고온에서 발현이 유도되도록 한 개화촉진유전자 HSpro-FT를 국립원예특작과학원에서 육성된 스프레이타입 국화 2품종('Pink PangPang'과 'Pink Pride')에 도입하여 획득한 형질전환체가 고온기에 화아가 분화하고 고온단일조건에서 화아가 발달하게 되는 조건에서 재배되었을 때 개화가 촉진되었다. HSpro-FT 유전자는 pCAMBIA2300에 삽입되어 Agrobacterium tumefaciens C58C1을 통하여 국화로 도입되었다. 아그로박테리움과의 접종 후 재분화 배지(MS + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IAA + 0.7% plant agar, pH 5.8)에 10 mg/L 과 20 mg/L kanamycin이 첨가된 1, 2차 선발배지에서 재분화된 신초를 선발하였다. PCR분석에 의해 'Pink PangPang'유래 재분화 신초 117개체와 'Pink Pride'유래 5개체로부터 FT 유전자가 도입되었음을 확인하였다. HSpro-FT 유전자 형질전환 26계통중 8계통들이 바형질전환체에 비하여 정식 후 꽃봉오리 맺히기까지의 기간이 1.7~10일 당겨졌고, 24계통들이 비형질전환체에 비하여 꽃봉오리 맺힌 후 꽃잎전개까지의 기간이 1~6일 당겨졌다. 두 품종 유래 형질전환 24계통 모두 조기개화성 이외의 꽃모양이나 꽃 색깔 등 다른 특성은 비형질전환체와 같았다.
고온에서 발현이 유도되도록 한 개화촉진유전자 HSpro-FT를 국립원예특작과학원에서 육성된 스프레이타입 국화 2품종('Pink PangPang'과 'Pink Pride')에 도입하여 획득한 형질전환체가 고온기에 화아가 분화하고 고온단일조건에서 화아가 발달하게 되는 조건에서 재배되었을 때 개화가 촉진되었다. HSpro-FT 유전자는 pCAMBIA2300에 삽입되어 Agrobacterium tumefaciens C58C1을 통하여 국화로 도입되었다. 아그로박테리움과의 접종 후 재분화 배지(MS + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IAA + 0.7% plant agar, pH 5.8)에 10 mg/L 과 20 mg/L kanamycin이 첨가된 1, 2차 선발배지에서 재분화된 신초를 선발하였다. PCR분석에 의해 'Pink PangPang'유래 재분화 신초 117개체와 'Pink Pride'유래 5개체로부터 FT 유전자가 도입되었음을 확인하였다. HSpro-FT 유전자 형질전환 26계통중 8계통들이 바형질전환체에 비하여 정식 후 꽃봉오리 맺히기까지의 기간이 1.7~10일 당겨졌고, 24계통들이 비형질전환체에 비하여 꽃봉오리 맺힌 후 꽃잎전개까지의 기간이 1~6일 당겨졌다. 두 품종 유래 형질전환 24계통 모두 조기개화성 이외의 꽃모양이나 꽃 색깔 등 다른 특성은 비형질전환체와 같았다.
The flowering locus T (FT) gene, of which expression will be controlled at high temperature by heat shock promoter (it printed as to HSproFT), was introduced into spray-type chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum (Ramat.) Kitamura) 2 cultivars ('Pink PangPang' and 'Pink Pride' by co-cultivation wi...
The flowering locus T (FT) gene, of which expression will be controlled at high temperature by heat shock promoter (it printed as to HSproFT), was introduced into spray-type chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum (Ramat.) Kitamura) 2 cultivars ('Pink PangPang' and 'Pink Pride' by co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens strain C58C1 harboring pCAMBIA2300 containing the HSproFT gene. After leaf segments of the 2 cultivars were infected with the A. tumafaciens with C58C1 as explants, shoots were regenerated from the explants cultured on the $1^{st}$ selection medium (MS basal salts + 1.0 mg/L BA, 0.5 mg/L IAA + 10 mg/L kanamycin + 0.7% plant agar, pH 5.8). The shoots were transferred into the $2^{nd}$ selection medium (MS basal salts + 1.0 mg/L BA, 0.5 mg/L IAA + 20 mg/L kanamycin + 0.7% plant agar, pH 5.8). One hundred seventeen plantlets from 'Pink PangPang' and 5 ones from 'Pink Pride' were confirmed as transformants by PCR analysis. Twenty six of the transformants and non-transformants were acclimatized and established well in a green house. Eights of 26 transgenic lines showed flower bud 1.7~10 days earlier than nontransgenic plants, and 24 of them flowered 1~6 days earlier than non- transgenic plants. The shape and color of flower of all HSproFT-transgenic lines were not different with those of non- transgenic plants.
The flowering locus T (FT) gene, of which expression will be controlled at high temperature by heat shock promoter (it printed as to HSproFT), was introduced into spray-type chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum (Ramat.) Kitamura) 2 cultivars ('Pink PangPang' and 'Pink Pride' by co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens strain C58C1 harboring pCAMBIA2300 containing the HSproFT gene. After leaf segments of the 2 cultivars were infected with the A. tumafaciens with C58C1 as explants, shoots were regenerated from the explants cultured on the $1^{st}$ selection medium (MS basal salts + 1.0 mg/L BA, 0.5 mg/L IAA + 10 mg/L kanamycin + 0.7% plant agar, pH 5.8). The shoots were transferred into the $2^{nd}$ selection medium (MS basal salts + 1.0 mg/L BA, 0.5 mg/L IAA + 20 mg/L kanamycin + 0.7% plant agar, pH 5.8). One hundred seventeen plantlets from 'Pink PangPang' and 5 ones from 'Pink Pride' were confirmed as transformants by PCR analysis. Twenty six of the transformants and non-transformants were acclimatized and established well in a green house. Eights of 26 transgenic lines showed flower bud 1.7~10 days earlier than nontransgenic plants, and 24 of them flowered 1~6 days earlier than non- transgenic plants. The shape and color of flower of all HSproFT-transgenic lines were not different with those of non- transgenic plants.
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문제 정의
이에 본 연구는 고온기에 화아가 분화하고 고온단일조건에서 화아가 발달하는 자연조건에서 재배되었을 때 고온에서 발현이 유도되도록 한 FT유전자가 도입되어 조기개화성을 보인 스프레이 국화 형질전환체에 대해 보고 하고자 한다.
제안 방법
npt II 유전자의 도입 확인을 위한 primers로서 forward primer(5' GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG 3')와 reverse primer(5' ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA 3')를 사용하였고, HSpro-FT 유전자의 도입 확인을 위한 primers로서 forward primer(5' GGT TGG TGA CTG ATA TCC 3')와 reverse primer(5' TGC CTG CCA AGC TGT CGA A 3')를 사용하였다.
2%의 활성탄이 첨가된 MS 배지(Murashige & Skoog, 1962)에서 8주 간격으로 계대배양하면서 기내에서 유지한 ‘Pink PangPang’과 ‘Pink Pride’ 모식물체 신초의 제 2~3엽을 엽맥을 중심으로 5 mm 정도의 사각으로 잘라 아그로박테리움 매개 형질전환용 절편체로 사용하였다. HSpro-FT유전자가 삽입된 A. tumefaciens strain C58C1(균농도 O.D6600.8-1.0)에 잎 절편체를 접종 후 재분화 배지(MA + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IAA + 0.7% plant agar, pH 5.8)에서 3일간 암배양하였고, 그 후 1차 선발배지(재분화배지 + 10 mg/L kanamycin + 400 mg/L cefotaxime)에서 6주 배양, 2차 선발배지(재분화배지 + 20 mg/L kanamycin + 400 mg/L cefotaxime)에서 5주 배양하였다. 2차 선발배지에서 생존한 신초는 20 mg/L kanamycin과 400 mg/L cefotaxime 이 첨가된 MS 배지에서 발근시킨 후 2 g/L의 activated charcol이 첨가된 MS 배지에서 유지하였다.
2차 선발배지에서 선발된 putative HSpro-FT형질전환체와 대조구 식물체(비형질전환체)의 잎으로부터 genomic DNA를 QIAGEN사의 DNeasy plant mini kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 제조회사의 지침에 따라 추출하였다. npt II 유전자의 도입 확인을 위한 primers로서 forward primer(5' GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG 3')와 reverse primer(5' ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA 3')를 사용하였고, HSpro-FT 유전자의 도입 확인을 위한 primers로서 forward primer(5' GGT TGG TGA CTG ATA TCC 3')와 reverse primer(5' TGC CTG CCA AGC TGT CGA A 3')를 사용하였다.
2009), HSpro-FT유전자의 PCR 반응조건은 다음과 같이 수행하였다. Predenaturation 단계는 95℃에서 2분간, denaturation 단계는 95℃에서 1분간, annealing 단계는 56℃에서 2분간, polymerization 단계는 72℃에서 1분간(30 cycles), 그리고 extention 단계는 72℃에서 5분간으로 GeneAmp PCR System 9700(Perkin Elmer Applied Biosystem)을 이용하여 수행하였다.
순화용토는 펄라이트(삼손, 규격1호)와 바이오상토 1호(흥농)를 2:1로 혼용된 인공용토를 사용하였으며, 3주간 순화 후 격리온실 포장에 2011년 7월 19일에 정식하였다. 온실에 정식 후 단일처리하지 않은 자연조건재배로 개화시킨 후 꽃 모양 및 색깔, 초장, 발뇌일, 개화일 등을 조사하였다.
HSpro-FT 유전자는 pCAMBIA2300에 삽입되어 Agrobacterium tumefaciens C58C1을 통하여 국화로 도입되었다. 아그로박테리움과의 접종 후 재분화 배지(MS + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IAA + 0.7% plant agar, pH 5.8)에 10 mg/L 과 20 mg/L kanamycin이 첨가된 1, 2차 선발배지에서 재분화된 신초를 선발하였다. PCR분석에 의해 ‘Pink PangPang’유래 재분화 신초 117개체와 ‘Pink Pride’유래 5개체로부터 FT 유전자가 도입되었음을 확인하였다.
대상 데이터
이전의 연구(Han et al. 2009b)결과, 식물체 재분화율이 높은 국립원예특작과학원 육성 스프레이 타입 국화(Dendranthema grandiflorum(Ramat.) Kitamura) 품종‘Pink PangPang’과 ‘Pink Pride’를 재료로서 사용하였다.
2%의 활성탄이 첨가된 MS 배지(Murashige & Skoog, 1962)에서 8주 간격으로 계대배양하면서 기내에서 유지한 ‘Pink PangPang’과 ‘Pink Pride’ 모식물체 신초의 제 2~3엽을 엽맥을 중심으로 5 mm 정도의 사각으로 잘라 아그로박테리움 매개 형질전환용 절편체로 사용하였다.
Heat shock promoter에 의해 고온에서 발현이 유도되도록한 FT 유전자(이하 HSpro-FT라 칭함)를 서울대학교로부터 분양받아 binary vector pCAMBIA 2300(CAMBIA, Australia, http://www.cambia.org)에 삽입하였다. pCAMBIA 2300 vector 내에는 선발 marker로서 neomycin phosphotransferase(npt II) 유전자가 포함되어 있으며, freeze-thaw 방법(Ahn et al.
PCR 분석 결과, HSpro-FT 유전자의 삽입이 확인된 개체와 대조구(비형질전환체)를 기내에서 계통별로 5~6개씩 증식한 다음, 그 중 5개를 순화하였다. 순화용토는 펄라이트(삼손, 규격1호)와 바이오상토 1호(흥농)를 2:1로 혼용된 인공용토를 사용하였으며, 3주간 순화 후 격리온실 포장에 2011년 7월 19일에 정식하였다. 온실에 정식 후 단일처리하지 않은 자연조건재배로 개화시킨 후 꽃 모양 및 색깔, 초장, 발뇌일, 개화일 등을 조사하였다.
아그로박테리움 매개로 국립원예특작과학원에서 육성 스프레이타입 품종 ‘Pink PangPang’ 1,393개와 ‘Pink Pride’ 1,386개 잎 절편체를 HSpro-FT 유전자가 삽입된 균주와 공동배양 후 1, 2차 선발을 거쳐 ‘Pink PangPang’유래 143개의 재분화 신초와 ‘Pink Pride’유래 6개의 재분화 신초를 획득하였다.
이론/모형
org)에 삽입하였다. pCAMBIA 2300 vector 내에는 선발 marker로서 neomycin phosphotransferase(npt II) 유전자가 포함되어 있으며, freeze-thaw 방법(Ahn et al. 1988)으로 A. tumefaciens strain C58C1에 삽입하였다(Fig. 1).
성능/효과
PCR 분석 결과, HSpro-FT 유전자의 삽입이 확인된 개체와 대조구(비형질전환체)를 기내에서 계통별로 5~6개씩 증식한 다음, 그 중 5개를 순화하였다. 순화용토는 펄라이트(삼손, 규격1호)와 바이오상토 1호(흥농)를 2:1로 혼용된 인공용토를 사용하였으며, 3주간 순화 후 격리온실 포장에 2011년 7월 19일에 정식하였다.
프로모터에 의해 고온에서 발현되도록 한 HSpro-FT 유전자가 도입된 스프레이 국화 품종(‘Pink PangPang’과 ‘Pink Pride’)을 고온에서 화아분화기를 지나 단일조건에서 개화하는 조건에서 재배한 결과 조기개화성이 확인되었다.
정식후 개화까지의 소요기간은 ‘Pink PangPang’유래 형질전환체의 경우 22계통 중 8계통(HS5, HS11, HS13, HS17, HS26, HS32, HS39, HS40)이 비형질전환체보다 1.7~10일 짧았고, ‘Pink Pride’유래 형질전환체들은 비형질전환체 보다 4~5일 짧았다.
HSpro-FT 유전자 도입이 확인된 ‘Pink PangPang’ 유래 117개체 중 22개체와 ‘Pink Pride’유래 4개체를 기내에서 계통별로 증식 후 5~6개씩 순화 후 온실에 정식하여 자연상태에서 개화 특성을 조사한 결과, 정식 후 꽃봉오리 맺히기까지의 소요기간은 ‘Pink PangPang’유래 형질전환체의 경우 22계통 중 6계통(HS11, HS13, HS26, HS32, HS39, HS40)이 비형질전환체보다 당겨졌으나, ‘Pink Pride’유래 형질전환체들은 비형질전환체보다 당겨지지 않았다.
재분화 신초로부터 DNA를 추출하여 PCR분석을 실시한 결과, ‘Pink PangPang’유래 143개 재분화 신초 중 123개체와 ‘Pink Pride’유래 재분화 신초 6개체에서 npt Ⅱ 유전자의 도입을 확인할 수 있었고, ‘Pink PangPang’유래 117개의 신초와 ‘Pink Pride’유래 재분화 5개 신초에서 목표유전자인 FT 유전자의 도입을 확인할 수 있었다(Table 1, Fig. 2).
3%로 유사하였다. 형질전환에 적합한 품종 선발의 기본조건은 높은 재분화율이지만, 재분화율이 높다고 해서 유전자도입 개체 획득율이 높은 것은 아니라는 것이 본 연구를 통해 확인되었다. 본 연구팀의 이전 연구결과에 의하면(Han et al.
꽃봉오리가 맺힌 다음부터 개화까지의 기간은 ‘Pink PangPang’유래 형질전환체의 경우 22계통 중 2계통(HS13과 HS4)을 제외한 20계통이 비형질전환체 보다 1~6일 짧았으며, ‘Pink Pride’유래 형질전환체들은 비형질전환체보다 3~4일 짧았다(Table 2). 두 품종 유래 형질전환 24계통 모두 개화시점 이외의 꽃모양이나 꽃 색깔 등 다른 특성은 비형질전환체와 같았다(Fig. 2). 이들 조기개화성 HSpro-FT 국화 형질전환 24계통들은 PCR분석에 의해 유전자의 도입이 확인된 식물체들로 서던분석을 통해 HSpro-FT 유전자의 도입에 대한 재확인이 필요하겠지만, 본 연구팀에 의해 2009년도에 개발된 MdMADS2 형질전환 국화의 경우 PCR분석에 의해 유전자의 도입이 확인된 후 조기개화성을 보인 6계통들을 서던분석한 결과, 6계통 모두 MdMADS2유전자의 도입이 확인되었던 것을 고려해 볼 때(Han et al.
PCR분석에 의해 ‘Pink PangPang’유래 재분화 신초 117개체와 ‘Pink Pride’유래 5개체로부터 FT 유전자가 도입되었음을 확인하였다.
2012). 본 연구에서도 프로모터에 의해 고온에서 발현이 유도되도록 한 HSpro-FT 유전자를 스프레이타입 2품종에 도입하여 얻어진 형질전환체들을 고온에서 화아 분화기를 지나 단일조건에서 개화하는 조건에서 재배하였을 때 꽃봉오리 형성까지는 물론 꽃봉오리 형성부터 꽃잎 전개까지의 기간이 단축되는 것을 확인할 수 있었다. FT 유전자가 꽃봉오리형성까지의 기간을 단축시키는데 관여한다는 연구는 Eucalyptus globulus(Jones et al.
7~10일 당겨졌고, 24계통들이 비형질전환체에 비하여 꽃봉오리 맺힌 후 꽃잎전개까지의 기간이 1~6일 당겨졌다. 두 품종 유래 형질전환 24계통 모두 조기개화성 이외의 꽃모양이나 꽃 색깔 등 다른 특성은 비형질전환체와 같았다.
후속연구
2). 이들 조기개화성 HSpro-FT 국화 형질전환 24계통들은 PCR분석에 의해 유전자의 도입이 확인된 식물체들로 서던분석을 통해 HSpro-FT 유전자의 도입에 대한 재확인이 필요하겠지만, 본 연구팀에 의해 2009년도에 개발된 MdMADS2 형질전환 국화의 경우 PCR분석에 의해 유전자의 도입이 확인된 후 조기개화성을 보인 6계통들을 서던분석한 결과, 6계통 모두 MdMADS2유전자의 도입이 확인되었던 것을 고려해 볼 때(Han et al. 2009a), 향후 서던분석에서도 HSpro-FT 유전자 도입이 반드시 재확인될 것이라 생각된다.
com), 그 동안 콩, 벼, 옥수수 등 주곡작물에서 주요 육종기술로 이용되었던 형질전환 기술은 화훼작물 품종 개발의 주요 기술로 제시되고 있다. 최근에는 FT유전자를 용담에 도입하여 조기개화성 형질전환체를 개발했다는 보고(Nakatsuka et al. 2009)도 있는 바, 본 연구를 통하여 획득된 HSproFT국화 형질전환 계통들은 현미경적 관찰과 도입 유전자 발현 및 주변 염기서열 분석 등과 같은 분자생물학적 실험이 보완된다면 조기개화 국화 품종을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이라 생각한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
이 논문에서 FT유전자가 단일과 고온 조건하에서 재배되는 작물의 개화도 촉진한다는 연구에 사용된 형질전환 품종은?
2012). 프로모터에 의해 고온에서 발현되도록 한 HSpro-FT 유전자가 도입된 스프레이 국화 품종(‘Pink PangPang’과 ‘Pink Pride’)을 고온에서 화아분화기를 지나 단일조건에서 개화하는 조건에서 재배한 결과 조기개화성이 확인되었다. 아그로박테리움 매개로 국립원예특작과학원에서 육성 스프레이타입 품종 ‘Pink PangPang’ 1,393개와 ‘Pink Pride’ 1,386개 잎 절편체를 HSpro-FT 유전자가 삽입된 균주와 공동배양 후 1, 2차 선발을 거쳐 ‘Pink PangPang’유래 143개의 재분화 신초와 ‘Pink Pride’유래 6개의 재분화 신초를 획득하였다.
조기개화성의 특징으로 볼때 그 장점은?
조기개화성은 년중 재배횟수를 증가시키고 온실이용의 효율성을 높여 농가소득을 증대시킬 수 있는 특성으로 주요 절화류인 국화 신품종 육성을 위한 중요한 육종 목표의 하나이다. 교잡육종 기술을 이용하는 육종가들의 부단한 노력으로 최근 스프레이 국화의 경우 단일처리 후 개화까지의 소요기간이 종전보다 짧은 품종들이 개발되기도 했지만, 형질전환 기술이 품종 개발을 위한 육종 기술로 자리잡은 1990년대 후반부터 leafy, AP1 등 개화관련 유전자 및 지베렐린 합성 관련 유전자 gai의 도입을 통하여 조기개화성 국화 형질전환체를 얻고자 하는 노력들이 있었다(Han et al.
조기개화성 형질전환체를 획득하는데 어떤 유전자를 도입하려고 하나요?
1999년 개화호르몬 플로리진의 주요 구성성분 단백질인 flowering locus T(FT) 조절 유전자 FT가 장일식물인 애기장대의 개화를 촉진한다고 보고(Kardailsky et al. 1999) 된 이후에는 FT유전자를 도입하여 조기개화성 형질전환체를 획득하고자 하는 연구로 이어지고 있다. 또한, FT 유사 기능 유전자 PtFT1, CiFT, Hd3a, SFT 등이 포플라, 감귤류, 벼, 토마토 등의 작물로부터 분리되기도 하였다(Nakatsuka et al.
참고문헌 (12)
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Han BH, Yae BW, Yi SY, Lee SY, Shin HK (2003) Introduction of LEAFY gene to Chrysanthemum (Dendranthema x grandiflorum (Ramat.) Kitamura) 'Shuho-no-chikara' mediated by Agrobacterium LBA4404 J Plant Biotech 30:335-339
Han BH, Lee SY, Choi SY (2009a) MdMADS2-transgenic chrysanthemum (Dendranthema x grandiflorum (Ramat.) Kitamura) showing the reduction of the days to flowering. J Plant Biotech 36:366-372
Han BH, Lee SY, Park BM (2009b) Comparison of chrtsanthemum cultivars based on direct shoot regeneration rates in tissue culture. J Plant Biotech 36:275-280
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Nakatsuka T, Abe Y, Kakizaki Y, Kubota A, Shimada N, Nishihara M (2009) Over-expression of arabidopsis FTgene reduces juvenile phase and induces early flowering in ornamental gentian plants. Euphytica 168:113-119
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