 혈청 내 amylase와 lipase활성 억제 및 췌장과 폐조직 보호효과가 유의한 것으로 나타났다. 반면, 枳殼 추출물을 투여한 군에서는 amylase와 폐 호중구 침윤 억제 및 췌장과 폐조직 보호효과가 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과로 보아 성숙정도에 따라서 효능에 차이를 알 수 있었으며, 향후 췌장염 치료의 기전에 대해서도 심도있는 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- . 본 연구를 통해 枳實과 枳殼 추출물을 복강 투여한 군에서 모두 유발 군에 비해 amylase활성이 유의성 있게 감소하는 것을 알 수 있었다. 그러나 lipase활성은 枳實 추출물만 유의성 있게 감소하였다.
- 마지막 주사 후 6 시간 뒤에 폐를 분리하였으며 H & E 염색을 통해 조직의 손상 및 염증 정도를 관찰하였다. 실험 결과로枳實과 枳殼 추출물을 각각 복강 투여했을시 유발군 보다 모두 통계적으로 유의성 있게 감소하였다(Fig. 2).
- 췌장은 포르말린를 이용하여 고정한 후, H & E 염색을 통해 조직의 손상 및 염증 정도를 관찰하였다. 실험결과로 枳實과 枳殼 추출물을 각각 복강 투여했을시 유발군 보다 모두 통계적으로 유의성 있게 감소하였다(Fig. 1).
- 광학현미경으로 관찰한 결과, cerulein으로 유도한 급성췌장염 유발군에서 폐조직에 염증이 발생되어 있음을 알 수 있었다. 실험군인 枳實투여군에서 폐의 염증을 유의성 있게 억제하였으나, 枳殼투여군은 감소하는 경향은 보이나 유의성은 없었다(Fig. 2). 이는 枳殼보다 枳實 추출물이 급성 췌장염에서 췌장과 폐 조직의 염증과 부종을 감소시켜 조직 손상을 보호하는 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 위 실험결과를 종합해 보면, 枳實 추출물을 투여한 군에서 급성췌장염 유발군에 비해 췌장 중량/체중 비율, 호중구 침윤, 혈청 내 amylase와 lipase활성 억제 및 췌장과 폐조직 보호효과가 유의한 것으로 나타났다. 반면, 枳殼 추출물을 투여한 군에서는 amylase와 폐 호중구 침윤 억제 및 췌장과 폐조직 보호효과가 있음을 알 수 있었다.
- 본 실험에서는 급성췌장염을 유발하기 1시간 전에 枳實과 枳殼 추출물을 각각 복강 투여하였으며, 그 후 cerulin을 1시간 간격으로 6번 투여하여 급성췌장염을 유발하였다. 투여 결과, 枳實투여군은 유의성 있게 췌장의 염증 및 부종을 억제하였으나, 枳殼투여군은 감소하는 경향은 보이나 유의성은 없었다(Fig. 1 and 3).
- 그렇기 때문에 호중구의 침윤정도는 염증의 정도를 측정할 수 있는 중요한 지표가 된다. 호중구 침윤 정도를 측정한 결과, cerulein을 투여한 유발군보다 枳實 투여군에서 췌장과 폐 호중구 침윤 정도가 유의성 있게 감소하였다. 그러나 枳殼투여군은 폐 호중구 침윤만 유의성 있게 감소하였으나, 그 정도가 枳實군에 비하여 적었다.
후속연구
- 반면, 枳殼 추출물을 투여한 군에서는 amylase와 폐 호중구 침윤 억제 및 췌장과 폐조직 보호효과가 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과로 보아 성숙정도에 따라서 효능에 차이를 알 수 있었으며, 향후 췌장염 치료의 기전에 대해서도 심도있는 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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